Name: 通过比例荧光共振能量转移评估DNase活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 了解比例荧光共振能量转移法检测DNase活性的实验流程。该方法可在不同pH和温度条件下实时监测弱核酸酶活性，为酶学研究提供高灵敏度的定量分析工具。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）下属国立普通医学科学研究所授予的R01 GM148812基金、美国国立卫生研究院（NIH）下属国家癌症研究所授予的R21 CA255979基金，以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家老龄化研究所授予的R21 AG073887和R21 AG071978基金（以上项目均由V.V.D.负责）。

通过比率型荧光共振能量转移评估脱氧核糖核酸酶活性
该方法适用于可溶性蛋白质的核酸切割特性检测与分析。为了考察所研究DNase的pH依赖性，该实验程序可同时在一系列pH值条件下评估DNase的活性。该技术可用于研究微弱且反应缓慢的核酸酶活性。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 准备荧光测定系统的孵育混合物组分
<ol>
	<li>在&#160;所需的 pH 范围内配制缓冲溶液。对于 pH 6.8 至 8.0 范围，使用 Tris-HCl 或磷酸盐缓冲液。由于 Tris-HCl 缓冲液具有较高的稳定性且对酶活性干扰较小，因此在生理 pH 条件（pH 7.2 至 8.0）下应优先选用。 
	注意：磷酸盐缓冲液适用于该 pH 范围，但由于其缓冲能力的限制，在较高 pH 值（&#62;7.5）下适用性较差。 
	对于 pH 4.2 至 7.2 范围，使用乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液。乙酸盐缓冲液在较低 pH 条件下效果良好，可低至 pH 4.2。 
	注意：&#160;柠檬酸盐缓冲液可在稍高 pH 值（pH 5.6 至 7.2）下使用，并具有良好的缓冲能力。这些缓冲液适用于在酸性至中性条件下研究 DNase 活性。本研究中对 LEI 的核酸酶活性分析使用了 10 mM 乙酸钠缓冲液，pH 范围为 4.8 至 6.5。</li>
	<li>将蛋白样品在每种缓冲液中稀释至适当浓度。当样品中活性完全未知时，应制备一系列不同稀释度的蛋白溶液。最佳稀释度取决于 DNase 活性的强弱，需通过实验测试多个蛋白浓度来确定。 
	注意：本研究中对 LEI 超弱核酸酶活性的分析采用的蛋白浓度为 1 µM。
	<ol>
		<li>使用高浓度缓冲液时，务必检测最终溶液的 pH，因为高浓度缓冲液在稀释后 pH 可能发生变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无核酸酶水中配制比率型 FRET 探针溶液。FRET 探针浓度应接近 1 µM（1 pmol/µL）。避免使用过高的探针浓度。 
	在使用前迅速加热并冷却探针溶液，以确保不利的碱基配对完全解离。 
	注意：本研究中对 LEI 核酸酶活性的分析使用了浓度为 1 µM（1 pmol/µL）的 FRET 探针，溶剂为无核酸酶水。</li>
</ol>
2. 使用比率型FRET探针作为底物诱导DNase反应
<ol>
	<li>为每个待测 pH 条件，在 96 孔板中准备三个孔，并分别为阳性对照和阴性对照各准备三个额外的孔。
	<ol>
		<li>在用于 pH 梯度实验的每个孔中，加入以下组分： 
		70 μL 无核酸酶水 
		10 μL 10X 缓冲液（可选择合适的缓冲液）&#160; 
		10 μL 含蛋白质的样品&#160; 
		10 μL 比值型探针溶液（储存浓度为 10 pmol/μL）&#160; 
		注意：&#160;本研究中用于检测 LEI 在酸性 pH 下核酸酶活性的 10X 缓冲液成分为：100 mM 醋酸钠，pH 5.2</li>
		<li>在每个阳性对照孔中，加入以下组分： 
		79 μL 无核酸酶水 
		10 μL 10X DNase II 缓冲液（100 mM 醋酸钠，pH 5.2） 
		0.33 μL DNase II（储存浓度为 1 U/μL）&#160; 
		10 μL 比值型探针溶液（储存浓度为 10 pmol/μL） 
		注意：在酸性 pH 条件下的研究应使用 DNase II 作为阳性对照。当评估接近 pH 7（特别是 pH 6.5–8）的 DNase 活性时，应改用 DNase I 及其相应缓冲液（例如：10 mM Tris-HCl、2.5 mM MgCl2、0.5 mM CaCl2，pH 7.6），而非 DNase II 和醋酸盐缓冲液。</li>
