Name: 小鼠视网膜神经节细胞的全支架免疫染色和自动计数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学习小鼠视网膜全支架免疫染色与AI自动计数技术，用于快速定量视网膜神经节细胞。该方法可准确识别超过15000个RGCs，显著提高青光眼研究效率并减少人工误差。

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本研究项目得到了中国国家自然科学基金（82371059（H.Z.））、中国四川省科学技术厅（2023JDZH0002（H.Z.））、成都市科学技术局（2022-YF05-01984-SN（H.Z.））以及四川省人民医院（30320230095（J.Y.）、30420220062（J.Y.））的资助。&#160;

本实验遵循视力与眼科学研究协会关于在研究中使用动物的指南，并已获得四川省人民医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。本研究使用2月龄雄性C57Bl/6J小鼠。图1展示了此处描述的整体实验流程。所用试剂和设备的详细信息见于材料表。
1. 整体视网膜的分离
<ol>
	<li>动物安乐处死
	<ol>
		<li>采用颈椎脱位法处死小鼠（遵循机构批准的方案）图 2A）。在进行颈椎脱位之前， 
		通过吸入异氟烷（3%-5% 氧气混合）或腹腔注射麻醉小鼠&#160;氯胺酮/赛拉嗪混合物</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去核及眼球组织处理
	<ol>
		<li>用蓝色记号笔在眼球背面的角膜边缘做标记，以记录后续解剖过程中的方位。</li>
		<li>用剪刀去除附着在眼球上的残留肌肉组织。将摘除的眼球转移至含有1x PBS的2 mL圆底微量离心管中，进行短暂冲洗（图2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定
	<ol>
		<li>将眼球转移至另一含有 freshly made 4% 多聚甲醛（PFA）的 2 mL 圆底微量离心管中，于 4 °C 固定 10 min图2D).</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用精细剪刀在角膜上做一个小切口（约1-2 mm）。</li>
		<li>将眼球放回固定液中，在 4 °C 下继续固定 3 小时，以保存组织形态（图2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>角膜和晶状体的摘除1,9
	<ol>
		<li>使用精细的手术剪在角膜缘（角膜与巩膜的交界处）周围做一个约1毫米的小切口。</li>
		<li>仔细沿角膜周缘剪切，完全切除角膜以暴露其下方结构。</li>
		<li>使用精细镊子轻轻夹住晶状体，小心地从周围组织中抬起，以防止损伤视网膜。操作需轻柔，以保持视网膜的结构完整性。</li>
		<li>将眼杯转移至微量离心管中，以进行后续处理。 
		注意：使用以下方法可更高效地切除角膜并提取晶状体 &#34;交叉狭缝&#34; 技术10在角膜上做两个相互垂直的切口，用镊子取出晶状体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>巩膜切口
	<ol>
		<li>用精细的眼科剪刀在巩膜上切开一个精确的切口，以利于后续的解剖步骤（图2J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜分离
	<ol>
		<li>用有齿镊插入巩膜与视网膜之间的切口处，轻柔夹住巩膜边缘，避免用力过大，以防撕裂组织。</li>
		<li>通过镊子沿巩膜与视网膜交界处进行缓慢、稳定的移动，逐渐扩大切口。使用镊子的齿状部分小心分离巩膜与视网膜，确保不损伤视网膜（图 2J).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜切割
	<ol>
		<li>使用锋利的剪刀将视网膜切成四个大小大致相等的瓣状结构。切口应朝向视神经方向，深度约为视神经距离的一半，且各切口之间相互呈90°排列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜清洗
	<ol>
		<li>用软毛刷轻轻展开已解剖的视网膜，并仔细清除其表面的碎片（图 2K).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最终固定
	<ol>
