Name: 小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备和用于流式细胞术分析的细胞内分子染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液并进行流式细胞术细胞内分子染色的完整实验方案。该方法有助于深入理解T细胞发育与选择的分子机制，为免疫学研究提供重要技术支持。

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感谢大崎泉博士对文稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所和癌症研究中心的院内研究计划项目 ZIA BC 011806 资助。

所有小鼠实验均在国家癌症研究所动物护理和使用委员会（ASP21-431、ASP21-432 和 EIB-076-3）的批准下进行。
1. 胸腺细胞悬液的制备
注意：小鼠的个体发育会影响从胸腺中酶解分离胸腺上皮细胞（TEC）的效率。以下根据小鼠年龄描述了三种方法。
<ol>
	<li>适用于出生后超过3周的小鼠
	<ol>
		<li>从小鼠体内取出胸腺（两个胸腺叶），置于盛有5 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基的60 mm塑料培养皿中，冰上放置。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用弯头精细镊子去除血液、非胸腺组织和脂肪。用解剖剪将胸腺剪成小块（大小约1-2 mm）。</li>
		<li>将胸腺组织块转移至含有3 mL RPMI1640培养基的15 mL锥形管中，培养基中含1 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase，并含2%胎牛血清（FBS）。在37 °C水浴或加热块中孵育20分钟。</li>
		<li>用3 mL塑料移液管轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育20分钟。</li>
		<li>用3 mL塑料移液管轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育10分钟。</li>
		<li>用3 mL塑料移液管轻轻混匀，加入5 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。</li>
		<li>将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至新的50 mL锥形管中。在4 °C下以350 × g离心5分钟。</li>
		<li>用10 mL FACS缓冲液（含1%牛血清白蛋白[BSA]和0.1% NaN3的1x HBSS）重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>适用于出生后1至2周的小鼠
	<ol>
		<li>执行步骤1.1.1。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用解剖镊去除血液和非胸腺组织。将胸腺转移至含有200 µL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基的1.5 mL塑料离心管中，并用解剖剪将胸腺剪成小块（大小约1-2 mm）。</li>
		<li>让胸腺碎片沉降至管底，然后用200 µL移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>将胸腺组织块转移至含有2 mL RPMI1640培养基的5 mL聚丙烯圆底管中，培养基中含0.5 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase，并含2% FBS。在37 °C水浴或加热块中孵育10分钟。</li>
		<li>用3 mL塑料移液管轻轻混匀，再使用带塑料吸头的1 mL移液器进一步均质化。</li>
		<li>加入2 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至50 mL锥形管中。加入16 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基。</li>
		<li>在4 °C下以350 × g离心5分钟。用10 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>适用于胚胎期小鼠及出生后1周内的新生小鼠
	<ol>
		<li>从小鼠体内取出胸腺（两个胸腺叶），置于60 mm塑料培养皿中，在解剖显微镜下使用弯头精细镊子去除血液、非胸腺组织和脂肪。</li>
		<li>将胸腺置于含10 mM HEPES的RPMI1640培养基0.2&#160;mL中，放入1.5 mL微量离心管。用200 µL移液器弃去液体。</li>
		<li>加入0.5 mL含2% FBS的RPMI1640培养基，其中含0.5 mg/mL胶原酶/分散酶和1 U/mL DNase。在37 °C水浴或加热块中孵育10分钟。使用带塑料吸头的1 mL移液器轻轻混匀。</li>
		<li>加入0.5 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至新的15 mL锥形管中。加入9 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基。</li>
		<li>在4 °C下以350 × g离心5分钟。用1-3 mL FACS缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>替代方法：Liberase消化法
	<ol>
		<li>执行步骤1.1.1和1.1.2。</li>
		<li>让胸腺碎片沉降至管底，然后用200 µL移液器小心吸除上清液。将胸腺组织块转移至含有1 mL RPMI1640培养基的5 mL管中，培养基中含0.5 U/mL Liberase和1 U/mL DNase，并含10 mM HEPES。在37 °C水浴或加热块中孵育15分钟。</li>
		<li>使用带塑料吸头的1 mL移液器轻轻混匀。若组织碎片仍可见，则继续孵育15分钟。</li>
		<li>使用带塑料吸头的1 mL移液器轻轻混匀，加入1 mL含1% FBS的1x HBSS中的5 mM EDTA溶液。</li>
		<li>将细胞悬液通过60 µm尼龙滤网过滤至新的50&#160;mL锥形管中。加入18 mL含10 mM HEPES的RPMI1640培养基。</li>
		<li>在4 °C下以350 × g离心5分钟。用10 mL FACS缓冲液（含1% BSA和0.1% NaN3的1x HBSS）重悬细胞。</li>
		<li>将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胸腺细胞的抗体染色
<ol>
	<li>将 16 × 106 个细胞置于 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>在 FACS 缓冲液中加入 10 µL 工作浓度的抗 Fc 受体单克隆抗体（mAb，克隆号 2.4G2），以阻断染色用 IgG 与细胞表面 Fc 受体的非特异性结合。在 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 FACS 缓冲液中分别加入 40 µL 工作浓度的抗 CD45 mAb（造血细胞特异性；例如 BV421 标记）、抗 EpCAM mAb（上皮细胞特异性；例如 PE-Cy7 标记）、抗 Ly51 mAb（cTEC 检测用；例如 AF647 标记）以及荆豆凝集素 I（UEA-1，mTEC 检测用；例如 AF594 标记）。同时，准备单色染色细胞和未染色细胞的对照管，用于流式细胞仪的设置。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育 45 分钟，每 10 分钟充分混匀一次。加入 2 mL FACS 缓冲液。</li>
	<li>在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 µL Ghost Dye Violet 510（用于在固定和通透细胞的流式细胞分析中区分活细胞与死细胞）。使用未稀释的 Ghost Dye 试剂，充分混匀。在 4 °C 下孵育 30 分钟，每 10 分钟混匀一次。</li>
	<li>加入 2 mL FACS 缓冲液。在 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 mL 含 2% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 固定细胞，并在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>向管中加入 3.5 mL PBS，在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 mL 细胞内固定/通透缓冲液，于 4 °C 下孵育 20 分钟，以通透细胞。</li>
	<li>在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 mL 1× 通透缓冲液。在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>在 1× 通透缓冲液中加入 100 µL 工作浓度的抗 beta5t 抗体或抗 CCL21 抗体，或 40 µL 工作浓度的抗 Aire 抗体（例如 AF488 标记），充分混匀后在室温下孵育 60 分钟。</li>
	<li>加入 1 mL 1× 通透缓冲液。在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 2.14。</li>
	<li>加入 100 µL 工作浓度的抗兔 IgG 抗体（例如 AF555 标记），在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 1 mL 1× 通透缓冲液。在 4 °C 下以 700 × g 离心 8 分钟。弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于 200 µL FACS 缓冲液中，充分混匀。</li>
	<li>将细胞避光保存于 4 °C，直至进行流式细胞分析。</li>
	<li>在进行流式细胞分析前，通过 60 µm 尼龙滤网过滤细胞。</li>
</ol>

