Name: 从人诱导多能干细胞生成血管类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 了解利用新型ROCK抑制剂和微孔限制技术从人诱导多能干细胞规模化生成均质血管类器官的方法。该方法显著提高批次间可重复性，适用于疾病建模和形态学分析研究。

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我们感谢哥伦比亚大学赫伯特·欧文综合癌症中心共聚焦和专业显微镜共享资源提供的技术支持，该资源部分由美国国立卫生研究院中心资助项目（P30CA013696）资助。本工作由美国国立卫生研究院资助（R21NS133635，Y.-H.L.；UH3TR002151，K. W. L.）。图1A使用BioRender绘制。

图1展示了本实验方案所涉及步骤的概览。材料表中提供了本方案所用试剂和材料的详细信息。建议所有培养基在使用前均于37 °C预热，除非另有说明。所有细胞培养相关的材料和耗材均应经过高压灭菌或为无菌状态，细胞操作应在生物安全柜中进行。此外，应仔细调节I型胶原蛋白混合物的pH值至7.3，以避免可能出现的凝固问题。
1. 人iPSC的维持
<ol>
	<li>将基底膜基质提取物置于冰上解冻，轻轻摇动瓶子以混匀溶液，并使用P1000移液器和预冷的吸头在1.5 mL微量离心管中分装成0.5 mL等份。将分装好的提取物于-20 °C保存，可保存长达1年。</li>
	<li>在冰上解冻一份基质提取物（0.5 mL）。将其与49.5 mL预冷的DMEM/F12培养基在50 mL离心管中混合。将混合液分装至6孔板的每个孔中（1.5 mL/孔），然后轻轻摇动培养板，确保液体均匀覆盖整个孔底。用封口膜密封培养板，并于4 °C保存，可保存长达1周。</li>
	<li>按照表1所述配制hiPSC扩增培养基。将完全培养基分装成40 mL/管，于-20 °C保存，可保存长达1年。</li>
	<li>在进行hiPSC培养前1小时，将预先包被的培养板放入37 °C培养箱中预热。</li>
	<li>将hiPSC扩增培养基（40 mL）在37 °C预热，并按照表2所述配制hiPSC接种培养基。</li>
	<li>将包被好的培养板从37 °C培养箱转移至生物安全柜中。将培养板中的原有培养基更换为hiPSC接种培养基（1 mL/孔）。</li>
	<li>从液氮罐中取出一支冷冻保存的hiPSC冻存管，在37 °C水浴中解冻1分钟。</li>
	<li>将细胞转移至15 mL离心管中，加入5 mL DMEM/F12培养基，随后在室温下以100 × g离心3分钟以收集细胞。</li>
	<li>吸除上清液，用1.5 mL hiPSC接种培养基重悬细胞。在15 mL离心管中轻轻吹打混匀细胞。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝溶液混合。取10 µL混合液滴加至血细胞计数板载片上，并盖上盖玻片。</li>
	<li>将载片安装至计数仪支架上，插入自动细胞计数仪中。等待仪器自动对焦，或通过屏幕上的对焦 +/- 按钮手动调节对焦。随后使用默认设置，按下采集 按钮。以活细胞密度读数作为步骤1.9制备的hiPSC悬液的浓度。</li>
	<li>每孔接种2 × 105个细胞，并确保细胞在孔内均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养，24小时后更换为hiPSC扩增培养基（1.5 mL/孔）。</li>
	<li>每天更换培养基，直至细胞融合度达到80%。定期观察细胞形态和克隆大小，确保无明显自发分化。若观察到广泛（&#62;5%）的自发分化现象，则弃去该培养物，并使用新的一批hiPSC重新开始培养。</li>
</ol>