		<li>将分离的视网膜用一次性巴斯德吸管转移至含有新鲜4% PFA的微量离心管中。冰上固定额外5小时至过夜，以保存组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫染色
<ol>
	<li>洗涤
	<ol>
		<li>用1× PBS轻轻振荡清洗分离的全层视网膜5分钟，弃去PBS溶液。重复此步骤两次，以去除残留的固定剂和碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭
	<ol>
		<li>将清洗后的视网膜浸入封闭缓冲液（含4%正常驴血清（NDS）和0.2% Triton X-100的1× PBS）中，孵育30分钟，以防止非特异性抗体结合并增强通透性（图3A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>用BRN3A一抗（以封闭缓冲液按1:200稀释）替换封闭液，于4 °C孵育过夜，以实现抗原与抗体的特异性结合（图3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤
	<ol>
		<li>用1× PBS对视网膜清洗三次，每次5分钟，以去除未结合的一抗，降低背景染色（图3C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>在室温下用Alexa594或Alexa488标记的抗兔二抗（按1:300稀释）孵育视网膜2小时，以可视化目标抗原（图3D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤
	<ol>
		<li>用1× PBS连续清洗三次，每次5分钟，以去除过量的二抗，减少非特异性结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片
	<ol>
		<li>将免疫染色后的视网膜轻轻转移至玻璃载玻片上，小心展平，以尽量减少折叠或变形。</li>
		<li>在视网膜中央滴加少量抗荧光淬灭封片剂，确保其在组织上均匀分布。</li>
		<li>小心将盖玻片覆盖在样本上，避免产生气泡（图3E、F）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像处理
注意：将图像导入RGC自动计数软件并开始计数。整个视网膜中BRN3A阳性细胞的数量可在数分钟内获得。请从GitHub下载AutoCount软件（https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs）。请按照以下详细的软件安装步骤操作：
<ol>
	<li>从 GitHub 链接下载代码。将获得一个名为 &#34;Intelligent-quantifying-RGCs.zip&#34; 的文件。解压该文件。</li>
	<li>从 云盘（参见 材料表）下载必要的文件并解压。下载的文件名为 &#34;yolov5_cpu&#34;。将此压缩包解压至当前文件夹，以避免出现意外问题。</li>
	<li>找到步骤1中的 Config&#160; 文件，并修改其内容，使其指向 &#34;yolov5_cpu&#34; 的路径。 
	注意：例如，如果下载的 &#34;yolov5_cpu&#34; 放置在 &#34;D:\1me\yolov5_cpu_&#34; 目录下，则需将步骤1中的 &#34;config.ini&#34; 文件修改为 &#34;D:/1me/yolov5_cpu&#34;（使用 / 而非 \）。（图4A）</li>
	<li>通过点击 userinterface.exe 打开图形化界面。首次加载可能较慢（建议以管理员身份运行）。（图4B）</li>
	<li>打开软件后，检查驱动器 C 的根目录中是否存在 &#34;pmse_plus.pt&#34; 模型文件。若不存在，请将其复制到该目录中。 
	注意：&#34;pmse_plus.pt&#34; 模型文件位于解压后的 Intelligent-quantifying RGCs 文件夹中的 &#34;yolov5&#34; 文件夹内的 weights 子文件夹中。（图4C）</li>
	<li>准备待检测的图像。 
	注意：软件每次仅允许读取一张或五张图片。读取更多图片将导致错误。</li>
</ol>
4. 自动细胞计数
<ol>
	<li>打开计数软件（图5A）。</li>
	<li>点击 打开图像 以导入图像（图5B）。</li>
	<li>点击 运行，使软件自动计数细胞（图5C）。 
	注意：软件将用红色方框标记已计数的细胞，并在右上角显示细胞数量（图5D）。</li>
</ol>