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

<ol><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+diversity+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of diversity in thymic epithelial cells.</a> Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).</li>
<li>Hozumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+indispensable+in+thymic+environment+specific+for+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development.</a> J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).</li>
<li>Koch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+the+essential%2C+nonredundant+ligand+for+Notch1+during+thymic+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment.</a> J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).</li>
<li>Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+thymic+cortical+epithelial+cells+expressing+the+thymoproteasome+subunit+%CE%B25t%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t.</a> Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).</li>
<li>Gommeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+regulates+positive+selection+of+a+subset+of+CD4%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).</li>
<li>Viret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+contributes+to+the+diversification+of+the+functional+endogenous+CD4+T+cell+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire.</a> J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire.</a> Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+orchestrates+a+thymic+program+of+self-antigen+expression+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance.</a> Cell. 163 (4), 975-987 (2015).</li>
<li>Takaba, H., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+T+cell+selection+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of T cell selection in the thymus.</a> Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).</li>
<li>Lammers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehf+and+Fezf2+regulate+late+medullary+thymic+epithelial+cell+and+thymic+tuft+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development.</a> Front Immunol. 14, 1277365(2024).</li>
<li>Ushio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+diverse+thymic+medullary+epithelial+cells+interplay+to+direct+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance.</a> Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).</li>
<li>Kozai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+CCL21+in+establishment+of+central+self-tolerance+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells.</a> J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).</li>
<li>Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+%CE%B2+receptor+regulates+the+development+of+CCL21-expressing+subset+of+postnatal+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells.</a> J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).</li>
<li>Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularity+of+thymic+epithelial+cells+in+the+postnatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse.</a> J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).</li>
<li>Hirakawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+parameters+of+the+developing+thymic+epithelium+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse.</a> Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).</li>
<li>Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+epithelial+cell+morphology+control+thymic+organ+size+during+atrophy+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration.</a> Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+%CE%B1+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).</li>
<li>Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+thymic+cortical+epithelial+cells+developmentally+regulate+the+expression+of+a+B-lineage+transformation-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen.</a> Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).</li>
<li>Farr, A. G., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+fucose-specific+lectins+bind+medullary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells.</a> J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).</li>
<li>Wells, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transient+ablation+and+single-cell+RNA-sequencing+reveals+the+development+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells.</a> eLife. 9, e60188(2020).</li>
<li>Hubert, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+anti-Aire+antibody+reveals+aire+expression+is+restricted+to+medullary+thymic+epithelial+cells+and+not+expressed+in+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery.</a> J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).</li>
<li>Nishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lineage+tracing+of+Aire-expressing+cells+reveals+a+requirement+for+Aire+in+their+maturation+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program.</a> J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).</li>
<li>Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR+alpha-expressing+mesenchyme+regulates+thymus+growth+and+the+availability+of+intrathymic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches.</a> Blood. 109 (3), 954-960 (2007).</li>
<li>Cosway, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+thymus+medulla+specialization+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Redefining thymus medulla specialization for central tolerance.</a> J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).</li>
<li>Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+thymic+epithelium+and+an+improved+method+for+its+propagation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro.</a> Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ohigashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+conversion+of+thymocyte-attracting+cells+into+self-antigen-displaying+cells+in+embryonic+thymus+medulla+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium.</a> eLife. 12, RP92552(2024).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