2. 胚状体形成（第0天）
<ol>
	<li>第0天，将DMEM/F12培养基、hiPSC接种培养基&#160;和细胞解离溶液在37 °C预热20-30分钟。</li>
	<li>吸除6孔板中的培养基，每孔加入1.5 mL预热的细胞解离溶液。将培养板置于37 °C孵育5-7分钟。</li>
	<li>将培养板转移至生物安全柜中，轻敲培养板使hiPSC集落脱落，并打散细胞团块。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL离心管中，加入4.5 mL DMEM/F12培养基。使用10 mL血清移液管轻柔吹打混合液5次，使细胞解离为单细胞悬液。避免产生气泡。</li>
	<li>在室温下以100 × g离心3分钟，收集细胞。</li>
	<li>吸除上清液，使用P1000移液器将细胞轻柔重悬于1 mL hiPSC接种培养基中。</li>
	<li>取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝溶液混合进行细胞计数。取10 µL混合液加入血细胞计数板，盖上盖玻片。将计数板安装在支架上并插入自动细胞计数仪。仪器完成对焦后，按下捕获按钮，根据活细胞密度读数确定hiPSC悬液的浓度。</li>
	<li>以2.7 × 105 个细胞/孔的密度将细胞接种至超低吸附圆底微孔板中，使每个拟胚体（EB）含有500-1,000个细胞。</li>
	<li>每孔加入2 mL hiPSC接种培养基，轻柔混匀以使细胞均匀分布。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
</ol>
3. 血管分化（第1 - 5天）
<ol>
	<li>第1天，按照表3和表4所述配制中胚层诱导培养基（MIM），并在37 °C预热20分钟。MIM培养基必须新鲜配制。</li>
	<li>使用P200移液器小心吸除微孔板中的培养基，注意不要扰动底部的胚状体（EBs）。</li>
	<li>用P200移液器缓慢加入2.5 mL MIM培养基。将EBs在37 °C、5% CO2条件下培养2天。</li>
	<li>第3天，轻轻更换为预热的新鲜配制的2.5 mL血管分化培养基1（VDM1，表5），注意不要扰动微孔底部的EBs。将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养2天。</li>
</ol>
4. 水凝胶包埋（第5天）
<ol>
	<li>按照表6所述配制I型胶原混合液。将一个50 mL离心管置于冰上，依次加入I型胶原溶液、H2O、10× DMEM/F12培养基、碳酸氢钠&#160;和HEPES。通过轻轻摇动离心管充分混匀。在摇动混合液的同时逐滴加入1 M NaOH溶液，调节pH至7.3，并用pH计检测混合液的pH值。 
	注意：所有溶液在使用前均需预先在冰上冷却。整个操作过程需始终在冰上并置于生物安全柜中进行。加入NaOH溶液是关键步骤，需快速分散以形成均一溶液，避免I型胶原局部凝固。NaOH的用量可能因I型胶原溶液的批号不同而有所变化。混匀时切勿剧烈吹打，以免剪切力导致胶原提前固化。</li>
	<li>按照表7所述配制I型胶原-基底膜基质混合液。将1.25 mL基底膜基质加入第4.1步制备的5 mL I型胶原混合液中。通过轻轻摇动离心管轻柔混匀。</li>
	<li>将12孔板置于冰上预冷2分钟。</li>
	<li>使用宽口吸头缓慢将I型胶原-基底膜基质混合液加入12孔板中（每孔1.5 mL），确保混合液分布均匀。</li>
	<li>将培养板放入37 °C培养箱中孵育2小时，使水凝胶第一层固化。</li>
	<li>将剩余的I型胶原-基底膜基质混合液保存在冰上，以备后续使用。</li>