Immunostaining and AI-Based Counting of RGCs in Mouse Whole-Mount Retina

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种用于确定小鼠视网膜中所有视网膜神经节细胞（RGCs）的方法，可用于监测青光眼研究中小鼠模型RGC退行的进展。小鼠视网膜是一种精细的神经组织5，从小鼠眼球中分离完整的视网膜铺片需要反复练习。在实验过程中发现，固定时间显著影响视网膜的形态。对于约2周龄的小鼠，由于巩膜较薄且脆弱，固定20分钟即可获得良好的结果。然而，对于2个月以上的成年小鼠，20分钟的固定时间则不足。固定3小时是获得完整视网膜铺片的最佳条件。
在视网膜分离过程中，最具挑战性的步骤是将巩膜与视网膜分离10。使用两把带齿尖的镊子可以相对容易地将巩膜从视网膜上剥离。通过两把镊子夹住巩膜并将其撕开，可将巩膜撕成小片，从而与视网膜分离。
视网膜神经节细胞（RGCs）的高质量图像对于准确计数至关重要。由于视网膜具有三维结构，在平铺的视网膜样本中，并非所有RGCs都位于同一焦平面上8。当将视网膜安装在玻璃载片上时，应尽可能将其展平，以利于后续成像。在成像过程中，需在多个焦平面上采集图像，以确保覆盖整个视网膜不同区域的所有RGCs。
综上所述，本方案提供了一种标准化流程，用于自动计数平铺小鼠视网膜中的所有视网膜神经节细胞（RGC）。该方法使科研人员能够准确评估小鼠模型中RGC的退变情况，从而提高RGC定量分析的效率与准确性。这种精确性对于理解及治疗青光眼及相关疾病至关重要。

青光眼的特征是&#160;视网膜神经节细胞进行性死亡，这些&#160;对视力构成重大挑战&#160;修复1,2该疾病因其高发病率及对视力的重大影响，成为眼科研究的重点。3小鼠模型在青光眼研究中不可或缺 
研究由于&#160;其同质的遗传背景，高&#160;生殖能力，以及相似性&#160;其神经节细胞特性与人类的相似性4该方法的主要目标是准确量化小鼠模型中的视网膜神经节细胞（RGCs），这对于理解青光眼的发病机制及开发相关治疗方法至关重要。
开发该技术的原理源于对一种可靠且高效方法的需求，以评估小鼠模型中视网膜神经节细胞（RGC）的退变。传统方法（如对视网膜切片中的RGC进行标记）由于RGC在视网膜中分布不均，结果往往不可靠5。对整个视网膜的RGC进行定量能更真实地反映其数量变化，对于评估疾病进展和治疗干预至关重要。
与替代技术相比，该方法具有多项优势。例如，在正常成年小鼠视网膜中手动计数视网膜神经节细胞（RGCs），由于其RGC数量介于40,000至60,000之间，该过程可能耗时且易产生误差6,7,8我们开发的用于自动RGC计数的软件可在3分钟内实现准确计数，有望为研究人员节省大量时间。此外，所采用的基于人工智能的软件&#160;自动计数可最大限度减少偏差&#160;提高可重复性。
此外，该技术为评估不同小鼠模型和实验条件下视网膜神经节细胞（RGC）的退变提供了标准化的方法，为青光眼研究领域提供了宝贵的数据。该方法与强调通过视网膜全层铺片分析来理解疾病中视网膜变化的其他研究相一致9。
为了帮助读者判断该方法是否适用于其研究需求，需要特别指出的是，此技术对于研究青光眼或其他视网膜疾病小鼠模型中视网膜神经节细胞（RGC）退变的研究人员尤为有利。该方法可适应多种实验设置，在RGC计数方面具有高度的准确性和效率，因此非常适合小规模和大规模研究。此外，该方案设计简洁，且配有用户友好的软件，使得具备不同视网膜分析经验水平的研究人员均可便捷地使用。

<table><tbody><tr><td>1&amp;times; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594 标记的驴抗兔 IgG&amp;nbsp;（H+L）</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>抗 BRN3A 抗体 [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>AutoCount 软件</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>云盘</td><td>Google 云端硬盘链接</td><td></td><td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>云盘</td><td>百度网盘链接</td><td>提取码：g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>记号笔</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Macklin</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠视网膜神经节细胞的全层免疫染色与自动计数