胶原酶（可联合或不联合中性蛋白酶Dispase）被广泛用于消化小鼠胸腺以制备胸腺上皮细胞（TECs）4,5,9,18,21。Liberase是一种包含胶原酶等多种蛋白酶的混合酶制剂，也常用于胸腺消化以制备TECs17,22。使用胶原酶与Liberase从小鼠胸腺中获得的皮质型胸腺上皮细胞（cTECs）和髓质型胸腺上皮细胞（mTECs）在产量和质量上基本相当，尽管不同批次的酶产品可能导致细微差异。胰蛋白酶也可用于高效消化胸腺21,23，但已有研究表明，TECs表达的多种细胞表面分子（如EpCAM和CD80）易受胰蛋白酶降解21。在胸腺的酶消化过程中，通常添加DNase以降解受损细胞释放的DNA，从而降低组织悬液的黏度17,21。
胸腺的酶消化对于从胸腺中释放胸腺上皮细胞（TEC）至关重要。胸腺应被充分消化，直至组织碎片不可见，细胞悬液呈现均一状态。然而，消化时间不宜过长，因为过度的酶处理会损伤细胞，降低细胞活力。在每次实验中，都必须仔细控制胸腺消化过程中的孵育时间以及吹打力度。还需注意的是，如引言部分所述及先前报道所指出，目前的酶消化技术仅能释放出少量的TEC17,18,19。
由于胸腺上皮细胞（TEC）在总胸腺细胞悬液中较为稀少，因此使用总胸腺细胞悬液进行TEC的流式细胞术分析时，需要染色大量细胞，通常每次检测需8 × 106 至 16 × 106 个细胞。
通过酶消化胸腺细胞获得的胸腺上皮细胞（TEC）可利用抗CD45磁珠22 和/或Percoll密度梯度离心法31进行富集。这些富集步骤尤其在后续通过流式细胞分选仪纯化TEC时可节省时间。还应注意，抗CD45富集会去除一部分与表达CD45的胸腺细胞紧密相关的TEC亚群20，而Percoll离心可能意外去除密度较高的TEC亚群。
关于胸腺上皮细胞（TECs）的固定，已知多聚甲醛（PFA）处理会导致细胞收缩，并降低流式细胞术分析中的前向散射光强度。在加入2% PFA后立即轻柔吹打细胞，随后加入磷酸盐缓冲液（PBS），可能有助于防止细胞过度收缩。
在进行流式细胞术分析时，由于胸腺上皮细胞（TECs）在胸腺中出现频率较低，因此其鉴定需要采用与胸腺细胞或脾细胞不同的策略。初步分类基于使用CD45这一造血系统广谱标记物，该标记物普遍表达于胸腺细胞及其他造血细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）表面。相反，TECs起源于非造血组织，不表达CD45。然而，TECs在其表面表达EpCAM，因此可通过CD45阴性且EpCAM阳性的设门策略明确区分TECs。在我们的流式细胞术分析中，首先定义该细胞群，随后根据TECs与胸腺细胞之间显著的体积差异，以及TECs本身较大的尺寸和较高的自发荧光特性，合理调整前向散射光和侧向散射光参数的显示比例。
随后，将注意力集中于CD45阴性EPCAM阳性群体中cTEC和mTEC标志物的评估。由于该群体数量极小，此步骤对于区分cTEC和mTEC至关重要。检测完整染色面板（例如cTEC标志物Ly51和mTEC标志物UEA-1，以及用于定义TEC的CD45和EpCAM）可进一步确保散射参数设置的适当性。在流式细胞术设置过程中，我们的主要目标是明确每种抗体的阳性与阴性细胞群。
在Aire、beta5t和CCL21的共染色中，可识别胸腺上皮细胞（TEC）亚群中的不同细胞群体。由于Aire由髓质胸腺上皮细胞（mTEC）选择性表达，我们重点关注CD45阴性/EPCAM阳性/UEA-1阳性/Ly51阴性细胞的四色染色。此处利用UEA-1阳性细胞建立Aire的阴性对照，以清晰识别Aire阳性细胞。对于在mTECs中表达的CCL21，也采用类似方法。相反，对于仅由皮质胸腺上皮细胞（cTEC）表达的beta5t，则采用类似的设门策略，重点关注四色染色中的Ly51阳性细胞，以确定beta5t的背景水平。随后对经抗-beta5t抗体染色的样本进行分析，可识别出阳性细胞群。
抗beta5t抗体和抗CCL21抗体均为兔源抗体，因此在未进行荧光标记前不应混合使用。抗体的工作浓度应通过流式细胞术分析经抗体梯度稀释染色的对照细胞（例如来自野生型和基因敲除小鼠的胸腺上皮细胞）来预先确定。
在流式细胞术分析中，皮质型胸腺上皮细胞（cTEC）和髓质型胸腺上皮细胞（mTEC）通常根据细胞表面标志物来定义：cTEC表达Ly51或CD205，而mTEC表达UEA1和CD80。然而，需要注意的是，cTEC和mTEC最终必须依据其在胸腺中的微解剖定位来定义。在胚胎期胸腺中，越来越多的证据表明，Ly51和CD205的表达不仅限于cTEC，还存在于其他胸腺上皮细胞群体中，包括cTEC/mTEC双潜能前体细胞和未成熟的mTEC32,33。此外，如图1和图2所示，cTEC中Ly51的表达在胚胎发育期和围产期均低于出生后时期33。
综上所述，尽管胸腺上皮细胞（TEC）的酶解分离效率有限，但对酶解获得的单细胞悬液进行流式细胞术分析，仍是一种在单细胞水平上对TEC及其亚群进行定量分析的有力技术。特别是对单细胞TEC悬液中细胞内分子的流式细胞术分析，有助于研究多种对TEC及其亚群的发育和功能具有重要意义的分子的表达情况。

