用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

循环细胞外囊泡作为生物标志物是生物标志物研究中的一个相对较新的领域，具有巨大的潜力。我们的方案旨在提供一种切实可行的方法，以在急诊科环境中实施细胞外囊泡结合的生物标志物发现与检测。新兴证据表明，在多种疾病背景下，细胞外囊泡及其循环中的分子内容物含有具有研究价值的蛋白质和RNA。

近年来，多种新发现的细胞外囊泡包裹的生物标志物已被证实与各类心血管疾病的诊断及预后相关。在循环细胞外囊泡生物标志物研究领域，主要挑战在于细胞外囊泡的保存以及血浆采集过程中依赖于囊泡释放动态的变化。因此，有必要在临床常规操作中建立严格的标准化流程，以避免细胞外囊泡降解并确保结果的可重复性，尤其是在应用蛋白质组学等大规模分析方法时。

在循环细胞外囊泡（EV）内发现蛋白质生物标志物在很大程度上取决于首次采血时间与症状出现之间的时间间隔，以及由于细胞外囊泡自然降解所致的样本储存时长。本方案提供了一套可直接操作的血浆EV分离方法，并将其引入蛋白质组学分析，以便整合到急诊科的临床工作流程中。我们后续的研究将聚焦于在本方法学中纳入不同类型的患者群体，包括失代偿性心力衰竭、心律失常或心动过速性心肌病患者，以及接受旁路手术患者的纵向研究。

通过本方案，我们旨在鉴定与上述病理状态的诊断及预后相关的新型细胞外囊泡（EV）结合生物标志物。首先，使用带有固定角度转子的超速离心机对人血浆进行离心，离心过程中不得中断。待碎片和凋亡小体沉淀后，将上清液转移至新管中，并在4°C条件下以100,000 ×g超速离心2小时，过程中不得中断，以分离细胞外囊泡。

超速离心后小心取出离心管。使用电子移液器轻轻吸除上清液，留下约一毫升去除了细胞外囊泡的血浆。更换为1000微升移液器，小心吸取剩余血浆，避免扰动细胞外囊泡沉淀。

在移液过程中逐渐倾斜试管，确保无血浆残留，并将沉淀重悬于PBS中。接下来，用预冷的PBS以不同比例稀释细胞外囊泡储备液，使追踪过程中每帧的纳米颗粒数量达到10至100个的最终范围。打开NTA仪器，并在连接的计算机上启动相应的软件。

将腔室插入激光盒中，然后点击“启动相机”以激活相机。用注射器吸取一毫升 PBS 缓冲液，并将其连接到前端管道。彻底冲洗管路系统，确保腔室内无任何气泡残留。

监测摄像头，以检测是否存在气泡或污染颗粒。现在将制备好的细胞外囊泡工作液吸入1毫升注射器中，并将其注入检测室。转到“捕获”和“处理”选项卡，调节屏幕增益，使其与显示器的亮度相匹配。

调整摄像头水平以增强屏幕上纳米颗粒的区分度。在处理选项卡中设置适当的检测阈值，以区分颗粒与背景噪声。通过仪器两侧的调焦旋钮调节摄像头焦距，直至屏幕上的纳米颗粒图像清晰锐利。

在硬件设置中将所有测量的温度恒定为 22 摄氏度后，点击运行按钮以开始测量。每个样品至少记录三段每段 30 秒的视频。点击更改以输入样品的稀释倍数，最后点击导出以保存结果。

利用纳米颗粒追踪分析技术，根据颗粒的布朗运动对其进行鉴定和可视化。分析结果显示，健康个体血浆中平均颗粒浓度为每毫升 1.2 × 10¹⁰ 个颗粒，表明存在细胞外囊泡。血浆中细胞外囊泡的平均粒径为 184.7 纳米，符合典型的细胞外囊泡尺寸范围。