		<li>在每个阴性对照孔&#160;中，用无核酸酶水替代蛋白质样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将探针溶液加入含有不同 pH 值下 DNase 蛋白的反应体系中，启动 DNase 反应。 
	注意：充分混匀所有样品，同时避免产生气泡。对于具有活性的 DNase 样品，应尽可能同时启动所有反应。对于活性极弱的样品（如 LEI），严格的时间控制则不那么关键。 
	注意：为确保一致的孵育时间，特别是在处理活性较高的核酸酶时，应根据每次测量所需时间依次加入样品。例如，若每次测量耗时 10 秒，则第二个样品应在第一个样品加入后 10 秒再加入。</li>
</ol>
3. 孵育
<ol>
	<li>将待研究的DNase与比率型FRET探针在37°C水浴或温控培养箱中孵育不同时间。采用多个时间点并以规律的取样间隔进行取样，以准确评估酶的 turnover 速率并最小化假象。本研究中对LEI超弱核酸酶活性的分析采用了24小时孵育，以检测缓慢的核酸酶反应。&#160; 
	注意：最佳孵育时间需通过预实验确定，因其取决于所研究DNase的活性强度。活性较强的核酸酶完成探针切割所需时间极短，因此可从15–30分钟的孵育开始。若样品浓度过高导致反应过快，应降低蛋白质浓度；若样品蛋白活性较弱，可根据需要延长孵育时间。</li>
</ol>
4. 信号归一化至相同pH条件
<ol>
	<li>通过加入 100 μL 的 250 mM Tris-HCl（pH 8.0）终止所有孵育反应。此步骤还可使所有样品的 pH 值均一化。&#160; 
	注意：在比较不同初始 pH 条件下启动的反应时，pH 均一化步骤尤为重要。该操作可确保探针片段完全分离，从而最大化其基于 FRET 的信号。此外，探针的 FAM 荧光基团在酸性 pH 下荧光发射减弱，在 pH 8.0 时达到最佳状态。对于离子强度高于本研究中所用样品的样本，可能需要使用更高浓度（&#62;250 mM）和更高 pH（&#62;8.0）的均一化溶液，以实现有效的 pH 调整。 
	注意：碱性 pH 可有效抑制酸性核酸酶（如 LEI）的活性，本研究已证实这一点。对于中性或碱性核酸酶，应在信号检测前确定并采用相应的特异性失活方法。</li>
</ol>
5. 荧光信号检测与FRET比率计算
<ol>
	<li>pH 值平衡步骤完成后，立即使用荧光分光光度计记录供体和受体荧光染料的发射光谱。在 96 孔板中直接进行测量，以 488&#8239;nm 激发供体荧光染料，同时检测 525&#8239;nm（供体）和 580&#8239;nm（FRET 来源的受体信号）处的发射信号。</li>
	<li>利用记录的荧光强度评估每个样品中的 DNase 活性。采用适当的统计学方法分析数据并评估显著性。 
	注意：使用以下公式计算 FRET 比值：RFRET = 525 nm 处的供体发射强度 / 580 nm 处的受体发射强度。在本实验中，DNA 切割使荧光染料彼此分离，从而破坏 FRET，导致供体发射增强而受体发射减弱。这一变化使 FRET 比值（RFRET）升高，该比值可作为 DNase 活性的指标。</li>
</ol>
6. 基于PAGE的切割验证
<ol>
	<li>通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证FRET探针的切割情况14.&#160;FRET探针及其切割产物带有荧光标记，无需额外染色即可观察。 
	注意：在代表性研究中，LEI 介导的 38-mer FRET 探针的切割通过变性 PAGE 确认（参见 图2分析结果显示，LEI 产生了 6-8 个核苷酸的 FAM 标记片段和 15-16 个核苷酸的 TAM 标记片段，符合在发夹结构两个顶端附近发生切割的特征。该片段模式与 DNase II 产生的片段谱型不同。
	<ol>
		<li>将每个样品的 15 µL 加样至 20% 变性 PAGE 凝胶中。</li>
		<li>运行凝胶电泳1小时&#8239;h 在 100&#8239;五</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用配备高分辨率彩色相机的凝胶成像系统获取凝胶图像。 
	注意：代表性研究中的图像使用数码单反相机拍摄。</li>
</ol>

<ol><li>A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. 
