利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

血管生成是胚胎发育和疾病进展（包括肿瘤生长和血管增生性眼病）中的一个标志性过程。在本项目中，我们旨在提供一套全面的体外技术框架，用于在高度可控的条件下从分子水平研究血管生成，并筛选潜在的较少产品选项。由于存在假阳性或假阴性结果的风险，将体外研究结果转化为体内实验并最终应用于临床具有挑战性。

因此，选择合适的血管生成检测方法至关重要，同时必须了解其局限性。本研究旨在提供两种常用血管生成检测方法的建立指南及其结果解读方法。近期，我们比较了二维划痕伤口迁移实验与三维球体出芽实验。

尽管二维实验易于扩增规模，但三维实验能更详细地捕捉血管生成过程，包括顶端细胞-柄细胞的形成、基质相互作用以及糖酵解转换。这些数据为科研人员在后续项目中选择何种实验方法提供了指导依据。本实验室将继续通过将上述体外实验与体内环境进行直接比较，深入表征这些体外实验的关键特征，以促进体外实验结果向临床应用的转化。

首先，将100微升HUVEC细胞接种至96孔板的各孔中。将该板置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵育箱中孵育6小时，以促进细胞贴壁。随后，将每孔中的培养基更换为含2% FBS的100微升内皮细胞生长基础培养基，再次进行孵育。

第二天，将培养板放入96孔伤口生成工具中。按下装置的杠杆以产生划痕。在释放杠杆之前，小心取下伤口生成工具的盖子，以防止重复划痕。

用含胎牛血清的内皮细胞生长基础培养基 200 微升洗涤各孔两次。确认完全去除碎片后，向每孔加入 100 微升已配制的刺激液或对照溶液。使用活细胞成像显微镜每小时采集一次图像，持续 24 小时。

阳性对照显示，在原始划痕区域中细胞成功迁移。技术问题表现为细胞生长不均、重复划痕或划痕边缘出现波浪状。相对伤口距离增加25%被视为最佳效果。

阳性和阴性对照分离不正确，表明动态范围较低。首先，将30毫升5%氢氧化钾甲醇溶液加入50毫升离心管中。将100个直径为12毫米的盖玻片放入该管中，在持续振荡条件下孵育30分钟。

接下来，用去离子水清洗盖玻片30分钟。清洗完成后，将盖玻片转移至70%异丙醇溶液中保存。如需包被盖玻片，首先将它们各自倾斜靠在方形培养皿的内壁上。

异丙醇挥发后，将盖玻片转移至24孔板中。每孔加入1毫升PBS中的胶原溶液，进行孵育。随后，用1毫升PBS将盖玻片洗涤4至5次，每次5分钟。

将培养的HUVECs用移液器接种到含有包被盖玻片的孔中。在所需时间培养细胞后，用一毫升PBS洗涤细胞五分钟。在室温下，用一毫升2%多聚甲醛固定细胞20分钟。

现在，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，每次五分钟，共洗三到四次。最后，在染色前向孔板中加入一毫升封闭缓冲液。首先，将 HUVECs 加入含有八毫升内皮细胞生长培养基的 10 毫升 Falcon 管中。

向管中加入2毫升甲基纤维素储备液，充分振荡混匀。接着，将25微升混合液转移至大型方形培养皿倒置的内表面。轻轻将皿盖旋转180度，然后将其放置于细胞培养容器底部，过夜孵育。

第二天，将2.3毫升大鼠尾部I型胶原加入含有0.28毫升10倍浓度Medium 199的离心管中。将该混合物置于冰上，并混匀至呈现均匀的黄色。用氢氧化钠滴定该混合物，直至其变为橙色。

然后向终产物中加入 50 µL HEPES 缓冲液。将悬滴培养的细胞收集到含有 20 mL PBS 的 50 mL Falcon 管中，随后离心。弃去上清液后，向球状体沉淀中加入 0.1 mL FBS 和 0.4 mL 内皮基础培养基。

轻轻敲击离心管以重悬沉淀。现在用移液器加入两毫升甲基纤维素储备液，并充分混匀。然后向重悬的类球体中加入两毫升制备好的胶原蛋白混合物。

将0.5毫升的终混合物加入24孔板的各孔中，并进行孵育。随后，用移液器向各孔中加入100微升稀释的重组人血管内皮生长因子。将细胞培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育12小时。

第二天，使用倒置显微镜拍摄未与孔壁接触且彼此分离、无损伤迹象的类球体图像。仅用基础培养基或重组人血管内皮生长因子刺激的类球体可清晰区分。低质量凝胶中的类球体则呈现下沉并分散的现象。

阴性对照组显示出中等的基础出芽率，而人血管内皮生长因子使相对出芽长度增加至原来的两到三倍。出芽数量也表现出相似的动态范围。首先，用1毫升4%多聚甲醛固定已出芽的HUVEC球体凝胶，孵育1小时。

用一毫升 PBS 轻柔洗涤凝胶，约三到四次。将凝胶从孔板每个孔的表面完全剥离，然后转移至新的 24 孔板中。

向孔板中加入一毫升封闭液，然后在室温下于摇床上孵育一小时。孵育结束后，用移液器将500微升一抗溶液加入各孔中，随后进行孵育。次日，用PBS轻柔洗涤凝胶，共洗涤五次，每次五分钟。

加入500微升用封闭缓冲液稀释的相应二抗及FTSE。在4摄氏度下于摇床上孵育过夜。用PBS洗涤凝胶后，将其转移至显微镜载玻片上。

在盖玻片上滴加两滴含有 DAPI 的封片剂，然后将其覆盖在每块凝胶上。用指甲油密封干燥的凝胶，置于避光处，随后于 4°C 保存直至进一步分析。