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

青光眼是全球致盲的主要原因之一，其发病机制复杂，导致视力恢复困难。小鼠由于具有相对均一的遗传背景和结构上与人类相似的视网膜神经节细胞（RGCs），是研究青光眼发病机制和治疗方法的重要动物模型。在小鼠青光眼模型中，准确评估RGC损伤及治疗效果需要测定整个视网膜上的RGC数量。本实验方案介绍了一种综合性方法，包括完整视网膜的分离、使用特异性抗体标记RGCs，以及利用基于人工智能的程序对RGCs进行快速、准确的自动计数。该简化流程可高效且精确地量化小鼠视网膜中的RGC数量，有助于评估RGC的退行性变化及潜在的治疗干预效果。通过使研究人员能够评估RGC损伤的程度，本方案有助于深入理解青光眼的发病机制，并推动开发有效的治疗策略以控制和预防视力丧失。

本方案详细介绍了小鼠视网膜全层免疫染色的方法，确保组织制备精细、抗体孵育准确以及细胞自动计数可靠。该技术可实现视网膜神经节细胞（RGCs）的有效标记与定量，从而在多种实验条件下对细胞群体进行精确评估。该方法已用于野生型和青光眼模型小鼠中RGCs的计数，并获得一致的结果。代表性结果表明，正常成年小鼠在2月龄时RGCs数量约为45,000个（图6）。
为了评估人工智能软件是否能够准确量化正常和疾病模型中BRN3a标记的视网膜神经节细胞（RGC），我们建立了N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的小鼠青光眼模型7。对该模型的视网膜平铺标本进行抗BRN3A免疫染色，并使用自动计数软件对RGC进行量化。结果显示背景染色相对较高（图7）。尽管如此，该软件仍能准确识别几乎所有的RGC。在此视网膜中共识别出15,231个RGC，而正常小鼠视网膜中约有45,000–50,000个RGC，表明存在严重的神经退行性变。因此，该人工智能软件也可有效用于染色质量欠佳的视网膜中RGC的计数。
<img alt="眼球解剖过程示意图；晶状体提取、视网膜免疫标记、显微镜下RGC计数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：RGC制备流程示意图。（A）取出眼球并置于1×PBS中。（B）在冰上用4%多聚甲醛固定眼球3小时。（C）去除角膜。（D）提取晶状体。（E）用剪刀将眼杯分为4个瓣。（F）剥离巩膜，并用软毛刷轻轻清除视网膜表面的碎片。（G）使用抗BRN3A抗体对视网膜进行免疫标记。（H）利用共聚焦显微镜成像荧光信号。（I）自动计数RGC。（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>）
<img alt="小鼠眼球解剖与实验分析前处理，展示各步骤的系列图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：整装小鼠视网膜的分离。（A）通过颈椎脱位法处死小鼠。（B）将小鼠置于平坦的表面上。（C）使用剪刀小心取出眼球。（D）将眼球轻轻放入1× PBS中。（E）用镊子夹住角膜边缘固定眼球。（F）用针在角膜边缘做一小切口。（G）去除角膜后，移除碗状结构。（H）用镊子小心取出晶状体。（I）沿角膜边缘向视神经方向在巩膜上做一小切口，注意避免损伤视网膜。（J）用镊子沿切口撕开巩膜。（K）用画笔将视网膜展平并清理干净。（L）用冰冷的甲醇迅速固定展平的视网膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜样品制备过程：移液、载玻片封片、显微镜载物台设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠视网膜全层免疫染色。（A）用1× PBS洗涤后，视网膜用封闭缓冲液进行封闭。（B）视网膜在4 °C下与一抗孵育过夜。（C）用1× PBS洗涤视网膜三次。（D）视网膜在室温下与二抗孵育2小时。（E）将视网膜神经节细胞面向上封片于玻璃载玻片上。（F）使用激光共聚焦显微镜采集图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="YOLOv5 的目录结构和模型文件位置设置，强调配置文件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：自动计数软件的安装。（A）步骤 1：更新文件路径至“yolov5_cpu”目录。（B）启动图形界面。（C）验证模型文件是否存在于 C 盘根目录中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过图像处理软件分析玉米叶片图案；包括分割和识别。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：自动RGC计数软件的操作。 （A）打开计数软件。（B）点击OPEN IMAGE按钮以导入图像。（C）点击RUN按钮以启动自动计数。（D）被计数的细胞用红色方框标记，细胞数量显示在右上角。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视网膜神经元分析；荧光显微镜图像，细胞核经标记以进行细胞计数比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）的自动计数。 上图（左）显示了使用抗BRN3A抗体对平铺视网膜进行免疫染色的代表性结果；上图（右）显示了利用先前开发的软件对RGCs进行自动计数的结果。比例尺：100 µm。上图中的插图部分被放大后分别显示于下图中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="利用红色叶绿素和绿色荧光蛋白标记物进行植物组织的荧光显微观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：在NMDA诱导的青光眼小鼠模型中进行RGC计数。 左图：视网膜全层铺片的整体图像，显示由人工智能软件识别的RGC。右图：视网膜部分区域的放大视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了分离小鼠全 mount 视网膜并进行免疫染色以标记所有视网膜神经节细胞（RGCs）的操作步骤。随后通过成像并利用基于人工智能的软件自动计数 RGCs，为定量分析整个小鼠视网膜中的 RGCs 提供了一种简便、快速且准确的方法。