 <a target="_blank" href="https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081">https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081</a> (2018).</li>
<li>Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Front Plant Sci. 4, 413(2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Chai, H., Tang, Y., Guo, Z., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+electrochemical+switch+for+circulating+tumor+DNA+through+recycling+activation+of+blocked+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric electrochemical switch for circulating tumor DNA through recycling activation of blocked DNAzymes.</a> Anal Chem. 94 (6), 2779-2784 (2022).</li>
<li>Liu, G., Ma, X., Tang, Y., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+fluorescence+method+for+ctDNA+analysis+based+on+the+construction+of+a+DNA+four-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Ratiometric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction.</a> Analyst. 145 (4), 1174-1178 (2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoblinker%3A+Brownian+motion+powered+bio-nanomachine+for+FRET+detection+of+phagocytic+phase+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nanoblinker: Brownian motion powered bio-nanomachine for FRET detection of phagocytic phase of apoptosis.</a> PLoS One. 9 (9), e108734(2014).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+FRET+labeling+and+analysis+of+phagocytic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Express FRET labeling and analysis of phagocytic clearance.</a> Methods Mol Biol. 1644, 3-11 (2017).</li>
<li>Domingo, B., Sabariegos, R., Picazo, F., Llopis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+FRET+standards+by+steady-state+fluorescence+and+lifetime+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods.</a> Microsc Res Tech. 70 (12), 1010-1021 (2007).</li>
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<li>Torriglia, A., Martin, E., Jaadane, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hidden+side+of+SERPINB1%2Fleukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The hidden side of SERPINB1/leukocyte elastase inhibitor.</a> Semin Cell Dev Biol. 62, 178-186 (2017).</li>