胸腺是一种上皮-间充质器官，可促进T淋巴细胞的发育及其受体库的选择。在胸腺的皮质和髓质微环境中，胸腺上皮细胞（TECs）在指导T细胞发育和选择过程中发挥关键作用。目前普遍认为，胸腺皮质中的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）主要参与诱导早期T细胞发育，并促进新生成的表达T细胞抗原受体（TCR）的胸腺细胞进行阳性选择。相比之下，胸腺髓质中的髓质胸腺上皮细胞（mTECs）对于吸引来自皮质的阳性选择胸腺细胞至关重要，并通过清除自身反应性T细胞以及生成调节性T细胞来建立中枢自身耐受1,2。TECs在支持T细胞发育和选择方面的这些功能，是通过cTECs和mTECs中表达的多种分子介导的。
这些分子包括Delta样配体4（DLL4），对淋巴样前体细胞的T细胞谱系特化至关重要3,4；beta5t（也称为Psmb11，对CD8 T细胞的阳性选择至关重要）5,6；以及Prss16（也称为胸腺特异性丝氨酸蛋白酶，或TSSP，对CD4 T细胞的阳性选择至关重要）7,8，这些分子在cTEC中表达；还包括自身免疫调节因子（Aire，对自身基因的异位表达至关重要）9,10、Fez家族锌指蛋白2（Fezf2，对Aire非依赖性自身基因的异位表达及胸腺tuft细胞的生成至关重要）11,12,13,14，以及C-C基序趋化因子配体21（CCL21，对阳性选择后胸腺细胞向髓质迁移和聚集至关重要）14,15,16，这些分子在mTEC中表达。流式细胞术可用于定量检测胸腺上皮细胞（TEC）中这些功能重要的分子，有助于评估cTEC和mTEC的发育与功能状态。由于TEC中的许多分子主要在细胞内表达，例如位于胞质（如蛋白酶体组分beta5t）或细胞核（如转录调控因子Aire）中，因此采用流式细胞术对cTEC和mTEC中的细胞内分子进行定量分析具有显著优势。
胸腺上皮细胞（TECs）在胸腺中数量稀少。一只5周龄的雌性小鼠约含有1 × 106个皮质胸腺上皮细胞（cTECs）和约2.5 × 106个髓质胸腺上皮细胞（mTECs），而胸腺皮质中含有约3 × 108个CD4+CD8+胸腺细胞，胸腺髓质中含有约5 × 107个CD4+CD8-和CD4-CD8+胸腺细胞17。因此，在年轻成年小鼠中，胸腺内绝大多数（&#62;99%）的细胞为造血来源的细胞（包括胸腺细胞），而非TECs。此外，TECs在胸腺内与邻近细胞（如胸腺细胞）以及结构性的细胞外成分（如胶原蛋白）紧密结合，因此将TECs释放为单细胞悬液需要对胸腺进行蛋白酶消化。传统的酶消化方法仅能获得少量TECs；从5周龄小鼠胸腺中分别仅能获得约1%（1 × 104）的cTECs和约10%（2 × 105）的mTECs17,18,19。TECs从胸腺中释放效率低下的原因可能在于TECs对蛋白水解酶和机械应力较为敏感，以及TECs与邻近细胞（特别是cTECs与CD4+CD8+胸腺细胞之间）的紧密结合20。因此，目前基于酶消化法所获得的单细胞悬液进行的小鼠TECs单细胞分析（包括流式细胞术分析和单细胞RNA测序分析）仅代表了TECs中的一小部分，远未达到全面性。尽管如此，尽管酶法获取TECs存在上述局限性，对单细胞悬液中小鼠TECs进行流式细胞术分析仍可用于cTECs和mTECs中功能相关分子的定量分析。在单细胞悬液中，TECs被定义为上皮细胞表面分子EpCAM（CD326）阳性而造血细胞表面分子CD45阴性的细胞。在EpCAM+CD45- TECs群体中，细胞表面Ly51分子（又称BP-1或CD249）的表达水平以及荆豆凝集素I（UEA1）的结合能力（主要结合含α-连接岩藻糖的糖蛋白和糖脂）被用于表型区分cTECs（Ly51highUEA1low）和mTECs（Ly51lowUEA1high）。本文中，我们描述了常规制备小鼠TECs单细胞悬液的实验方案，以及针对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的方法，重点聚焦于对新制备的小鼠TECs中细胞内分子beta5t、CCL21和Aire的定量分析。

