小鼠视网膜神经节细胞的全层免疫染色与自动计数

我们的研究范围是利用小鼠作为青光眼研究的动物模型，精确评估小鼠视网膜中青光眼的状况。我们需要确定视网膜中有多少视网膜神经节细胞。整个小鼠视网膜中大约有 50,000 个视网膜神经节细胞。

如果手动计数，可能需要花费八到十个小时。而采用自动计数方法可在几分钟内完成，可大大节省人力和时间。未来，我们实验室将专注于青光眼治疗的研究。

我们将使用不同的青光眼小鼠模型来测试多种治疗方法。本方案中描述的方法特别适用于治疗效果的评估。在通过颈椎脱位处死小鼠后，进行眼球摘除和眼球组织处理，使用蓝色标记笔在眼球背侧的角膜边缘做标记，以确保解剖过程中组织方向的准确性。

使用剪刀去除附着在眼球上的残留肌肉组织。然后，将去眼球放入一个装有 PBS 的 2 毫升圆底微量离心管中。接着，将眼球转移至另一个含有新配制的 4% 多聚甲醛的 2 毫升离心管中，在 4 摄氏度条件下固定 10 分钟。

在解剖显微镜下，使用精细镊子在角膜上做一个小切口。将眼球放回固定液中，在4°C下孵育3小时，以保存组织形态。使用精细手术剪刀切除角膜和晶状体：在角膜缘（即角膜与巩膜的交界处）周围做一个约1毫米的小切口。

仔细沿角膜周缘剪开，完全切除角膜以暴露其下方结构。接着，使用精细镊子轻轻夹住晶状体并小心将其从周围组织中提起，避免损伤视网膜。进行巩膜切口时，使用精细眼科剪在巩膜上精确剪出一个切口，以便后续解剖操作。

接下来，进行视网膜分离时，将有齿镊插入巩膜与视网膜之间的切口处。轻轻夹住巩膜边缘，避免用力过大，以防撕裂组织。通过沿巩膜与视网膜交界处移动镊子，逐步扩大切口。

使用镊子的齿状部分小心地将巩膜与视网膜分离，避免损伤视网膜。接着，用锋利的剪刀将视网膜切成四个大致相等的瓣状。用软毛刷轻轻展开分离的视网膜，并仔细清除其表面的碎片。

从小鼠中分离出完整的眼底视网膜后，用 PBS 轻柔振荡洗涤 5 分钟。将洗涤后的视网膜浸入封闭缓冲液中，封闭 30 分钟。孵育结束后，弃去封闭缓冲液，加入一抗 BRN3A。

将视网膜在4°C下孵育过夜，以实现特异性抗原-抗体结合。次日，用PBS洗涤视网膜三次，每次5分钟，随后加入Alexa 594或Alexa 488标记的抗兔二抗，室温孵育2小时，以显示目标抗原。免疫染色完成后，用PBS洗涤视网膜，然后将其轻轻转移至载玻片上。

展平视网膜以尽量减少折叠或变形。将盖玻片置于固定好的视网膜上，确保不产生气泡。从 GitHub 链接下载代码，然后从云盘下载必要文件并解压缩。

找到 config.ini 文件，并修改其内容以指向 Yolo V5 CPU 路径。然后，单击 userinterface。

exe 以打开图形界面。检查 pmse_plus.pt 模型文件是否位于 C 盘根目录下。若不存在，请从 Yolo V5 文件夹的 waits 文件夹中复制该文件。

打开细胞计数软件。点击“打开图像”以导入图像，然后点击“运行”，使软件自动计数细胞。

自动细胞计数软件在N-甲基-D-天冬氨酸诱导的青光眼小鼠模型中准确识别出15,231个视网膜神经节细胞，与正常视网膜中约45,000至50,000个视网膜神经节细胞相比，显示出显著的细胞丢失。