Name: 血浆来源的细胞外囊泡的分离、表征和蛋白质组学分析用于心血管生物标志物的发现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 学习从人血浆中分离和表征细胞外囊泡的方法，用于心血管疾病的生物标志物发现。该方案采用LC-MS/MS蛋白质组学分析，确保EV完整性以获得可重复的临床结果。

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作者感谢Heidi Deigentasch、Amelie Werner和Elisabeth Mertz在本项目期间提供的组织支持。

本方案纳入了一个示例性患者队列，包括三名无明显或潜在心血管疾病迹象的健康对照者，以及两名非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者。研究已获得海德堡大学医学院机构审查委员会的批准（IRB批准号：S-351/2015），所有患者在入组前均签署了书面知情同意书。患者根据初始临床表现、病史及诊断检测结果，从海德堡大学医院心内科胸痛门诊招募。
健康对照组的纳入标准包括非典型或非特异性临床表现、心脏生物标志物水平在正常范围内、无心血管疾病病史，以及任何进一步诊断检查结果正常。排除标准包括过去五年内有恶性肿瘤或细胞毒性治疗史、血液透析史、家族性高脂血症综合征，以及任何心血管疾病病史。非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）的诊断依据现行指南进行。12，通过冠状动脉造影证实存在血流动力学显著的冠状动脉狭窄。每位患者从肘前静脉采集最多36 mL血液，置于含柠檬酸盐的采血管中 通过 标准静脉采血13，并将血液样本立即在4 °C条件下运输以进行后续处理。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 使用差速离心法分离细胞外囊泡
注意：采用差速离心法从人血浆样本中分离细胞外囊泡（EV）。通过两次超速离心（UC）步骤，逐步增加离心力，以最大程度提高所得EV沉淀物的纯度。
<ol>
	<li>血浆分离
	<ol>
		<li>采集全血样本后，需在120分钟内开始处理，并保持样本在4 °C冷藏，以确保血浆中细胞外囊泡（EV）的完整性。使用含柠檬酸盐的采血管（0.106 mol/L 柠檬酸盐）以防止血液凝固。</li>
		<li>将9 mL抗凝全血与预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）按1:1体积比稀释，以降低黏度。随后加入5 mL密度梯度介质（1.077 g/mL），用于离心过程中的分离。</li>
		<li>在4 °C条件下，以600 × g离心25–30分钟。小心吸取每根离心管上层的血浆部分，转移至专用离心管中。可继续进行后续步骤，或于-80 °C冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除细胞碎片和凋亡小体
	<ol>
		<li>使用配备固定角转子的超速离心机，在4 °C条件下以20,000 × g离心血浆15分钟，过程中不启用刹车。离心后，管底应可见由细胞碎片和凋亡小体形成的沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EV分离
	<ol>
		<li>将上清液转移至新管中。在4 °C条件下以100,000 × g超速离心2小时（不启用刹车），以分离EV，EV将在管壁形成可见沉淀。</li>
		<li>使用电子移液器小心吸走上清液，保留约1 mL去除了EV的血浆。对剩余液体改用1000 µL移液器，缓慢吸取，避免扰动EV沉淀。吸取过程中逐渐倾斜离心管，确保管内无残留血浆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下游分析前准备
	<ol>
		<li>根据下游分析需求重悬分离得到的EV沉淀：如用于纳米颗粒追踪分析，将来自9 mL全血的EV沉淀重悬于200 µL PBS中；如用于LC-MS/MS分析，将来自36 mL全血的EV沉淀重悬于50 µL含1%蛋白酶/磷酸酶抑制剂的1× RIPA缓冲液中。</li>
		<li>将重悬后的EV沉淀转移至1.5–2 mL离心管中。可于-80 °C保存直至进一步分析，或根据需要立即进行后续操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 纳米颗粒示踪分析
注意：采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对人血浆样本中细胞外囊泡（EV）的平均大小分布进行定量分析。NTA 是一种基于激光的检测方法，通过分析纳米颗粒的布朗运动来实现检测。
<ol>
	<li>NTA 工作液的稀释
	<ol>
		<li>将 EV 储存液（用 200 μL PBS 重悬的 EV 沉淀）用预冷的 PBS 按 1:10、1:50、1:100 和 1:200 的比例稀释。制备多种工作稀释液，以确定在纳米颗粒追踪过程中每帧获得 10–100 个纳米颗粒的最适稀释倍数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行 NTA
	<ol>
		<li>打开 NTA 仪器，并在连接的计算机上启动相应的软件。将样品室放入激光腔内，点击 Start Camera 以启动摄像头。</li>
		<li>用注射器吸取 1 mL PBS，将注射器插入前端管道，彻底冲洗管路系统，确保样品室中无残留气泡。通过摄像头监控是否存在气泡或污染颗粒。</li>
		<li>用 1 mL 注射器吸取已制备的 EV 工作稀释液，并将其注入样品室中。</li>
		<li>在 Capture 和 Process 选项卡中调节 Screen Gain，使其与显示器亮度匹配。调整 Camera Level，以便在屏幕上清晰区分纳米颗粒。</li>
