由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

本研究介绍了一种通过使用新型ROCK抑制剂和微孔限制技术，从人iPSCs可扩展地生成均质血管类器官的改进方法。该方法提高了可重复性，并最大限度地减少了批次间的差异，适用于后续的形态学分析和疾病建模应用。单细胞测序技术已在类器官研究中被广泛用于揭示细胞群体内的基因组、表观基因组和转录组异质性及其动态变化。

组织清除和光片显微镜等三维成像技术，有助于在三维环境中快速、高分辨率地对细胞形态和组织结构进行成像。在类器官研究中，通量和标准化是关键挑战。人工操作费时费力，限制了通量，因此机器人自动化成为一种有前景的解决方案。

类器官培养的标准化，包括诱导多能干细胞的质量控制和分化方案的优化，可显著提高实验的可重复性，并最大限度减少不同批次和细胞系之间的差异。首先，将一个50毫升离心管置于冰上，依次加入胶原蛋白1溶液及其他组分，然后振荡混匀。

使用 P10 移液器，一边轻轻摇动混合溶液，一边逐滴加入 1 摩尔氢氧化钠溶液，将 pH 值调节至 7.3。向 5 毫升 Collagen 1 混合液中加入 1.25 毫升基底膜基质，轻轻混匀。接着，将 12 孔板置于冰上放置 2 分钟。

使用宽口吸头，将 Collagen 1 基底膜基质混合物缓慢加入 12 孔板中。将 12 孔板置于 37 摄氏度培养箱中孵育 2 小时，使水凝胶第一层凝固。剩余的 Collagen 1 基底膜基质混合物置于冰上，以备后续使用。

然后，将约60个细胞聚集体转移至一个1.5毫升微量离心管中，并将管子置于冰上冷却5分钟。使用P200移液枪头，小心吸除管中的培养基。逐滴加入1.5毫升Collagen 1基底膜混合物至细胞聚集体中，并使用宽口P200移液枪头轻轻吹打混匀，以重悬细胞。

将带有第一层水凝胶的培养板从培养箱转移至生物安全柜中。向固化后的水凝胶层上加入1.5毫升的聚集体悬浮液，并轻轻振荡培养板以使聚集体均匀分布。将培养板置于37°C、含5% CO₂的环境中孵育2小时。

将血管分化培养基2在37摄氏度水浴中预热20分钟。每孔加入2毫升培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。每隔三天更换新鲜的预热血管分化培养基2。

类器官表达 CD31、ERG1 和 PDGFR-β，表明存在血管内皮细胞和寄生虫。通过组织透明化后的整体免疫荧光显微镜观察血管网络。第 17 天染色的成熟类器官显示，血管网络包裹着凝胶块内的球状体。

第28天获取的类器官具有围绕球状体的血管网络，而非呈放射状扩展。