<li>Torriglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DNase+II%2C+a+molecule+that+links+proteases+and+endonucleases+in+apoptosis%2C+derives+from+the+ubiquitous+serpin+leukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">L-DNase II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from the ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor.</a> Mol Cell Biol. 18 (6), 3612-3619 (1998).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. (32), e1485(2009).</li>
<li>Lauková, L., Konečná, B., Janovičová, Ľ, Vlková, B., Celec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribonucleases+and+their+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deoxyribonucleases and their applications in biomedicine.</a> Biomolecules. 10 (7), 1036(2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+detection+of+nucleolytic+and+proteolytic+markers+of+lysosomal+cell+death%3A+DNase+II-type+breaks+and+cathepsin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual detection of nucleolytic and proteolytic markers of lysosomal cell death: DNase II-type breaks and cathepsin D.</a> Methods Mol Biol. 1554, 229-236 (2017).</li>
<li>Nucleases (DNases and RNases). , Sigma-Aldrich. 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases">https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases</a> (2025).</li>
<li>Altairac, S., Zeggai, S., Perani, P., Courtois, Y., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+Na%2B%2FH%2B+antiport+inhibition+activates+the+LEI%2FL-DNase+II+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by Na+/H+ antiport inhibition activates the LEI/L-DNase II pathway.</a> Cell Death Differ. 10 (5), 548-557 (2003).</li>
<li>Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacons+as+a+sensitive+fluorescence+assay+for+enzymatic+cleavage+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (11), E52(2000).</li>
<li>Ma, C., Tang, Z., Huo, X., Yang, X., Li, W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+double-stranded+DNA+cleavage+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of double-stranded DNA cleavage using molecular beacons.</a> Talanta. 76 (2), 458-461 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究展示了利用比率型FRET技术检测和评估脱氧核糖核酸酶（DNase）活性的方法，所用蛋白为弱核酸酶——白细胞弹性蛋白酶抑制剂（LEI）。该方法为评估蛋白质和生物分子的DNase特性提供了一种便捷且定量的手段。其实验方案简单直接，数据分析过程简便。该检测使用一种38聚体的FRET探针，可在多种酸性pH条件下长时间孵育而保持稳定。正如我们所证明的，这种稳定性使该方法能够检测到即使微弱且缓慢的DNA切割活性。此类稳定性相较于其他基于探针的方法（如分子信标19,20,&#160;具有明显优势，因为分子信标&#160;在长时间孵育以及低或高pH条件下稳定性较差