		<li>在 Process 选项卡中设置合适的 Detection Threshold，以调节区分颗粒与背景噪声的灵敏度。在同一实验的所有测量中保持该值恒定。</li>
		<li>使用仪器两侧的调焦旋钮调节摄像头焦距，直至屏幕上的纳米颗粒图像清晰锐利。</li>
		<li>在 Hardware 设置中为所有测量设定恒定温度（理想为 22 °C），因为布朗运动具有温度依赖性。</li>
		<li>点击 Run 按钮开始测量。在弹出窗口中输入样品编号和溶剂信息。</li>
		<li>每份样品至少记录三个 30 秒的视频。每次测量之间轻微推进样品，以获取纳米颗粒溶液的代表性数据。若配有注射泵，可设定恒定流速并进行连续记录。</li>
		<li>记录完成后，软件将自动计算纳米颗粒的浓度和粒径分布。点击 Change 输入样品所用的稀释倍数，然后点击 Export 保存结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>使用统计分析软件对输出文件进行结果分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对细胞外囊泡蛋白质组进行无标记分析
注意：采用非标记法EV蛋白质组分析，首先通过凝胶电泳对膜裂解后的EV蛋白进行蛋白质分离。经胶内胰蛋白酶消化后，使用LC-MS/MS分析肽段，并将各质谱图与人类蛋白质组数据库进行比对。值得注意的是，若希望对EV裂解物进行非靶向分析，建议采用无需预先选择特定分子量范围的鸟枪法蛋白质组学，此时本方案中的步骤3.1.1–3.1.7可省略。
<ol>
	<li>凝胶内胰蛋白酶消化
	<ol>
		<li>按照制造商说明，将细胞外囊泡（EV）重悬于1× RIPA缓冲液中，并加入Laemmli上样缓冲液（参见材料表）。将样品在95 °C下煮沸5分钟。</li>
		<li>将添加了上样缓冲液的EV样品与蛋白ladder一同上样至4%–12% Bis-Tris凝胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）14。用考马斯亮蓝染色1–4小时以观察蛋白条带。随后用水浸泡过夜进行脱色。</li>
		<li>使用手术刀片从凝胶中切下含有目标蛋白的考马斯亮蓝染色条带区域。</li>
		<li>用60 µL体积比为1:1（v/v）的50 mM三乙基铵碳酸氢盐缓冲液（TEAB）和乙腈（ACN），pH 8.5，洗涤凝胶块10分钟。再用60 µL ACN分三次、每次10分钟使凝胶块脱水收缩。随后用60 µL 50 mM TEAB（pH 8.5）再次洗涤。</li>
		<li>在100 mM TEAB中加入10 mM二硫苏糖醇（DTT），于57 °C孵育30分钟以还原蛋白，然后将凝胶块脱水。</li>
		<li>在100 mM TEAB中加入10 mM碘乙酰胺（IAA），于25 °C避光孵育20分钟以烷基化蛋白。</li>
		<li>用60 µL 100 mM TEAB洗涤凝胶块，并用60 µL ACN分两次、每次10分钟进行脱水收缩。</li>
		<li>向干燥的凝胶块中加入适当浓度的50 mM TEAB胰蛋白酶溶液。37 °C孵育4小时。加入20 µL 0.1%三氟乙酸（TFA）终止反应。</li>
		<li>用30 µL体积比为1:1（v/v）的0.1% TFA和ACN孵育30分钟，提取生成的肽段。用20 µL ACN脱水20分钟，再用30 µL 100 mM TEAB洗涤20分钟。</li>
		<li>用20 µL ACN分两次、每次20分钟对凝胶块进行脱水收缩。</li>
		<li>将每次提取步骤收集的上清液在真空离心浓缩仪中浓缩，并将样品溶解于15 µL 0.1% TFA中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
	<ol>
		<li>使用高分辨率液相色谱-质谱仪联用电喷雾离子阱分析器进行纳流液相色谱-串联质谱分析。</li>
		<li>以0.1%甲酸（FA）/1%乙腈（ACN）作为流动相A，0.1%甲酸/89.9%乙腈作为流动相B。</li>
		<li>在25分钟线性梯度中分离肽段：从3%流动相B开始，21分钟内升至23% B，再用4分钟升至38% B，最后以95% B冲洗。</li>
		<li>质谱仪采用数据依赖性采集模式，自动在MS和MS2之间切换。在m/z 400处分辨率为60,000的条件下采集MS谱图（m/z 400–1600），对最多15个前体离子进行MS2分析，归一化碰撞能量设为27，隔离宽度为1.4 m/z。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质数据库搜索
	<ol>
		<li>使用Proteome Discoverer 2.5软件中的Sequest HT算法，将MS/MS谱图搜索比对至Swiss-Prot Homo sapiens蛋白数据库（UP000005640，2020年6月版）以及一个自定义污染物数据库（MaxQuant软件组成部分，MPI Martinsried15,16）。</li>
		<li>程序参数设置如下：碎片离子质量容差设为0.02 Da，母离子质量容差设为5 ppm。指定胰蛋白酶为消化酶，半胱氨酸的固定修饰为羧甲基化，甲硫氨酸的氧化、天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺作为可变修饰。同时将乙酰化、甲硫氨酸丢失及其组合设为蛋白质末端的可变修饰。</li>
		<li>采用前体离子定量模式进行肽段定量，使用Top N平均法（n = 3）计算蛋白质丰度17。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Cardiovascular Biomarker Studies Using Plasma Extracellular Vesicle Proteome