	<li>将约60个细胞聚集体转移至1.5 mL微量离心管中，并将离心管置于冰上冷却5分钟。使用P200移液器吸头小心吸除培养基。 
	注意：此步骤应在第4.5步开始后1.5小时进行。</li>
	<li>逐滴向细胞聚集体中加入1.5 mL I型胶原-基底膜基质混合液，并使用宽口P200移液器吸头轻柔混匀。</li>
	<li>将含有水凝胶第一层的培养板从培养箱（第4.5步）转移至生物安全柜中。</li>
	<li>将1.5 mL细胞聚集体悬液加至已固化的凝胶层上。轻轻摇动培养板使聚集体均匀分布，避免产生气泡。</li>
	<li>将培养板在37 °C、5% CO2条件下继续孵育2小时。</li>
	<li>配制血管分化培养基2（VDM2；表8），并在使用前于37 °C水浴中预热20分钟。</li>
	<li>每孔加入2 mL VDM2，于37 °C、5% CO2条件下继续培养细胞。</li>
	<li>每隔3天更换一次预热的新鲜VDM2培养基。 
	注意：（可选）可通过注射器针头去除凝胶，将血管类器官从凝胶混合物中释放出来。从凝胶中回收的血管类器官可单独置于96孔板中，使用VDM2培养基（每孔200 µL）进行维持培养。每隔2–3天更换一次培养基。</li>
</ol>
5. 三维免疫荧光检测
<ol>
	<li>血管类器官大约在第13天成熟。对于包埋在水凝胶中的类器官，小心吸除培养基，并用2 mL PBS洗涤三次（每次10分钟）。对于从凝胶中回收的类器官（在步骤4.14之后），在2 mL微量离心管中收集6–10个类器官，吸除培养基，并用2 mL PBS洗涤三次（每次10分钟）。</li>
	<li>向样品中加入2 mL 4%多聚甲醛（PFA），用封口膜密封后在4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>去除PFA溶液，并用2 mL PBS洗涤四次（每次15分钟）。</li>
	<li>加入2 mL封闭缓冲液（表9），在室温下孵育2小时。</li>
	<li>去除封闭缓冲液，加入1.5 mL一抗（抗体信息见材料表；抗体应使用封闭缓冲液稀释）。在4 °C下轻轻振荡孵育2天。 
	注意：建议将一抗（CD31、PDGFRβ和ERG1）按1:400的比例用封闭缓冲液稀释（更多信息见材料表）。</li>
	<li>去除一抗溶液，并用2 mL PBST洗涤六次，每次1小时。</li>
	<li>向样品中加入2 mL二抗（抗体信息见材料表；抗体应使用PBST稀释）。用铝箔包裹培养板，在4 °C下轻轻振荡孵育2天。 
	注意：建议将二抗按1:1000的比例用PBST稀释（更多信息见材料表）。从本步骤开始，孵育和洗涤过程中均需避光。</li>
	<li>去除二抗溶液，并用2 mL TBST洗涤六次（每次1小时）。若需进行细胞核染色，则在最后一次洗涤步骤的洗涤缓冲液中加入DAPI（1 µg/mL）。</li>
	<li>对于包埋在凝胶中的类器官，将凝胶切成4块，并用刮铲小心转移至2 mL微量离心管中。对于已回收的类器官，去除洗涤缓冲液。</li>
	<li>使用擦拭纸吸除残留液体，注意不要触碰凝胶或类器官。</li>
	<li>向每根离心管中加入2 mL水溶性组织透明试剂（折射率 = 1.49）。将样品置于室温避光条件下孵育，直至类器官变得透明（通常为过夜）。切勿振荡样品。</li>
	<li>用刮铲小心地将含有透明试剂的类器官转移至玻璃底培养皿中央。</li>
	<li>用24 mm × 24 mm盖玻片覆盖类器官或凝胶块。</li>
	<li>轻轻按压盖玻片，使其平整贴合，并与玻璃底面共同夹紧样品。</li>
	<li>去除培养皿中多余的透明试剂，并用指甲油密封盖玻片。</li>
	<li>进行三维成像时，使用配备10×物镜的共聚焦显微镜。采用拼图扫描和Z轴层扫模式获取类器官的整体成像图像。</li>
</ol>