<table><tbody><tr><td>胶原酶/分散酶&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510&amp;nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0870-T500</td><td></td></tr><tr><td>BV421 抗小鼠 CD45 单克隆抗体，克隆号 30-F11</td><td>BD Horizon</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly51 单克隆抗体，克隆号 6C3</td><td>BioLegend</td><td>108312</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 EpCAM/CD326 单克隆抗体，克隆号 G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118216</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 欧洲荆豆凝集素 I (UEA1)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DL-1067-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗小鼠 Aire 单克隆抗体，克隆号 5H12</td><td>eBioscience</td><td>53-5934-82</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Psmb11/beta5t 兔单克隆抗体，克隆号 CPTC-PSMB11(mouse)-1</td><td>NIH NCI</td><td>CPTC-PSMB11(mouse)-1</td><td>https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal</td></tr><tr><td>抗小鼠 CCL21/exodus 2 兔多克隆抗体</td><td>Bio-Rad</td><td>AAM27</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 抗兔 IgG 重链山羊重组抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD32/CD16 &amp;ndash; 纯化型（Fc 阻断抗体）</td><td>Leinco Technologies</td><td>C247</td><td></td></tr><tr><td>60 微米尼龙筛网</td><td>Component Supply</td><td>W31436</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>加热模块</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000 细胞活力计数仪</td><td>Nexcelom</td><td>活细胞计数</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td>流式细胞仪</td><td>五激光系统（355、408、488、595 和 637 nm）</td></tr><tr><td>FACSDiva 软件 9.0.1 版本</td><td>BD Biosciences</td><td>流式细胞分析</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>流式细胞数据处理</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td>稀释比例（工作浓度）</td><td>稀释缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD32/CD16 &amp;ndash; 纯化型（Fc 阻断抗体）</td><td>1:40</td><td>FACS 缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>BV421 抗小鼠 CD45 单克隆抗体</td><td>1:25</td><td>FACS 缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗小鼠 EpCAM/CD326 单克隆抗体</td><td>1:100</td><td>FACS 缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly51 单克隆抗体</td><td>1:100</td><td>FACS 缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 欧洲荆豆凝集素 I (UEA1)</td><td>1:400</td><td>FACS 缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CCL21/exodus 2 兔多克隆抗体</td><td>1:200</td><td>1x 通透缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Psmb11/beta5t 兔单克隆抗体，克隆号 CPTC-PSMB11(mouse)-1</td><td>1:1000</td><td>1x 通透缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 抗兔 IgG 重链山羊重组抗体</td><td>1:400</td><td>1x 通透缓冲液</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液</td><td>用途</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 10 mM HEPES 的 RPMI1640&amp;nbsp;</td><td>用于细胞制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 2% FBS 的 RPMI1640</td><td>用于细胞制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS 缓冲液（含 1% BSA&amp;nbsp;和 0.1% 叠氮化钠的 1x HBSS）</td><td>用于细胞制备和抗体染色</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 1 mg/ml 胶原酶/分散酶和 1 U/ml DNase 的 RPMI1640（含 2% FBS）</td><td>用于酶消化</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 2% PFA 的 PBS</td><td>用于细胞固定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定/通透缓冲液（1 份固定/通透浓缩液与 3 份固定/通透稀释液混合）</td><td>用于细胞固定</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x 通透缓冲液（1 份 10X 浓缩液与 9 份蒸馏水混合）</td><td>用于胞内抗体染色&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