<ol><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367, 6478(2020).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (22), 2180-2181 (2018).</li>
<li>Zara, M., Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., Barbieri, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cardiovascular diseases.</a> Diagnostics (Basel). 10 (11), 943(2020).</li>
<li>Ontoria-Oviedo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+hypoxic+ac10+cardiomyocytes+modulate+fibroblast+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by hypoxic ac10 cardiomyocytes modulate fibroblast cell motility.</a> Front Cardiovasc Med. 5, 152(2018).</li>
<li>Zara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+exosome+profile+in+st-elevation+myocardial+infarction+patients+with+and+without+out-of-hospital+cardiac+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma exosome profile in st-elevation myocardial infarction patients with and without out-of-hospital cardiac arrest.</a> Int J Mol Sci. 22 (15), (2021).</li>
<li>Anselmo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+hypoxic+stress+mediates+functional+cardiac+extracellular+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Myocardial hypoxic stress mediates functional cardiac extracellular vesicle release.</a> Eur Heart J. 42 (28), 2780-2792 (2021).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: A systematic review.</a> Cardiovasc Res. 111 (4), 322-337 (2016).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+Novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110 (3), 483-495 (2012).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+the+early+diagnosis+of+acute+coronary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for the early diagnosis of acute coronary syndrome.</a> J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 884-898 (2013).</li>
<li>Gidlof, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+extracellular+vesicles+reveals+additional+diagnostic+biomarkers+for+myocardial+infarction+compared+to+plasma+alone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of extracellular vesicles reveals additional diagnostic biomarkers for myocardial infarction compared to plasma alone.</a> Sci Rep. 9 (1), 8991(2019).</li>
<li>Byrne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+guidelines+for+the+management+of+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J+Acute+Cardiovasc+Care%22%5BJournal%5D)">ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes.</a> Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 10, (2023).</li>
<li>Garcia-Castrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+blood+sampling+in+emergency+departments+from+the+European+Society+for+Emergency+Medicine+%28EUSEM%29%2C+European+Society+for+Emergency+Nursing+%28EUSEN%29%2C+and+European+Federation+of+Clinical+Chemistry+and+Laboratory+Medicine+%28EFLM%29+working+group+for+the+pre-analytical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Recommendations for blood sampling in emergency departments from the European Society for Emergency Medicine (EUSEM), European Society for Emergency Nursing (EUSEN), and European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) working group for the pre-analytical phase.</a> Clin Chem Lab Med. 62 (8), 1538-1547 (2024).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+maxquant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the maxquant environment.</a> J Proteome Res. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maxquant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Maxquant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Blein-Nicolas, M., Zivy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thousand+and+one+ways+to+quantify+and+compare+protein+abundances+in+label-free+bottom-up+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Thousand and one ways to quantify and compare protein abundances in label-free bottom-up proteomics.</a> Biochim Biophys Acta. 1864 (8), 883-895 (2016).</li>
<li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination%3A+Results+of+the+international+society+on+thrombosis+and+haemostasis+SSC+collaborative+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: Results of the international society on thrombosis and haemostasis SSC collaborative workshop.</a> J Thromb Haemost. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li>
<li>Nieuwland, R., Siljander, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+study+extracellular+vesicles+in+human+blood+plasma+and+serum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum.</a> J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).</li>
<li>Lacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pre-analytical+parameters+on+the+measurement+of+circulating+microparticles%3A+Towards+standardization+of+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: Towards standardization of protocol.</a> J Thromb Haemost. 10 (3), 437-446 (2012).</li>
<li>Coumans, F. aW., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
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<li>Zhang, X., Takeuchi, T., Takeda, A., Mochizuki, H., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+serum+and+plasma+as+a+source+of+blood+extracellular+vesicles%3A+Increased+levels+of+platelet-derived+particles+in+serum+extracellular+vesicle+fractions+alter+content+profiles+from+plasma+extracellular+vesicle+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of serum and plasma as a source of blood extracellular vesicles: Increased levels of platelet-derived particles in serum extracellular vesicle fractions alter content profiles from plasma extracellular vesicle fractions.</a> PLoS One. 17 (6), e0270634(2022).</li>
<li>Gelibter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+storage+on+extracellular+vesicles%3A+A+systematic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study.</a> J Extracell Vesicles. 11 (2), e12162(2022).</li>
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<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cell Mol Life Sci. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
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<li>Palviainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+human+plasma+and+serum+are+carriers+of+extravesicular+cargo-implications+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from human plasma and serum are carriers of extravesicular cargo-implications for biomarker discovery.</a> PLoS One. 15 (8), e0236439(2020).</li>
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</ol>