比率型FRET检测法可系统评估影响DNase活性的实验参数，包括pH、离子条件、缓冲液组成和温度。该检测方法的另一个有益特征是能够通过PAGE平行重分析来验证比率型数据。FRET探针在其3’和5’末端均带有荧光标记，便于明确识别切割片段的来源及切割位点。
该技...

比率荧光法是一种分析方法，通过利用荧光信号的比值，而非仅依赖单一信号的强度1,2。采用比值的优势在于可实现内部校准，并补偿多种随机因素，例如样品和探针浓度的变化、仪器参数波动等。这有助于提高荧光探针的准确性和灵敏度。
在 Förster 偿能量转移（FRET）探针的特定背景下，“比率型”一词指的是测量基于 FRET 供体与受体荧光团这对组合所发出的两个发射信号的比值。为了定量目标分析物的活性，比率型 FRET 探针采用受体/供体发射强度的比值（在某些情况下，也可使用相反的供体/受体比值）。该比值与 FRET 效率直接相关，提供了一种自校正机制，可最大限度地减少背景噪声，并校正激发条件和探针浓度变化所带来的影响3。
近年来，比率法的一些有趣应用包括用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）的比率电化学生物传感器4,5、用于FRET检测细胞凋亡吞噬阶段的布朗运动驱动生物纳米机器6，以及用于快速FRET标记和分析吞噬清除过程的研究7。本研究中描述的比率FRET方法适用于DNase活性的定量评估。该检测基于FRET荧光对发射信号的比值进行测量。由于该方法能够检测到即使微弱且缓慢的DNA切割，因此特别适用于需要较长观察时间的弱核酸酶活性研究，以及在不同pH条件下的实验。
本文通过比值型FRET检测法在研究弱核酸酶——白细胞弹性蛋白酶抑制剂（LEI）的DNase活性中的应用，展示了该方法的一些特定优势。报告中包含详细的实验方案、逐步操作说明以及比值型数据分析方法的描述。
比率型FRET探针描述
该比率型FRET探针是一种自互补的38聚体DNA寡核苷酸，携带FAM-TAM（荧光素-四甲基罗丹明）作为供体-受体FRET荧光对。其序列为5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'。该自杂交的38聚体形成一种 staples 状构象，包含两个分别由23和15个核苷酸组成的相连发夹结构，使两个荧光基团之间的距离为23.8 Å。此距离显著小于该荧光对的福斯特半径，R0 = 55 Å8。这种空间排布对应于从供体到受体极高的能量转移效率7：EFRET = 0.993477。因此，当在FAM的激发波长（488 nm）下照射时，该FRET探针在受体TAM的发射波长（580 nm）处发射荧光，而FAM的发射（525 nm）则被抑制。
图1A展示了由UNAFold预测的探针二级结构，由于发夹结构顶端弯曲较紧而产生空间位阻，因此在两个发夹顶端均形成较小的环。DNA断裂通过FRET探针检测的示意图见图1B，图中显示DNase对寡核苷酸探针的切割使其FRET荧光对发生分离，这种分离导致探针中两种荧光团的发射光谱发生显著变化。图1C展示了探针在切割前后其发射光谱的变化，结果表明DNase II切割探针后FRET荧光对的分离使525 nm处的供体荧光强度（ID 525 nm）显著增强，同时使580 nm处的受体荧光强度（IA 580 nm）明显降低。图1D展示了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）结果及对应的FRET比值。DNase II对探针的切割产生了两条较宽的条带，分别对应于12-16聚体的FAM（绿色）片段和20-24聚体的TAM（红色）片段，表明38聚体探针在T23附近、即两个发夹连接区域两侧发生了随机切割。
<img alt="FRET DNA 切割过程示意图、发射光谱图、切割比率柱状图、凝胶电泳图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：比率型 FRET 探针的结构与工作原理。（A）由 UNAFold 预测生成的 FRET 探针二级结构。（B）FRET 探针工作原理示意图。该比率型 FRET 探针为一种 staples 形状的 38-mer 寡核苷酸，其上标记有 FRET 供体（FAM）和受体（TAM），两者间距为有效的 FRET 距离 23.8 Å，确保 >99% 的 FRET 效率。当 DNase 切割该寡核苷酸探针时，FRET 配对被分离，导致 FRET 消失。（C）FRET 探针在 DNase II 介导切割前后的发射光谱。切割前，FAM 的发射被抑制，而 TAM 的发射较强；DNase 介导的切割使 FAM 与 TAM 分离，恢复 FAM 发射（525 nm 峰值），并消除 TAM 发射（580 nm 下降）。λexcitation = 488 nm。（D）FRET 探针在 DNase II 切割前后的比率检测与电泳分析。上图：FRET 比率（RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm），用于定量反映探针状态。红色：未切割；绿色：经 DNase II 切割。下图：与荧光数据对应的变性 PAGE 凝胶。