胸腺上皮细胞（TECs）在促进T细胞的发育和受体库选择中发挥着至关重要的作用。位于胸腺皮质的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）可诱导早期T细胞发育并对皮质胸腺细胞进行阳性选择。相比之下，位于胸腺髓质的髓质胸腺上皮细胞（mTECs）则吸引来自皮质的阳性选择胸腺细胞，并在T细胞中建立自身耐受。多种分子参与支持胸腺功能以促进T细胞的发育与选择，其中包括cTECs中表达的DLL4和beta5t，以及mTECs中表达的Aire和CCL21。尽管目前制备TECs单细胞悬液的方法仅能从年轻成年小鼠胸腺中回收少量TECs（cTECs约1%，mTECs约10%），但对cTECs和mTECs中功能相关分子进行流式细胞术分析仍有助于加深我们对TECs生物学特性的理解。由于TECs中许多功能相关分子定位于细胞内，本文描述了我们用于制备小鼠TECs单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以进行流式细胞术分析的实验方案。

分析需要一台能够检测至少六个荧光通道（用于 CD45、EpCAM、Ly51、UEA1、Ghost Dye 以及 beta5t、CCL21 和/或 Aire）并具备前向散射和侧向散射参数的流式细胞仪。图中展示了 0 日龄小鼠和 2 周龄小鼠经胶原酶/分散酶消化后的胸腺细胞的代表性流式细胞术图谱 图1 和 图2，分别。在这两幅图中，面板中的点图 A 显示总颗粒信号的前向散射（FSC）强度和Ghost Dye Violet 510荧光强度。根据Ghost Dye试剂的阴性染色结果以及前向散射反映的细胞大小判断，超过90%的颗粒信号代表活细胞。图示 B 显示胸腺活细胞表面CD45和EpCAM的荧光信号，CD45为造血细胞表达的分子，EpCAM为上皮细胞表达的分子。其中存在一小群但特征明显的CD45阳性细胞- EpCAM+因此代表胸腺上皮细胞（TECs）。
<img alt="流式细胞术分析，EpCAM-PE-Cy7，CD45-BV421，细胞群体，皮质胸腺上皮细胞，髓质胸腺上皮细胞，数据可视化" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：0日龄野生型C57BL/6背景小鼠胸腺细胞经胶原酶/中性蛋白酶消化后的代表性流式细胞术分析图谱 (A) 总颗粒信号的前向散射光强度与 Ghost Dye Violet 510 荧光强度。红色框表示活细胞信号。B) 活细胞的荧光信号（图中红色框内） ACD45 和 EpCAM 的检测。红色方框指示 CD45- EpCAM+ 胸腺上皮细胞。C) TECs 中 Ly51 和 UEA1 细胞表面染色信号（图中红色框内） B) 显示出两个主要群体：Ly51高 UEA1低 富集了cTECs和Ly51的细胞低 UEA1高 富集了mTECs的细胞。D-F) 的检测（Dβ5t，（ECCL21，以及（F) 如图中所示定义的cTECs（上图）和mTECs（下图）中的Aire表达 C灰色直方图显示使用（染色的对照图谱D,E）仅二抗和（F) 使用 Aire 缺陷型小鼠的细胞进行染色。缩写：FSC = 前向散射；TECs = 胸腺上皮细胞；cTECs = 皮质胸腺上皮细胞；mTECs = 髓质胸腺上皮细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析，TEC细胞设门，CD45-BV421，EpCAM-PE-Cy7，散点图，直方图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：来自2周龄野生型C57BL/6背景小鼠的胶原酶/分散酶消化胸腺细胞的代表性流式细胞术图谱。 (A) 总颗粒信号的前向散射光强度与 Ghost Dye Violet 510 荧光强度。红色框表示活细胞信号。B) 活细胞的荧光信号（图中红色框内） ACD45 和 EpCAM 的检测。红色方框指示 CD45- EpCAM+ TECs。C) TECs 中 Ly51 和 UEA1 细胞表面染色信号（图中红色方框） B) 显示出两个主要群体：Ly51高 UEA1低 富集了cTECs和Ly51的细胞低 UEA1高 富含mTECs的细胞。D-F) 检测（Dβ5t，（ECCL21，以及（F) 如图中所示定义的cTECs（上图）和mTECs（下图）中的Aire表达 C灰色直方图显示使用（染色的对照图谱D，E）仅二抗，染色用（F) FITC标记的同型对照IgG。缩写：FSC = 前向散射；TECs = 胸腺上皮细胞；cTECs = 皮质胸腺上皮细胞；mTECs = 髓质胸腺上皮细胞；FITC = 异硫氰酸荧光素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
如图C所示，Ly51和UEA1细胞表面染色信号揭示了胸腺上皮细胞（TECs）中的两个主要细胞群：一类为Ly51表达相对较高而UEA1表达较低的细胞群，富含皮质型胸腺上皮细胞（cTECs）；另一类为Ly51表达相对较低而UEA1表达较高的细胞群，富含髓质型胸腺上皮细胞（mTECs）21,22,23,24,25。在胚胎期和新生期（包括出生0天），cTECs的频率高于mTECs。在出生后阶段，mTECs的频率占主导地位，主要原因是cTECs从胸腺释放的效率变得极低（仅约1%的cTECs和10%的mTECs可被回收至单细胞悬液中）17。
细胞的固定和通透处理可实现胸腺上皮细胞（TECs）内细胞内分子的检测。图D显示β5t在大多数皮质胸腺上皮细胞（cTECs）中表达，而在髓质胸腺上皮细胞（mTECs）中不表达；图E显示CCL21在部分mTECs中被检测到，但在cTECs中未检测到；图F显示Aire在mTECs的一个亚群中表达。
有关小鼠胸腺上皮细胞（TECs）内其他细胞内分子的流式细胞术分析谱型，可参见已发表的文章；例如 beta5t6,20、CCL2114,16,26 和 Aire27,28，以及其他细胞内分子，包括角蛋白（keratin）22,29 和 Fezf211,30。