EG 收到了来自罗氏诊断（Roche Diagnostics）、BRAHMS 赛默飞世尔（BRAHMS Thermo Scientific）、拜耳维他有限公司（Bayer Vital GmbH）、阿斯利康（AstraZeneca）、礼来德国公司（Lilly Deutschland）和勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）的讲课酬金；他获得了罗氏诊断和第一三共（Daiichi Sankyo）的机构研究资助，并在提交本研究之外担任罗氏诊断、BRAHMS 赛默飞世尔、阿斯利康、诺华（Novartis）和勃林格殷格翰的顾问。JBK 收到了德国心血管研究中心（DZHK）和罗氏诊断的项目相关资助。其余作者声明本项研究不存在利益冲突。

本方案提供了一种贴近实际应用的、逐步详述且可直接使用的血浆细胞外囊泡（EV）分离与表征方法，并介绍了适用于整合到常规临床实践中的无标记蛋白质组分析技术。对血浆样本中EV的分离采用统一且详细的描述并严格遵循标准化操作流程，对于确保实验结果的可重复性至关重要。现有文献表明，分析前条件会显著影响后续对EV分离物的测量及下游分析。因此，必须及时启动来源于血浆的EV分离流程，理想情况下应在采血后120分钟内开始处理，并在样品操作过程中尽量减少震荡18。采集的血液可在4 °C下短期保存；然而，除了时间和机械扰动外，较低温度也可能促进血小板活化，从而导致血小板来源的EV释放19,20。尽管这些EV可能构成总体EV产量中的丰富组分，但通过特定的分析前控制措施可有效避免其污染21,22,23。在血液采集管中...

