通过 Yeast Surface Display 进行蛋白质工程
2024年11月29日
该方案描述了进行酵母表面展示选择活动以富集与目标抗原结合的蛋白质变体的基本步骤。
在我的实验室中，我们正在通过将蛋白质工程与细胞工程相结合来设计下一代细胞疗法。因此，我们设计蛋白质成分以获得新功能或改进现有功能，然后将这些无效蛋白整合到细胞治疗中。我们进一步开发了用于专业应用的使用表面显示，包括蛋白质稳定性工程、小分子调节蛋白质开关的工程以及癌症相关激活受体确认的特异性靶向。
与其他显示技术（如噬菌体或核糖体显示）相比，酵母表面显示的优势在于分选过程中文库的流式细胞术可视化以及对选择条件的精确控制，例如抗原浓度和分选门的严格性。首先，通过将 10 μL 生物素结合剂磁珠重悬于 990 μL PBSA 中，为第一次磁珠选择准备磁珠。洗涤时，将试管放在磁力架上 2 分钟，打开盖子。
然后小心地去除上清液。将洗涤后的磁珠重悬于 1.5 mL微量离心管中，加入含 6.7 至 33 皮摩尔生物素化抗原的 1 mL PBSA 中。孵育后，将试管放在磁力架上 2 分钟，打开盖子，取出上清液，用 1 毫升 PBSA 洗涤加载抗原的微珠。
珠子沉淀后，取出 PBSA。然后将加载抗原的珠子重新悬浮在 50 微升 PBSA 中。准备细胞、抗原珠和用于阴性选择的熊珠溶液。
洗涤后，将抗原珠重悬于 50 微升 PBSA 中，并将熊珠重悬于 150 微升 PBSA 中。对于第一次阴性选择，将 50 微升洗涤的裸珠添加到 950 微升 PBSA 中洗涤的细胞中，并在 4 摄氏度下孵育混合物 1.5 小时。孵育后，将含有 bear bead 细胞悬液的试管放在磁力架上，盖子打开。
将盖子中的任何液体移液到试管中，等待 2 分钟。然后将未结合的细胞转移到新鲜的微量离心管中，并加入 50 μL 洗涤过的熊珠。三轮阴性选择后，向细胞中加入 50 μL 载有抗原的微珠溶液。
在 4 摄氏度下孵育 2 小时。现在将含有抗原负载珠的细胞放在磁力架上，盖子打开。将盖子中的任何液体移液到试管中。
等待 2 分钟，然后丢弃未结合的单元格。按照第一次抗原微珠选择所述执行所有剩余步骤。经过 3 次阴性和 1 次阳性选择后，将细胞快速重悬于 1 mL SDCAA 中，并转移至含有更大体积 SDCAA 的摇瓶中。
在酵母文库中诱导 SGCAA 中蛋白质的表面表达过夜后，沉淀足够的细胞以覆盖 10 倍的多样性并丢弃上清液。将沉淀重悬于 PBSA 中，并将其转移到微量离心管中。在每管中使用 3000 万个细胞进行染色。
根据多样性准备所需数量的试管，包括一根不含抗原的对照试管。然后在室温下以 2000 x g 的离心力离心试管 5 分钟。将沉淀重悬于 200 微升含有抗原的 PBSA 中，并在 4 摄氏度下孵育 1 小时。
再次进行离心后，从沉淀中去除 PBSA。接下来，将细胞重悬于 100 μL 含有抗体的冷 PBSA 中，用于展示染色和抗原检测。在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。
孵育后，将细胞在 4 摄氏度下以 2000 x g 离心 5 分钟。向沉淀中加入 1 毫升 PBSA，然后重复离心。然后去除大部分上清液，只留下 20 至 30 微升，以防止沉淀变干。
在分选前将沉淀重悬于冷 PBSA 中。现在将细胞直接分选到 SDCAA 培养基中。分选后，将细胞转移至含有较大体积 SDCAA 培养基的摇瓶中，并在 30 摄氏度下以 180 RPM 振荡孵育。
概述
本协议描述了进行酵母表面展示选择活动的关键步骤，以富集与感兴趣抗原结合的蛋白质变体。该方法允许在分选过程中精确控制选择条件和流式细胞术可视化。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质工程
- 细胞工程
- 治疗开发
背景
- 酵母表面展示是蛋白质工程的强大工具。
- 它使得在分选过程中可视化文库。
- 允许控制抗原浓度和分选严格性。
- 用于蛋白质稳定性工程和靶向治疗等应用。
研究目的
- 富集与特定抗原结合的蛋白质变体。
- 提高细胞治疗的效率。
- 开发由小分子调节的新型蛋白质开关。
使用的方法
- 生物素结合磁珠的制备。
- 使用洗涤的裸珠和细胞进行负选择。
- 使用载有抗原的珠进行正选择。
- 通过流式细胞术对富集的细胞进行分选。
主要结果
- 成功富集与抗原结合的蛋白质变体。
- 证明了对选择条件的控制。
- 高效回收所需蛋白质变体以供进一步研究。
结论
- 酵母表面展示对蛋白质变体选择有效。
- 为开发下一代治疗提供了一个稳定的平台。
- 促进蛋白质工程和治疗应用的进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
Yeast surface display enables rapid, high-fidelity engineering of protein variants with improved or novel binding properties, directly supporting early-stage therapeutic discovery. The method's integration of phenotype-genotype linkage and flow cytometric selection enhances predictive confidence in target validation and lead identification. This platform is broadly accessible and scalable, positioning it as a reusable capability for protein engineering pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting protein variants with desired binding profiles.
- Supports biological de-risking through precise control of selection stringency and antigen concentration.
- Facilitates functional target validation by linking protein phenotype to genotype for downstream analysis.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by enriching high-affinity binders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast-displayed protein libraries for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and enhances reproducibility via flow cytometric visualization and sorting.
- Enables quantitative assessment of binding affinity and specificity for reliable compound evaluation.
- Supports scalable enrichment and reuse of engineered protein variants across campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered proteins with disease-relevant targets for translational continuity.
- Provides a robust platform for preclinical validation of protein-based therapeutics.
- Reduces mechanistic ambiguity by enabling selection for stability and functional activity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative enrichment data.
Pipeline & Workflow Integration
Yeast surface display fits at the intersection of early discovery, lead identification, and preclinical validation, enabling iterative optimization of protein therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by selecting for functional protein variants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for affinity and specificity assessment.
- Analytics: Provides flow cytometric and sequencing data to compare variant performance across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by generating candidates with validated binding properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to diverse protein engineering objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein engineering.
- Operational Value: Standardizes and streamlines selection workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of protein therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and flow cytometry for optimal execution.
- Needs access to flow cytometric instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of selection and sorting protocols.
- Adaptable to various protein targets and model systems with protocol adjustments.
- Dependent on library diversity and antigen availability for campaign success.