我们描述了制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液以及对细胞内分子进行染色以用于流式细胞术分析的实验方案。

胸腺上皮细胞（TECs）在促进T细胞的发育和受体库选择中发挥关键作用。位于胸腺皮质中的皮质胸腺上皮细胞（cTECs）在……

T细胞是保护我们机体免受传染病和癌症侵害的免疫细胞。胸腺是一种产生T细胞的器官，它会根据机体的自身成分对发育中的T细胞进行筛选。我们关注的是，胸腺如何产生并筛选出既能保护机体、又对机体自身具有耐受性的T细胞。我们的实验室致力于胸腺上皮细胞的分析，这类细胞在胸腺中对T细胞的生成与筛选具有关键作用。在单细胞水平上对胸腺上皮细胞进行分析，有助于我们更深入地理解T细胞发育与筛选的分子机制。胸腺上皮细胞具有高度异质性且结构复杂，这使得其分离具有挑战性。目前用于分离单细胞悬液的技术仍存在局限性，需要进一步改进。尽管如此，胸腺上皮细胞的单细胞分离有助于加深我们对其发育和功能相关分子机制的理解。我们希望本研究能够促进对免疫细胞生成与再生机制的认识。我们相信，这将为促进人类健康提供一个重要的基石。从小鼠体内取出胸腺后，将其置于含有10毫摩尔HEPES的5毫升RPMI 1640培养基中，放入60毫米的塑料培养皿内，并置于冰上。在解剖显微镜下，使用带弧度的精细镊子去除血液、非胸腺组织及脂肪组织。用解剖剪将胸腺剪成小块。将胸腺组织块转移至含有 3 毫升消化液的 15 毫升离心管中，消化液成分为：1 毫克/毫升胶原酶和分散酶，以及 1 单位/毫升 DNase，溶于含 2% FBS 的 RPMI 1640 培养基中。将离心管置于 37 摄氏度水浴中孵育 20 分钟。然后使用一支3毫升塑料移液管混匀悬液，并继续孵育约30分钟，直至看不到组织碎片为止。加入5毫升含1% FBS的HBSS缓冲液配制的5毫摩尔EDTA溶液。将细胞悬液通过60微米尼龙滤网过滤至新的50毫升离心管中。在4°C条件下，以350G离心力离心悬浮液5分钟，然后将沉淀重悬于10毫升FACS缓冲液中。将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数器测定细胞数量。从新生小鼠中取出胸腺后，使用带弯曲细尖的镊子去除血液、非胸腺组织及脂肪组织。将胸腺转移至含有0.2毫升含10毫摩尔HEPES的RPMI 1640培养基的1.5毫升离心管中。使用200微升移液器弃去上清液，然后加入0.5毫升含0.5毫克/毫升胶原酶和分散酶以及1单位/毫升DNase的RPMI 1640培养基（含2% FBS）。将离心管置于37摄氏度的加热块中孵育。孵育期间，使用1毫升移液器轻轻混匀。10分钟后，加入0.5毫升含1% FBS的HBSS缓冲液，其中EDTA浓度为5毫摩尔。将细胞悬液通过60微米尼龙滤网过滤至新的15毫升锥形管中。向离心管中加入9 mL含有10 mmol/L HEPES的RPMI 1640培养基。在4°C条件下，以350×g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于1至3 mL FACS缓冲液中。将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。首先，在一个5毫升的聚苯乙烯圆底试管中加入16乘以10的6次方个新生或出生后小鼠胸腺细胞。将细胞悬液在4摄氏度下以350×g离心5分钟，弃去上清液。用10微升FACS缓冲液中工作浓度的抗FC受体单克隆抗体重悬细胞沉淀。将试管在 4 摄氏度下孵育 5 分钟。向试管中分别加入 40 µL FACS 缓冲液中的抗-CD45 单克隆抗体、抗-EpCAM 单克隆抗体、抗-Ly-51 单克隆抗体和 UEA-1。混匀试管内容物，并在 4 摄氏度下孵育 45 分钟。