青光眼是全球致盲的主要原因之一，其发病机制复杂，导致视力恢复困难。小鼠作为……

我们的研究范围是利用小鼠作为青光眼研究的动物模型，精确评估小鼠视网膜中青光眼的状况。我们需要确定视网膜中有多少视网膜神经节细胞。整个小鼠视网膜中大约有 50,000 个视网膜神经节细胞。如果手动计数，可能需要花费八到十个小时。而采用自动计数方法可在几分钟内完成，可大大节省人力和时间。未来，我们实验室将专注于青光眼治疗的研究。我们将使用不同的青光眼小鼠模型来测试多种治疗方法。本方案中描述的方法特别适用于治疗效果的评估。在通过颈椎脱位处死小鼠后，进行眼球摘除和眼球组织处理，使用蓝色标记笔在眼球背侧的角膜边缘做标记，以确保解剖过程中组织方向的准确性。使用剪刀去除附着在眼球上的残留肌肉组织。然后，将去眼球放入一个装有 PBS 的 2 毫升圆底微量离心管中。接着，将眼球转移至另一个含有新配制的 4% 多聚甲醛的 2 毫升离心管中，在 4 摄氏度条件下固定 10 分钟。在解剖显微镜下，使用精细镊子在角膜上做一个小切口。将眼球放回固定液中，在4°C下孵育3小时，以保存组织形态。使用精细手术剪刀切除角膜和晶状体：在角膜缘（即角膜与巩膜的交界处）周围做一个约1毫米的小切口。仔细沿角膜周缘剪开，完全切除角膜以暴露其下方结构。接着，使用精细镊子轻轻夹住晶状体并小心将其从周围组织中提起，避免损伤视网膜。进行巩膜切口时，使用精细眼科剪在巩膜上精确剪出一个切口，以便后续解剖操作。接下来，进行视网膜分离时，将有齿镊插入巩膜与视网膜之间的切口处。轻轻夹住巩膜边缘，避免用力过大，以防撕裂组织。通过沿巩膜与视网膜交界处移动镊子，逐步扩大切口。使用镊子的齿状部分小心地将巩膜与视网膜分离，避免损伤视网膜。接着，用锋利的剪刀将视网膜切成四个大致相等的瓣状。用软毛刷轻轻展开分离的视网膜，并仔细清除其表面的碎片。从小鼠中分离出完整的眼底视网膜后，用 PBS 轻柔振荡洗涤 5 分钟。将洗涤后的视网膜浸入封闭缓冲液中，封闭 30 分钟。孵育结束后，弃去封闭缓冲液，加入一抗 BRN3A。将视网膜在4°C下孵育过夜，以实现特异性抗原-抗体结合。次日，用PBS洗涤视网膜三次，每次5分钟，随后加入Alexa 594或Alexa 488标记的抗兔二抗，室温孵育2小时，以显示目标抗原。免疫染色完成后，用PBS洗涤视网膜，然后将其轻轻转移至载玻片上。展平视网膜以尽量减少折叠或变形。将盖玻片置于固定好的视网膜上，确保不产生气泡。从 GitHub 链接下载代码，然后从云盘下载必要文件并解压缩。找到 config.ini 文件，并修改其内容以指向 Yolo V5 CPU 路径。然后，单击 userinterface。exe 以打开图形界面。检查 pmse_plus.pt 模型文件是否位于 C 盘根目录下。若不存在，请从 Yolo V5 文件夹的 waits 文件夹中复制该文件。打开细胞计数软件。点击“打开图像”以导入图像，然后点击“运行”，使软件自动计数细胞。自动细胞计数软件在N-甲基-D-天冬氨酸诱导的青光眼小鼠模型中准确识别出15,231个视网膜神经节细胞，与正常视网膜中约45,000至50,000个视网膜神经节细胞相比，显示出显著的细胞丢失。