hiPSC-Derived Vascular Organoids for Drug Screening and Disease Modeling

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<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255(2019).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本方案包含两项关键改进，可实现高质量血管类器官的均一化和可重复性生成。第一项改进是使用微孔板，以更好地控制胚胎体（EB）的均一性。作为血管分化的起始点，EB的大小至关重要，因为它调控着干细胞的命运以及向不同谱系分化的效率。EB尺寸的差异通常会导致类器官结构和组织不一致，出现异质性16,17。传统的通过刮取hiPSC集落来生成EB的方法11,12难以控制每个EB的细胞数量，通常导致EB形成不均一。在本方案中，hiPSC被解离为单细胞悬液，并在微孔中重新聚集16,18。通过调节接种的细胞数量，可优化EB的大小，以确保中胚层分化的稳定性和高效性。进行微孔接种时，使用500–1,000个细胞&#160;，可获得相对较小的EB（直径为100–200 µm）。该方法可在不同批次之间（图1F）以及不同细胞系之间可重复地生成大小均一的EB13。自第0天起，EB在分化过程中形态随时间发生变化：形状逐渐变得不那么球形，表面变得更加粗糙（图1），但体积未显著增加。三维血管结构的形态取决于包埋密度以及所包埋类器官的大小。过大的类器官（&#62;500 µm）通常会导致血管细胞分化不足，而过小的类器官则往往血管发育不全。
第二个改进是加入CEPT混合物，以提高hiPSC在拟胚体（EB）形成过程中的细胞存活率。在此过程中，细胞存活率与hiPSC克隆的质量同样至关重要。当hiPSC被解离为单细胞悬液时，通常会添加ROCK抑制剂Y27632以提高细胞存活率。然而，研究表明Y27632在低密度培养条件下对hiPSC的效果并不理想，且可能引起不必要的膜应激；而CEPT混合物（由chroman 1、emricasan、polyamines&#160;和trans-ISRIB组成）可显著降低细胞应激，从而在低密度hiPSC培养条件下有效提升EB形成过程中的细胞存活率15。
在类器官包埋于凝胶之前，应将类器官维持在微孔板中，换液操作需轻柔，以避免可能的损伤。最初5天建议使用200 µL移液器进行换液。所有用于血管类器官生成的培养基在使用前必须预热。尤其是在凝胶包埋后，使用低温培养基可能导致基底膜基质部分液化，从而影响血管网络形成的三维水凝胶微环境。类器官的包埋密度及其分布均匀性也是血管网络形成的关键因素。过高的类器官包埋密度可能导致血管网络过度融合，而密度过低则可能导致网络形成不足。建议每孔接种60–80个类器官，在将其加入第一层三维凝胶后，立即轻轻前后晃动培养板，以使类器官分布更均匀。
该方案可进一步修改以适用于不同应用。例如，可施加血脑屏障（BBB）相关信号，以进一步限制血管内皮细胞形成BBB界面19,20,21,22,23,24,25。三维水凝胶的组成也可进行调整。例如，纤维蛋白和玻连蛋白常用于体外血管网络的形成in vitro25,26,27,28,29,30,31,32。可用于包埋的基底膜基质可不含胶原蛋白I，这可能简化包埋过程并提供不同的力学刺激。
尽管本方案生成的血管类器官可能可用于疾病建模或药物筛选应用，但其局限性在于这些类器官主要仅模拟毛细血管系统，较大血管较少。对于聚焦于较大血管的研究，类器官的生成可能需要额外的机械刺激24,31,32,33。将血管类器官与循环系统连接，例如移植至动物体内34，或结合带有灌注泵的微/宏观流体装置33，可能有助于解决这一问题。