细胞外囊泡（EV）尚无统一命名标准，是一类由脂质双分子层包裹的纳米级颗粒，可由多种细胞类型释放，且不具备自我复制能力1。该类囊泡包含多种亚群，其中外泌体（exosomes）来源于内体系统，是EV的一个亚群，直径通常在约40 nm至160 nm之间2。EV可在多种体液中被检测到3，通过传递蛋白质、mRNA、微小RNA（microRNA）和脂质等多种活性生物分子，介导细胞间通讯。因此，EV可通过其表面特异性标记物及所携带的生物分子反映来源细胞的信息，其特性受母体细胞状态及其微环境的显著影响4。这些特征使得EV作为生物标志物的潜力日益受到关注，尤其在心血管疾病领域具有重要研究价值。
大量体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，心肌缺氧应激会导致细胞外囊泡（EV）释放增加5,6,7。目前关于EV内容物的研究主要集中在EV结合的微小RNA（microRNA），其在多种心血管疾病诊断中具有作为生物标志物的潜力8,9,10。相比之下，关于循环EV蛋白质组的研究仍相对较少，针对心血管疾病患者血浆EV的研究则更为有限。在两项针对心肌梗死患者血浆来源EV的综合性研究中，作者鉴定出一种由缺血诱导的、具有潜在诊断价值的EV蛋白质组特征谱6,11。
细胞外囊泡（EV）的方法学处理历来具有挑战性，目前尚无关于EV分离、表征和定量最佳方法的明确建议。常用的EV分离方法包括差速超速离心、密度梯度离心以及过滤法，如尺寸排阻色谱法1。根据当前的共识指南，EV分离物的表征应至少包含三种典型EV表面蛋白标志物（如四跨膜蛋白或膜联蛋白）的证据，并结合成像技术1。在蛋白质水平上检测EV内容物时，最常使用基于抗体的方法，如蛋白质印迹（Western blot）或酶联免疫吸附测定（ELISA）。
鉴于循环细胞外囊泡（EV）的分离与处理在方法学上存在诸多挑战，本实验方案提供了一条从患者招募和样本采集，到后续EV的分离、表征及血浆EV分离物定量的完整技术路径。此外，本研究展示了一种工作流程：针对就诊于德国西南部一家三级医疗中心急诊科（胸痛门诊）的患者，立即分离其血浆来源的EV，并采用非标记液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析疾病特异性血浆EV蛋白质组。该方法旨在实现高通量分析，以识别在大规模患者队列中，不同缺血性、先天性或（自身）免疫性心血管疾病患者初诊时以及疾病进展或缓解过程中，EV结合蛋白的差异富集情况。这一蛋白质组学筛查策略致力于发现与特定疾病通路相关的EV特异性蛋白富集模式，最终目标是揭示新型的EV结合蛋白生物标志物，从而提升当前心血管疾病的诊断能力及治疗监测水平。

<table><tbody><tr><td>4x Laemmli 样品缓冲液</td><td>Bio-rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA 缓冲液</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>26.3 mL 聚碳酸酯离心管（带盖组件），用于超速离心</td><td>Beckman Coulter</td><td>355654</td><td></td></tr><tr><td>5810R 台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>乙腈（ACN）</td><td>Biosolve</td><td>0001204101BS</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>99% 超纯级/质谱级甲酸 100</td><td>Biosolve</td><td>0006914143BS</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque - 1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125-5G</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Q Exactive HF 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS 电泳运行缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical&amp;nbsp;</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA 3.2 软件</td><td>Malvern Panalytical&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4&amp;nbsp;–12&amp;nbsp;% Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>NP0323</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 立式超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>521-4180</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus 预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（100X）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5872S</td><td></td></tr><tr><td>蛋白 Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.5</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 混合四极杆-Orbitrap 质谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>快速考马斯亮蓝染色液</td><td>Serva</td><td>35081.01</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ，1.9 &amp;micro;m，1 g</td><td>Dr. Maisch</td><td>r119.aq.0001</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 商品化凝胶</td><td>Thermo Fisher</td><td>NW00100BOX</td><td></td></tr><tr><td>S-Monovette&amp;nbsp;枸橼酸钠 9NC 0.106 mol/L 3.2%</td><td>Sarstedt</td><td>02.1067.001</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>Savant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swiss-Prot（Uniprot）智人（UP000005640，2020 年 6 月）蛋白数据库</td><td>UniProt</td><td>https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640</td><td></td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱用三氟乙酸（TFA）&gt;99%，100 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td></td></tr><tr><td>质谱级胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>50.2 Ti 固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC Dionex Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Biosolve</td><td>0023214102BS</td><td></td></tr></tbody></table>

