小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

T细胞是保护我们机体免受传染病和癌症侵害的免疫细胞。胸腺是一种产生T细胞的器官，它会根据机体的自身成分对发育中的T细胞进行筛选。我们关注的是，胸腺如何产生并筛选出既能保护机体、又对机体自身具有耐受性的T细胞。

我们的实验室致力于胸腺上皮细胞的分析，这类细胞在胸腺中对T细胞的生成与筛选具有关键作用。在单细胞水平上对胸腺上皮细胞进行分析，有助于我们更深入地理解T细胞发育与筛选的分子机制。胸腺上皮细胞具有高度异质性且结构复杂，这使得其分离具有挑战性。

目前用于分离单细胞悬液的技术仍存在局限性，需要进一步改进。尽管如此，胸腺上皮细胞的单细胞分离有助于加深我们对其发育和功能相关分子机制的理解。我们希望本研究能够促进对免疫细胞生成与再生机制的认识。

我们相信，这将为促进人类健康提供一个重要的基石。从小鼠体内取出胸腺后，将其置于含有10毫摩尔HEPES的5毫升RPMI 1640培养基中，放入60毫米的塑料培养皿内，并置于冰上。在解剖显微镜下，使用带弧度的精细镊子去除血液、非胸腺组织及脂肪组织。

用解剖剪将胸腺剪成小块。将胸腺组织块转移至含有 3 毫升消化液的 15 毫升离心管中，消化液成分为：1 毫克/毫升胶原酶和分散酶，以及 1 单位/毫升 DNase，溶于含 2% FBS 的 RPMI 1640 培养基中。将离心管置于 37 摄氏度水浴中孵育 20 分钟。

然后使用一支3毫升塑料移液管混匀悬液，并继续孵育约30分钟，直至看不到组织碎片为止。加入5毫升含1% FBS的HBSS缓冲液配制的5毫摩尔EDTA溶液。将细胞悬液通过60微米尼龙滤网过滤至新的50毫升离心管中。

在4°C条件下，以350G离心力离心悬浮液5分钟，然后将沉淀重悬于10毫升FACS缓冲液中。将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数器测定细胞数量。从新生小鼠中取出胸腺后，使用带弯曲细尖的镊子去除血液、非胸腺组织及脂肪组织。

将胸腺转移至含有0.2毫升含10毫摩尔HEPES的RPMI 1640培养基的1.5毫升离心管中。使用200微升移液器弃去上清液，然后加入0.5毫升含0.5毫克/毫升胶原酶和分散酶以及1单位/毫升DNase的RPMI 1640培养基（含2% FBS）。将离心管置于37摄氏度的加热块中孵育。

孵育期间，使用1毫升移液器轻轻混匀。10分钟后，加入0.5毫升含1% FBS的HBSS缓冲液，其中EDTA浓度为5毫摩尔。将细胞悬液通过60微米尼龙滤网过滤至新的15毫升锥形管中。

向离心管中加入9 mL含有10 mmol/L HEPES的RPMI 1640培养基。在4°C条件下，以350×g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于1至3 mL FACS缓冲液中。将细胞置于冰上保存，并使用细胞计数仪测定细胞数量。

首先，在一个5毫升的聚苯乙烯圆底试管中加入16乘以10的6次方个新生或出生后小鼠胸腺细胞。将细胞悬液在4摄氏度下以350×g离心5分钟，弃去上清液。用10微升FACS缓冲液中工作浓度的抗FC受体单克隆抗体重悬细胞沉淀。

将试管在 4 摄氏度下孵育 5 分钟。向试管中分别加入 40 µL FACS 缓冲液中的抗-CD45 单克隆抗体、抗-EpCAM 单克隆抗体、抗-Ly-51 单克隆抗体和 UEA-1。混匀试管内容物，并在 4 摄氏度下孵育 45 分钟。

孵育后，加入2毫升FACS缓冲液。在4摄氏度下以350G离心细胞悬液5分钟，将沉淀重悬于1微升Ghost Dye violet 510溶液中。混匀管内物质，在4摄氏度下孵育30分钟。

现在加入 2 毫升 FACS 缓冲液，离心细胞悬液，然后在室温下用 1 毫升 2% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。向离心管中加入 3.5 毫升 PBS。在 4 摄氏度下以 700 × g 离心细胞悬液 8 分钟，并用 1 毫升细胞内固定和透化缓冲液对细胞进行透化处理。

混匀管内物质，在4°C下孵育20分钟。孵育结束后，离心细胞悬液，并加入1毫升透化缓冲液。再次离心悬液，然后分别加入100微升工作浓度的抗-beta5t抗体或抗-CCL21抗体。

室温孵育60分钟。加入1毫升破膜缓冲液，在4摄氏度下以700G离心8分钟。然后加入100微升工作浓度的抗兔IgG，室温孵育30分钟。

加入破膜缓冲液后，离心细胞悬液。将细胞沉淀重悬于200微升FACS缓冲液中，充分混匀。在进行流式细胞术分析前，将细胞悬液通过60微米尼龙滤网过滤。

对出生当天和两周龄小鼠胸腺细胞经胶原酶和分散酶消化后的流式细胞术分析结果显示，超过90%的颗粒信号代表活细胞。活细胞的荧光信号由CD45和EpCAM标记。在新生阶段，cTEC的频率高于mTEC；但在出生后阶段，由于cTEC释放效率较低，mTEC占主导地位。

固定和透化细胞可实现胸腺上皮细胞（TECs）内细胞内分子的检测。Beta5t 表达存在于大多数皮质胸腺上皮细胞（cTECs）中，但在髓质胸腺上皮细胞（mTECs）中未检测到。CCL21 在部分髓质胸腺上皮细胞（mTECs）中被检测到，但在皮质胸腺上皮细胞（cTECs）中未检测到。

相比之下，空气在mTECs的一个亚群中表达。