体外微生理系统模型，包括类器官和器官芯片系统，近十年来已逐步发展起来1,2,3。这些三维（3D）人源细胞系统分别克服了传统二维（2D）细胞培养和动物模型的局限性，例如传统模型缺乏生理微环境中的多种组分，以及不同物种间的遗传差异。与传统模型相比，这些系统能够提供更接近生理状态的信息，更适用于疾病建模和药物筛选。在各类微生理系统模型中，由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的类器官已被证实可有效模拟天然人组织的结构特征，并已成功用于模拟多种人体器官，包括脑4,5、肾6、肝7,8&#160;和视网膜9。本文重点介绍由hiPSCs生成血管类器官的方法，并概述一种简化的实验流程，旨在最大限度减少不同类器官样本及批次间的变异，从而提高整体实验的可重复性。
血管系统在维持人体所有器官的生理稳态中起着至关重要的作用。血管系统的形成涉及血管发生（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）两个过程，这些过程通过内皮细胞与壁细胞（如周细胞和血管平滑肌细胞）之间的相互作用进行协调，并受到多种刺激因素的影响10。Penninger, Wimmer&#160;及其同事开发了首个可模拟这两个过程的血管类器官生成方法11,12。利用该方法生成的类器官，其研究团队12以及我们团队13,14已证明血管类器官在模拟疾病中血管功能障碍方面的潜力。例如，在我们近期的研究中13,14，在模拟疾病的血管类器官与其野生型对应物之间观察到了明显的表型差异，如血管出芽现象以及壁细胞组成的变化。这些实例表明，血管&#160;类器官模型有望通过模拟与疾病相关的血管功能障碍，成为药物筛选的一个有效平台。
在先前血管类器官生成研究11,12的基础上，本文提出了一项改进的实验方案，该方案采用微孔板以促进均一的拟胚体（EB）形成，这是减少同一批次类器官生成过程中常见变异性的关键因素。此外，在拟胚体形成过程中，使用CEPT鸡尾酒混合物——包括Chroman 1、Emricasan、多胺&#160;以及整合应激反应抑制剂（trans-ISRIB）15——以提高hiPSCs及其分化细胞的存活率&#160;。此项改进主要旨在降低不同类器官样本及批次之间的差异。通过该为期约两周的方案，可获得结构均一的血管类器官：在第1天诱导血管发生，促使内皮细胞形成原始管状网络；第5天诱导血管生成，促进类器官内复杂血管网络的发育；至第12–15天，所生成的类器官应呈现出由内皮细胞和壁细胞共同构成的成熟血管网络。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（1000倍）</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗兔IgG（H+L）</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>711-546-152</td><td>用0.25 mL 50%甘油重悬，&amp;nbsp;于-20 &amp;deg;C保存不超过1年，使用时稀释比例为1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗山羊IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>705-606-147</td><td>用0.25 mL 50%甘油重悬，&amp;nbsp;于-20&amp;deg;C保存不超过1年，使用时稀释比例为1:1000</td></tr><tr><td>B27补充剂（不含维生素A，50倍）</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>于4 &amp;deg;C解冻，分装后于-20 &amp;deg;C保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>ProSpec</td><td>CYT-081</td><td>用无菌ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O重悬至浓度为100 ng/&amp;micro;L，分装后于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>CD31抗体&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab28364</td><td>稀释比例：1:400</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>022626001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423/10</td><td>用DMSO配制成12 mM的储存液，于-20 &amp;deg;C保存不超过1年。</td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Tocris</td><td>7163/10</td><td>用DMSO配制成100 &amp;micro;M的储存液，于-20 &amp;deg;C保存不超过1年。</td></tr><tr><td>胶原蛋白I型&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>40236</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>AXRMP/Ti2</td><td></td></tr><tr><td>Corning Elplasia培养板</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL全自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，粉末</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>用生物级ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O配制成10倍储存液，并用0.2 &amp;micro;m滤器过滤除菌。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Edi042A</td><td>Cedars Sinai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Medchemexpress LLC</td><td>HY1039610MG</td><td>用DMSO配制成1 mM的储存液，于-20 &amp;deg;C保存不超过1年。