孵育后，加入2毫升FACS缓冲液。在4摄氏度下以350G离心细胞悬液5分钟，将沉淀重悬于1微升Ghost Dye violet 510溶液中。混匀管内物质，在4摄氏度下孵育30分钟。现在加入 2 毫升 FACS 缓冲液，离心细胞悬液，然后在室温下用 1 毫升 2% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。向离心管中加入 3.5 毫升 PBS。在 4 摄氏度下以 700 × g 离心细胞悬液 8 分钟，并用 1 毫升细胞内固定和透化缓冲液对细胞进行透化处理。混匀管内物质，在4°C下孵育20分钟。孵育结束后，离心细胞悬液，并加入1毫升透化缓冲液。再次离心悬液，然后分别加入100微升工作浓度的抗-beta5t抗体或抗-CCL21抗体。室温孵育60分钟。加入1毫升破膜缓冲液，在4摄氏度下以700G离心8分钟。然后加入100微升工作浓度的抗兔IgG，室温孵育30分钟。加入破膜缓冲液后，离心细胞悬液。将细胞沉淀重悬于200微升FACS缓冲液中，充分混匀。在进行流式细胞术分析前，将细胞悬液通过60微米尼龙滤网过滤。对出生当天和两周龄小鼠胸腺细胞经胶原酶和分散酶消化后的流式细胞术分析结果显示，超过90%的颗粒信号代表活细胞。活细胞的荧光信号由CD45和EpCAM标记。在新生阶段，cTEC的频率高于mTEC；但在出生后阶段，由于cTEC释放效率较低，mTEC占主导地位。固定和透化细胞可实现胸腺上皮细胞（TECs）内细胞内分子的检测。Beta5t 表达存在于大多数皮质胸腺上皮细胞（cTECs）中，但在髓质胸腺上皮细胞（mTECs）中未检测到。CCL21 在部分髓质胸腺上皮细胞（mTECs）中被检测到，但在皮质胸腺上皮细胞（cTECs）中未检测到。相比之下，空气在mTECs的一个亚群中表达。

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皮肤是复杂免疫细胞网络的栖息地。本文介绍一种高效的小鼠皮肤消化方法，适用于动物身体不同部位的皮肤，以获得单细胞悬液，并通过流式细胞术分析皮肤中定居的各种白细胞群体。...

从小鼠皮肤不同区域制备用于流式细胞分析的单细胞悬液

本文描述了通过分析T细胞前体的生成动力学、表型及数量，来表征胸腺定植前体细胞的体内和体外方法。...

利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

本文介绍了一种从小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏制备单细胞悬液的实验方案，以便进一步通过流式细胞术对这些细胞进行研究。此外，该方案还可用于通过流式细胞术鉴定调节性T细胞的不同亚群。...

利用流式细胞术检测小鼠胸腺、胰腺引流淋巴结和脾脏中调节性T细胞亚群

本研究中，我们提供了一种高效且可重复的小鼠呼吸系统免疫细胞群体分离方案。同时，我们还介绍了一种利用基于9色流式细胞术的检测...

小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。...

从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

学习制备小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液并进行流式细胞术细胞内分子染色的完整实验方案。该方法有助于深入理解T细胞发育与选择的分子机制，为免疫学研究提供重要技术支持。

小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

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