DNase II 切割产生 FAM 标记的片段（12–16 nt，绿色）和 TAM 标记的片段（20–24 nt，红色），表明切割位点位于发夹结构之间的连接区域，邻近 T23。未切割对照组显示黄色荧光。Ladder：对应于 38-mer 探针 5′ 和 3′ 片段的 FAM 和 TAM 标记寡核苷酸，荧光标记位于原始位置。反应条件：10 mM 醋酸钠缓冲液（pH 5.2），1 pmol/µL FRET 探针，0.0033 U/µL DNase II，37 °C 下反应 24 小时。RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm；λexcitation = 488 nm。UNAFold 条件：1 µM FRET 探针，10 mM Na+，0 mM Mg2+，37 °C。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
尽管各个测试发射光谱的变化显而易见，但对大量发射光谱进行定量比较时，需要一个更便于使用且紧凑的定量参数。这一角色由FRET比率承担。所介绍的荧光方法属于比率型分析方法，这类方法依赖于FRET配对组分荧光发射的直接（双通道）比率来进行定量评估2,9。
该方法利用供体/受体发射光的比值（RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm），该比值与FRET效率相关，可定量表征38-mer的状况（断裂或完整）。ID / IA 比值提供了一种自归一化机制，能够内在地校正探针浓度、激发光强度和光漂白等因素的波动3。该方法仅适用于供体和受体连接在同一探针内的FRET探针，且其比值已知且恒定。因此，该方法无需考虑受体的直接激发或供体串扰问题2。探针中固定的供体-受体化学计量比确保了供体/受体发射光比值不受上述因素变化的影响，直接反映探针的状态。因此，供体-受体发射光比值提供了一个具有内建信号归一化的定量DNA切割参数2,3。
该检测采用 ID / IA 比值（而非相反的 IA / ID 比值），因为该比值可描述探针切割后FRET的终止，因而与DNase活性变化方向一致——随着切割增加而升高。这一点在图1D中得到说明，该图展示了比值型探针在DNase II切割前后其FRET比值及PAGE电泳结果，均对应于图1C中的光谱。为了展示该比值型FRET检测方法的便捷性、时间经济性和操作简便性，本研究将其应用于发现并分析一种弱核酸酶——白细胞弹性蛋白酶抑制剂（LEI）的DNase活性。
弱核酸酶 LEI
蛋白酶抑制剂LEI在天然状态下具有亚稳态，即拓扑结构不平衡。这一特性对其抑制机制至关重要。当靶标蛋白酶切割LEI的反应位点环（RSL）时，该蛋白酶抑制剂分子会发生剧烈的构象变化，从而在机械上将蛋白酶拉伸至失活状态。10,11值得注意的是，这一过程还会断裂并拉伸LEI分子本身，暴露出其天然折叠结构中被掩盖的隐蔽性DNase位点，从而将LEI转化为具有活性的内切核酸酶L-DNase II（LEI衍生的DNase II）11,12酸性条件下，LEI 在硫酸中于 pH 2 环境下过夜孵育可导致其变性与断裂，从而暴露出隐蔽的 DNase 位点。10,13利用该FRET分析研究LEI表明，强烈化学变性处理和靶向酶切并非暴露LEI潜在核酸酶活性所严格必需的步骤。
本文所述的比率型FRET方法及其操作流程揭示了正常非变性LEI中固有的微弱DNase活性。由于该检测方法适用于在不同酸性pH条件下进行长时间观察，从而实现了对未切割LEI内在核酸水解能力的发现与分析。

<table><tbody><tr><td>96 孔板</td><td>Falcon</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>DNA FRET 探针</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3&amp;rsquo;；FAM &amp;ndash; 荧光素-dT；&amp;nbsp;TAM &amp;ndash; 四甲基罗丹明-dT。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>EVOLT 数码单反相机</td><td>Olympus</td><td>E500</td><td></td></tr><tr><td>带电源的凝胶电泳装置</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoprotein</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>LiCOR 凝胶成像系统</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>预制 PAGE 凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠缓冲液 pH 5.2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Tecan</td><td></td><td>Saffire 2</td></tr></tbody></table>

基于比率型荧光共振能量转移的dnase活性评估

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