</td></tr><tr><td>ERG抗体</td><td>Cell Singali Technology</td><td>97249</td><td>稀释比例：1:400</td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>于4 &amp;deg;C&amp;nbsp;解冻并分装，于&amp;nbsp;-20 &amp;deg;C保存不超过五年，或于4 &amp;deg;C保存不超过一个月</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>ProSpec</td><td>CYT557</td><td>用无菌ddH2O重悬至浓度为100 ng/&amp;micro;L，分装后于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>Fluorodish细胞培养皿</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1099</td><td>用DMSO重悬至浓度为12 mM，分装后于-20 &amp;deg;C保存</td></tr><tr><td>庆大霉素（50 mg/mL）</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX补充剂（100倍）</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>肝素，100 kU</td><td>MilliporeSigma</td><td>375095100KU</td><td>用无菌ddH2O重悬至浓度为4 kU/mL</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>13998123</td><td></td></tr><tr><td>Knockout血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>于4 &amp;deg;C解冻，分装后于-20&amp;deg;C保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>Matrigel，GFR基底膜基质</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>于4 &amp;deg;C解冻，分装后于-80&amp;deg;C保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（NEAA，100倍）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001130</td><td>于4 &amp;deg;C解冻，分装后于-20&amp;deg;C保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>N2补充剂（100倍）</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>于4 &amp;deg;C解冻，分装后于-20&amp;deg;C保存，避免反复冻融</td></tr><tr><td>NaOH溶液（1 M）</td><td>Cytiva&amp;nbsp;HyClone</td><td>SH31088.01</td><td></td></tr><tr><td>NeuroBasal培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements，版本5.42</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson Immuno Research Labs</td><td>17000121</td><td>用10 mL无菌ddH2O重悬，于4 &amp;deg;C保存不超过两周</td></tr><tr><td>多聚甲醛，20%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713S</td><td>用PBS稀释</td></tr><tr><td>PBST，20倍</td><td>Thermofisher</td><td>28352</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&amp;beta;抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF385</td><td>稀释比例：1:400</td></tr><tr><td>多胺补充剂（1000倍）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>Rapiclear透明试剂，1.49</td><td>SUNJIN LAB</td><td>RC149001</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（7.5%）</td><td>Gibco</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠一水合物</td><td>Thermofisher</td><td>J6228822</td><td>用ddH2O溶解配制成1%（wt/v）的储存液</td></tr><tr><td>TBST，20倍</td><td>Thermofisher</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>trans-ISRIB</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5284/10</td><td>用DMSO配制成1 mM的储存液，于-20&amp;deg;C保存不超过1年。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>ProSpec</td><td>CYT-116</td><td>用无菌ddH2O重悬至浓度为100 ng/&amp;micro;L，分装后于-20&amp;deg;C保存</td></tr></tbody></table>

