一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

视网膜色素上皮细胞（RPE）位于感光细胞与脉络膜之间。RPE功能障碍在年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和视网膜色素变性等疾病的发生机制中具有重要意义。使用原代RPE细胞是深入理解疾病发展过程的关键研究手段。

尽管已有多种物种被用作原代视网膜色素上皮（RPE）细胞的来源，但小鼠的优势在于可通过基因操作来帮助理解视网膜病变的发展机制。以往从啮齿类动物分离原代RPE细胞的方法，或需使用新生动物，或耗时较长，或需要较高的技术经验，或不适合细胞培养。本文介绍一种简单快速的方法，可从成年小鼠中分离原代RPE细胞，获得高纯度的细胞培养物。

首先，通过在Hank's平衡盐溶液中添加10毫摩尔的HEPES缓冲液来配制洗涤缓冲液。将缓冲液保存在4摄氏度，直至使用。在DMEM中配制视网膜色素上皮（RPE）培养基，并在水浴中预热至37摄氏度。

将已处死的小鼠侧卧平放，使眼睛朝上。将食指置于眼睛上方，拇指置于下方。轻轻按压眼睛周围的骨结构，使眼球突出。

将略微张开的剪刀尖端插入眼球下方，轻轻向外旋转手腕90度，直至眼球从眼窝中脱离。立即把眼球放入70%乙醇中滚动5秒。然后将眼球转移至置于冰上的洗涤缓冲液中。

在解剖显微镜下，将眼球置于盛有洗涤缓冲液和浸湿纱布条的培养皿中。用镊子夹住视神经以固定眼球，使用手术刀在锯齿缘水平轻轻做一切口。将威尼斯剪插入切口，沿锯齿缘周向剪开，直至去除前节和玻璃体。

使用带绳镊子轻轻将视网膜从眼球杯上剥离，注意不要破坏RPE层。借助剪刀去除眼球杯上的视神经及多余结缔组织，注意不要刺破眼球杯。将眼球杯转移至含有1毫升0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的1.5毫升微量离心管中。

将眼杯置于37摄氏度水浴中孵育10分钟。每2分钟取出管子，在台面上用力敲击管底40次。孵育结束后，使用AP 1000移液器轻轻上下吹打3次，以分散眼杯。

为了中和胰蛋白酶，立即将脱离的视网膜色素上皮（RPE）细胞片（不包括眼杯）层叠至含有0.5毫升胎牛血清（FBS）的15毫升锥形管中。然后逐滴加入RPE培养基至FBS和RPE细胞片的各层中，以稀释胰蛋白酶。在340 ×g 条件下离心3分钟。

弃去上清液，并用适量RPE培养基重悬细胞，用于24孔板。将RPE细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三天。RPE分离后24小时，可见有核色素细胞开始沉降，但尚未完全贴壁。

在 48 至 72 小时内，这些细胞贴壁并伸展，透明的细胞核中仍保留深色色素沉着。培养五天后，RPE 细胞融合度增加，开始形成细胞间连接，逐渐排列成具有六边形结构的极化单层。培养六天后，分离的 RPE 细胞表现出纯度，由 RPE 特异性标志物和紧密连接完整性的证据所证实。