本实验方案描述了一种简单且灵敏的比率型荧光共振能量转移（FRET）检测方法，用于检测和定量评估脱氧核糖核酸酶（DNase）活性。比率型FRET测量利用供体与受体发射信号的比值进行分析。该检测方法采用一种钉状、双标记的38聚体FRET寡核苷酸探针作为实时DNA切割传感器，用于检测单链DNA断裂。该方法的主要应用是定量评估反应条件（如pH值、温度和缓冲液组成）对DNase活性的影响。由于该方法能够检测到即使非常微弱且缓慢的DNA切割，因此特别适用于需要长时间观察的弱核酸酶活性研究，以及pH值对DNase活性影响的研究。本比率型FRET方案的这些特定优势通过其在白细胞弹性蛋白酶抑制剂（LEI）DNase活性检测与分析中的应用得到了充分展示。

本代表性研究重点阐述了比率型FRET方法在研究需要长时间观察的缓慢酶促反应中的特定优势。具体而言，该应用展示了利用比率型FRET系统检测和分析LEI固有的DNase活性。本研究的结果如图2所示。
利用该方法，我们证明了LEI在弱酸性条件下表现出DNase活性，且无需通过切割或暴露于剧烈化学处理等方式进行酶活化。via 我们确定，这种核酸水解活性是LEI的内在特性，在pH ≤ 5.5的溶液中即可检测到。尽管其活性强度适中，但具有高度稳定性，最适pH范围为4.8至5.2，与DNase II家族成员相似15。然而，与DNase II不同的是，该活性在pH高于5.5时迅速终止，并且其寡核苷酸切割模式也不同于DNase II。
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本研究介绍了一种简单、用户友好的比率型FRET检测方法，用于检测和定量评估DNase活性，并展示了其在弱核酸酶分析中的应用。

基于比率型荧光共振能量转移的DNase活性评估

本方案描述了一种简单且灵敏的比率型荧光共振能量转移（FRET）检测方法，用于检测和定量分析……

我们正在解决在多种阶段条件下需要长时间观察的微弱核酸酶活性的灵敏检测需求。为此，我们开发了这种比率型FRET检测方法，可高灵敏度地检测和测量不同生物分子的DNase活性，并适用于长时间的检测。该实验能够系统地实时评估 pH、温度和缓冲液组成等实验参数对 DNase 活性的影响。首先，将蛋白样品用不同缓冲液稀释至适当浓度，缓冲液 pH 范围为 4.8 至 6.5。通过将 FRET 探针溶解于无核酸酶水中，配制出浓度接近 1 微摩尔或 1 皮摩尔/微升的比率型 FRET 探针溶液。接着，在 96 孔板中为每个待测 pH 条件准备三个孔，每孔加入 70 微升无核酸酶水和 10 微升 10× 缓冲液。在另外三个独立的孔中，通过混合指定试剂制备阳性对照；对于阴性对照，则用无核酸酶水替代蛋白样品。通过向含有不同 pH 值 DNase 蛋白的混合物中加入探针溶液，启动 DNase 反应。充分混匀所有样品，确保不产生气泡。然后，将含有比率型 FRET 探针的 DNase 样品置于 37 摄氏度水浴或温控培养箱中孵育，孵育时间根据 DNase 活性强弱而定。通过向每孔加入 100 微升 pH 8 的 250 毫摩尔 Tris 盐酸缓冲液终止所有孵育反应，此步骤同时使所有样品的 pH 值均一化。pH 均一化后立即使用荧光分光光度计记录供体和受体荧光团的发射光谱。在 96 孔板中直接进行测量，以 488 纳米激发供体荧光团，同时检测 525 纳米处的供体发射信号和 580 纳米处的 FRET 来源受体信号。利用记录的荧光强度评估每个样品的 DNase 活性，随后根据给定公式计算 FRET 比值。通过将每个样品取 15 微升上样至 20% 变性聚丙烯酰胺凝胶，验证 FRET 探针的切割情况，并在 100 伏电压下电泳 1 小时。最后，将凝胶置于配备高分辨率彩色相机的成像系统托盘上，采集凝胶图像。变性聚丙烯酰胺凝胶分析显示，FRET 探针在 pH 4.8 条件下与白细胞弹性蛋白酶抑制剂（leukocyte elastase inhibitor, LEI）孵育 24 小时后发生切割，产生不同长度的、分别标记荧光素酰胺（fluorescein amidite, FAM）和四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine, TAM）的片段。切割产物的大小和标记模式表明，探针的两个发夹结构顶端附近发生了特异性切割，该切割模式与 LEI 产生的独特片段模式一致，且不同于 DNase II 的切割模式。对经 LEI 处理的 FRET 探针的发射光谱分析显示，pH 5.2 时信号变化最大，其次为 pH 4.8，再次为 pH 5.5，表明在该酸性范围内 DNase 活性达到峰值，而对照样品中无显著活性。FRET 比值的定量分析进一步证实，LEI 在 pH 5.2 时的活性显著高于 pH 4.8，而这两个 pH 下的活性均明显高于 pH 5.5，且当 pH 超过 5.5 时活性急剧下降。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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基于比率型荧光共振能量转移的DNase活性评估

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