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

Vascular Organoid Generation from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的血管类器官重现了人类血管网络的细胞类型多样性和复杂结构。该三维（3D）模型在血管病理建模方面具有重要潜力 体外 药物筛选。尽管近年来取得了进展，但在生成具有稳定质量的类器官方面仍存在一个关键技术挑战，即如何实现可重复性，这对于后续的检测和应用至关重要。本文介绍了一种经过改进的方案，可提高血管类器官生成的均一性和可重复性。该改进方案采用微孔板结合CEPT鸡尾酒溶液（chroman 1、emricasan、多胺和整合应激反应抑制剂trans-ISRIB），以改善类胚体的形成和细胞存活率。利用该方案生成的已分化成熟血管类器官，可通过整体三维免疫荧光显微镜进行表征，以分析其形态结构和复杂的血管网络。该方案能够以可扩展的方式生产高质量的血管类器官，有望推动其在疾病建模和药物筛选中的应用。

图1A 展示了本实验方案的流程图，包括各阶段所使用的关键组分。分化过程始于拟胚体形成，随后进行中胚层诱导及血管谱系特化（图1B-D）。随着时间推移，聚集体逐渐增大且形状变得不规则。类器官在第5天开始出现粗糙的边缘。在嵌入I型胶原-基底膜基质混合物后，血管内皮细胞和周细胞最早于第7天出芽并向外生长，形成复杂的血管网络（图1E）。由于该改进方法的主要目的是尽量减少不同批次培养之间的差异，我们测量了两个独立批次的拟胚体（EB）大小，两次测量结果及统计分析均证实了该方法的一致性和均一性（图1F).
为验证血管分化，在包埋前第5天收集类器官，并使用血管标志物CD31、ERG1和PDGFRβ进行染色。类器官表达CD31、ERG1和PDGFRβ（图2），表明存在血管内皮细胞和周细胞。
组织透明化处理后，通过全组织免疫荧光显微镜对血管网络进行分析（图3A）。成熟的类器官在第17天使用CD31、ERG1和PDGFRβ进行染色（图3B，凝胶块中的样本）；第28天时（图3C，样本从凝胶块中取出后单独培养于96孔板中；需注意的是，取出凝胶块后，边缘的血管网络包裹着类球体，而非呈放射状向外扩展）。
<img alt="iPSC培养至血管网络；包含实验的示意图A-E，以及显示EB大小结果的图表F。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：血管类器官的生成。（A）血管类器官生成步骤及时间线示意图。（B-E）不同发育阶段血管类器官的代表性明场图像。比例尺：100 µm。（F）本研究中采用微孔法生成的两批拟胚体（EB）在EB大小上的统计分析结果。EB生成时每个微孔接种1,000个细胞，批次1和批次2的样本数分别为n = 42和n = 40。显著性标记为ns，表示无显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构的荧光显微镜图像、蛋白质定位分析、实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：凝胶包埋前血管类器官的免疫染色。 类器官经内皮细胞标志物（A）CD31（绿色）和（B）ERG1（绿色），以及（C）周细胞标志物 PDGFRβ（绿色）染色后的代表性荧光图像。细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光谱设备设置、细胞荧光显微镜、细胞结构的三维容积成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67125/67125fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：血管类器官中血管网络的免疫荧光表征。（A）代表性图像显示组织透明化后玻璃培养皿中凝胶包埋的血管类器官。类器官呈透明状，但在385 nm紫外光下可见。（B）第17天血管类器官的代表性三维整体成像。血管类器官用DAPI（蓝色）、血管内皮细胞标志物CD31（绿色）和周细胞标志物PDGFRβ（洋红色）染色。（C）第28天回收的血管类器官的代表性整体三维成像，使用内皮细胞标志物CD31（红色）和ERG1（绿色）染色。比例尺：150 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67125/67125fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>hiPSC 扩增培养基</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus 基础培养基</td>
			<td>400 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus 添加剂</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>庆大霉素 (50 mg/mL)</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：hiPSC扩增培养基的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>hiPSC 接种培养基</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC 扩增培养基</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chroman 1 (100 µM)</td>
			<td>10 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emricasan (1 mM)</td>
			<td>30 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多胺补充剂 (1000x)</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-ISRIB (1 mM)</td>
			<td>14 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：hiPSC接种培养基的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N2B27 培养基</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX 补充剂</td>
			<td>48.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuroBasal 培养基</td>
			<td>48.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX 补充剂 (100x)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 非必需氨基酸溶液 (NEAA, 100x)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇 (1000x)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>庆大霉素 (50 mg/mL)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 补充剂 (100x)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 补充剂（不含维生素 A, 50x）</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝素, 4 kU/mL</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：N2B27培养基的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>中胚层诱导培养基 (MIM)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2B27 培养基</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4 (100 ng/µL)</td>
			<td>0.9 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (12 mM)</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：中胚层诱导培养基（MIM）的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>血管分化培养基 1 (VDM1)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2B27 培养基</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forsklin (12 mM)</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA (100 ng/µL)</td>
			<td>3 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：血管分化培养基1（VDM1）的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ⅰ型胶原混合液</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ⅰ型胶原 (3.61 g/mL)</td>
			<td>2.77 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 倍浓度 DMEM/F12 培养基</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碳酸氢钠，7.5%</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES，1 M</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>0.73 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH，1 M</td>
			<td>75 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6：I型胶原混合液的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>胶原蛋白 I - 基底膜基质混合液</td>
			<td>6.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胶原蛋白 I 混合液</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (10 mg/mL)</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表7：I型胶原-基底膜基质混合物的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>血管分化培养基 2 (VDM2)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX™ supplement</td>
			<td>3.67 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>庆大霉素 (50 mg/mL)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 非必需氨基酸溶液 (NEAA, 100X)</td>
			<td>50 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇 (1000x)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肝素, 4 kU/mL</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout 血清替代物</td>
			<td>0.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA (100 ng/µL)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2 (100 ng/µL)</td>
			<td>5 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表8：血管分化培养基2（VDM2）的成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>封闭缓冲液</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>驴血清</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>0.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>0.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脱氧胆酸钠溶液 (1%, wt/v)</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>46.5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表9：免疫染色封闭缓冲液的成分。

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。

由人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的血管类器官重现了人类血管中细胞类型的多样性及复杂的结构特征