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

细胞外囊泡（EV）是一类由细胞产生、具有脂质双分子层结构且不可复制的纳米颗粒。由于EV在调控细胞间通讯中发挥重要作用，并可能作为心血管疾病的有价值生物标志物，目前其在心血管研究领域受到广泛关注。然而，EV的蛋白质组及其在心血管诊断中作为生物标志物的潜力仍不甚明确。本实验方案提供了一种标准化的方法，用于从大型大学医院胸痛门诊患者血浆样本中分离和定量血浆来源的EV，并分析其携带的蛋白质成分。在常规静脉采血后，通过差速超速离心法从血浆中分离EV。利用免疫印迹技术检测EV分离物中特异性EV标志蛋白的富集情况，并通过纳米颗粒追踪分析法测定EV的平均粒径分布及血浆中EV的浓度。最后，采用超高效液相色谱-串联质谱技术对EV蛋白质组进行非标记定量分析。因此，本方案为研究血浆来源EV作为关键生物学信息载体的潜力，以及探索其作为新型生物标志物的应用提供了全面的技术路径。

采用既定的差速超速离心法，从无明显心血管疾病的患者血浆样本（n = 3）以及非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI；n = 2）患者中分离出细胞外囊泡（EV）。通过免疫印迹检测EV富集蛋白TSG-101、膜联蛋白5（Anx5）和CD9在EV分离物中的表达，并与同一患者的去EV血浆进行比较，证实了血浆EV的有效分离（图1A）。转铁蛋白作为阴性对照，在去EV的血清样本中可检测到，但在EV分离物中不可见，进一步确认了不同组分的有效分离。对分离后的血浆样本进行整合素β3（血小板常见标志物）和载脂蛋白A1（ApoA1，脂蛋白污染标志物）的免疫印迹检测，结果显示血液处理后无明显污染（补充图1）。
通过纳米颗粒追踪分析，基于布朗运动对细胞外囊泡（EV）进行鉴定和可视化（图1B）。在我们的健康患者队列中，测得每毫升血浆中平均颗粒浓度为 1.2 × 1010 ± 6.0 × 109 个颗粒（<strong ...