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小鼠视网膜神经节细胞的全支架免疫染色和自动计数

本视频演示了使用流式细胞术分离小鼠原代视网膜神经节细胞（RGCs）的操作流程。该方法可为未来RGCs的研究提供支持，旨在更深入地理解神经退行性疾病中功能性RGCs丢失所导致的视力显著下降机制。...

使用荧光激活细胞分选法分离小鼠视网膜神经节细胞

来源：Lani-Louzada, R.，等．大鼠手术诱导性青光眼的角膜缘血管丛全周烧灼术．J. Vis. Exp.

烧灼诱导眼内高压后视网膜神经节细胞胞体的定量分析

来源：Wang, Z., 等. 小鼠视网膜经瞳孔双光子活体成像. J. Vis. Exp.

活体小鼠视网膜的双光子成像

来源： Laboissonniere, et. al．视网膜神经节细胞特定亚群的单细胞RNA测序．J. Vis. Exp. (2017)。...

通过荧光示踪鉴定小鼠视网膜神经节细胞亚型

新生小鼠视网膜为血管生成提供了一个特征明确的生理学模型，可在体内环境中研究不同基因或药物对血管生成的调控作用。准确可视化血管丛的免疫荧光染色对于此类研究的成功至关重要。...

对新生小鼠视网膜进行整体免疫荧光染色以研究血管生成 在体内的

免疫组织化学实验方案用于研究特定蛋白质在视网膜中的定位。钙成像技术用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。...

大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

数百万人患有导致不可逆失明的视网膜退行性疾病。这些疾病的一个共同特征是视网膜神经节细胞（RGCs）的丧失。本详细实验方案描述了通过流式细胞术结合阳性与阴性筛选方法分离原代小鼠RGCs的技术。...

通过流式细胞术分离原代小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色实验方法，适用于整体视网膜标本，以及用于定量测量在增殖性和非增殖性视网膜病变中常发生变化的血管参数所需的相关实验方案。...

非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

本文提供了一种用于制备啮齿类动物眼球组织切片的组织学实验方案。采用该方法，可在光学显微镜下清晰观察和评估内层视网膜。本方案适用于小鼠和大鼠的眼球组织处理。...

制备与分析大鼠和小鼠眼球组织学切片以评估视网膜

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

学习小鼠视网膜全支架免疫染色与AI自动计数技术，用于快速定量视网膜神经节细胞。该方法可准确识别超过15000个RGCs，显著提高青光眼研究效率并减少人工误差。

小鼠视网膜神经节细胞的全层免疫染色与自动计数

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