本研究介绍了一种通过使用新型ROCK抑制剂和微孔限制技术，从人iPSCs可扩展地生成均质血管类器官的改进方法。该方法提高了可重复性，并最大限度地减少了批次间的差异，适用于后续的形态学分析和疾病建模应用。单细胞测序技术已在类器官研究中被广泛用于揭示细胞群体内的基因组、表观基因组和转录组异质性及其动态变化。组织清除和光片显微镜等三维成像技术，有助于在三维环境中快速、高分辨率地对细胞形态和组织结构进行成像。在类器官研究中，通量和标准化是关键挑战。人工操作费时费力，限制了通量，因此机器人自动化成为一种有前景的解决方案。类器官培养的标准化，包括诱导多能干细胞的质量控制和分化方案的优化，可显著提高实验的可重复性，并最大限度减少不同批次和细胞系之间的差异。首先，将一个50毫升离心管置于冰上，依次加入胶原蛋白1溶液及其他组分，然后振荡混匀。使用 P10 移液器，一边轻轻摇动混合溶液，一边逐滴加入 1 摩尔氢氧化钠溶液，将 pH 值调节至 7.3。向 5 毫升 Collagen 1 混合液中加入 1.25 毫升基底膜基质，轻轻混匀。接着，将 12 孔板置于冰上放置 2 分钟。使用宽口吸头，将 Collagen 1 基底膜基质混合物缓慢加入 12 孔板中。将 12 孔板置于 37 摄氏度培养箱中孵育 2 小时，使水凝胶第一层凝固。剩余的 Collagen 1 基底膜基质混合物置于冰上，以备后续使用。然后，将约60个细胞聚集体转移至一个1.5毫升微量离心管中，并将管子置于冰上冷却5分钟。使用P200移液枪头，小心吸除管中的培养基。逐滴加入1.5毫升Collagen 1基底膜混合物至细胞聚集体中，并使用宽口P200移液枪头轻轻吹打混匀，以重悬细胞。将带有第一层水凝胶的培养板从培养箱转移至生物安全柜中。向固化后的水凝胶层上加入1.5毫升的聚集体悬浮液，并轻轻振荡培养板以使聚集体均匀分布。将培养板置于37°C、含5% CO₂的环境中孵育2小时。将血管分化培养基2在37摄氏度水浴中预热20分钟。每孔加入2毫升培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。每隔三天更换新鲜的预热血管分化培养基2。类器官表达 CD31、ERG1 和 PDGFR-β，表明存在血管内皮细胞和寄生虫。通过组织透明化后的整体免疫荧光显微镜观察血管网络。第 17 天染色的成熟类器官显示，血管网络包裹着凝胶块内的球状体。第28天获取的类器官具有围绕球状体的血管网络，而非呈放射状扩展。

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从人诱导多能干细胞生成血管类器官

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。...

一种体外生成人脑类器官的方法

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。...

利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方案。为了大量且高质量地获得脑类器官，我们使用自制的微型生物反应器。...

利用自制微型生物反应器由诱导性多能干细胞生成脑类器官

本文介绍了一种利用人类多能干细胞通过自组织方式高效生成具有发育相关性的人类心脏类器官（hHOs）的实验方案。该方案依赖于发育信号的顺序性激活，可产生高度复杂且功能相关的人类心脏组织。...

生成源自多能干细胞的自组装人类心脏类器官

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。...

从多能干细胞生成人血管类器官

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

本方案介绍了一种利用悬浮培养条件从诱导性多能干细胞（iPSCs）高效生成肾类器官的全面方法。本研究的重点在于确定初始细胞密度和WNT激动剂浓度，从而为对肾类器官研究感兴趣的科研人员提供参考。...

从诱导性多能干细胞在悬浮培养中生成肾脏类器官

本方案描述了源自人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）的自然杀伤细胞（NK细胞）的体外分化、扩增及体内成像技术。...

发育、扩增与 体内 人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）来源的自然杀伤细胞的监测

了解利用新型ROCK抑制剂和微孔限制技术从人诱导多能干细胞规模化生成均质血管类器官的方法。该方法显著提高批次间可重复性，适用于疾病建模和形态学分析研究。

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

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