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。

细胞外囊泡（EV）是一类由细胞产生、具脂质双分子层结构且不可复制的纳米颗粒。目前，EV 在心血管研究领域正受到越来越多的关注……

循环细胞外囊泡作为生物标志物是生物标志物研究中的一个相对较新的领域，具有巨大的潜力。我们的方案旨在提供一种切实可行的方法，以在急诊科环境中实施细胞外囊泡结合的生物标志物发现与检测。新兴证据表明，在多种疾病背景下，细胞外囊泡及其循环中的分子内容物含有具有研究价值的蛋白质和RNA。近年来，多种新发现的细胞外囊泡包裹的生物标志物已被证实与各类心血管疾病的诊断及预后相关。在循环细胞外囊泡生物标志物研究领域，主要挑战在于细胞外囊泡的保存以及血浆采集过程中依赖于囊泡释放动态的变化。因此，有必要在临床常规操作中建立严格的标准化流程，以避免细胞外囊泡降解并确保结果的可重复性，尤其是在应用蛋白质组学等大规模分析方法时。在循环细胞外囊泡（EV）内发现蛋白质生物标志物在很大程度上取决于首次采血时间与症状出现之间的时间间隔，以及由于细胞外囊泡自然降解所致的样本储存时长。本方案提供了一套可直接操作的血浆EV分离方法，并将其引入蛋白质组学分析，以便整合到急诊科的临床工作流程中。我们后续的研究将聚焦于在本方法学中纳入不同类型的患者群体，包括失代偿性心力衰竭、心律失常或心动过速性心肌病患者，以及接受旁路手术患者的纵向研究。通过本方案，我们旨在鉴定与上述病理状态的诊断及预后相关的新型细胞外囊泡（EV）结合生物标志物。首先，使用带有固定角度转子的超速离心机对人血浆进行离心，离心过程中不得中断。待碎片和凋亡小体沉淀后，将上清液转移至新管中，并在4°C条件下以100,000 ×g超速离心2小时，过程中不得中断，以分离细胞外囊泡。超速离心后小心取出离心管。使用电子移液器轻轻吸除上清液，留下约一毫升去除了细胞外囊泡的血浆。更换为1000微升移液器，小心吸取剩余血浆，避免扰动细胞外囊泡沉淀。在移液过程中逐渐倾斜试管，确保无血浆残留，并将沉淀重悬于PBS中。接下来，用预冷的PBS以不同比例稀释细胞外囊泡储备液，使追踪过程中每帧的纳米颗粒数量达到10至100个的最终范围。打开NTA仪器，并在连接的计算机上启动相应的软件。将腔室插入激光盒中，然后点击“启动相机”以激活相机。用注射器吸取一毫升 PBS 缓冲液，并将其连接到前端管道。彻底冲洗管路系统，确保腔室内无任何气泡残留。监测摄像头，以检测是否存在气泡或污染颗粒。现在将制备好的细胞外囊泡工作液吸入1毫升注射器中，并将其注入检测室。转到“捕获”和“处理”选项卡，调节屏幕增益，使其与显示器的亮度相匹配。调整摄像头水平以增强屏幕上纳米颗粒的区分度。在处理选项卡中设置适当的检测阈值，以区分颗粒与背景噪声。通过仪器两侧的调焦旋钮调节摄像头焦距，直至屏幕上的纳米颗粒图像清晰锐利。在硬件设置中将所有测量的温度恒定为 22 摄氏度后，点击运行按钮以开始测量。每个样品至少记录三段每段 30 秒的视频。点击更改以输入样品的稀释倍数，最后点击导出以保存结果。利用纳米颗粒追踪分析技术，根据颗粒的布朗运动对其进行鉴定和可视化。分析结果显示，健康个体血浆中平均颗粒浓度为每毫升 1.2 × 10¹⁰ 个颗粒，表明存在细胞外囊泡。血浆中细胞外囊泡的平均粒径为 184.7 纳米，符合典型的细胞外囊泡尺寸范围。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

血浆来源的细胞外囊泡的分离、表征和蛋白质组学分析用于心血管生物标志物的发现

血液中存在的细胞外囊泡被认为可作为多种疾病的新型生物标志物。本文介绍了一种从外周血样本中分离大型质膜来源微囊泡的实验方案，并通过常规流式细胞术和蛋白质印迹法对其进行后续分析。...

外周血微囊泡的分离与表征

本文介绍了一种从血浆和血清中纯化外泌体的方案，可显著减少非外泌体血液蛋白的共纯化。优化后的方案包括超滤、蛋白酶处理和尺寸排阻色谱。外泌体的高效纯化有助于后续分析，包括对外泌体更准确的定量以及蛋白质组学表征。...

蛋白质消化、超滤和尺寸排阻色谱法优化人血浆和血清中外泌体的分离

本方案描述了一种可重复的方法，专为使用细胞培养上清液检测小细胞外囊泡（EV）表面表位而设计。该方法利用与识别表面抗原CD9、CD63和CD81的抗体偶联的磁珠，对EV进行特异性免疫沉淀。本方法已针对后续的流式细胞术分析进行了优化。...

细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。...

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。...

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本方案详细描述了利用功能化磁珠高效分离尿液细胞外囊泡的方法。此外，还包括后续分析步骤，如蛋白质印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。...

基于化学亲和力的生物流体细胞外囊泡分离用于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

本文提供了一种详细的方案，用于清洗和重复使用聚碳酸酯超速离心管，以进行适用于蛋白质组学实验的细胞外囊泡分离。...

聚碳酸酯超速离心管在细胞外囊泡蛋白质组学分析中的重复使用

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

本视频展示了一种在死后眼球中有效区分和解剖人玻璃体各种半透明结构的技术。...

人眼玻璃体组织成分的分离以进行蛋白质组学分析

学习从人血浆中分离和表征细胞外囊泡的方法，用于心血管疾病的生物标志物发现。该方案采用LC-MS/MS蛋白质组学分析，确保EV完整性以获得可重复的临床结果。

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

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