利用小脑器官型培养物在浦肯野细胞中可视化DNA损伤应答

我们的研究重点是了解一种称为共济失调-毛细血管扩张症（ataxia-telangiectasia，简称 A-T）的人类遗传病。该疾病由蛋白激酶 ATM 的缺失引起。ATM 具有多种功能，而 A-T 则表现为多种症状。

但A-T的主要症状是进行性小脑变性。目前尚不清楚ATM蛋白众多功能中，究竟是哪一种功能的丧失直接导致了这一毁灭性症状。我们正试图研究A-T研究中的这一核心问题，为此我们采用了来自野生型和ATM缺陷型小鼠的小脑器官型培养体系。

它们使我们能够聚焦于共济失调毛细血管扩张症（A-T）患者退化小脑中最先丢失的细胞类型——浦肯野细胞。与生命科学领域的许多研究方向一样，A-T 研究也借助了多种先进技术和方法，这些方法包括动物模型、新型组织培养技术、诱导性多能干细胞、前沿成像技术、诱导组学方法以及单细胞部分成像技术。

共济失调-毛细血管扩张症（A-T）中 cerebellar 退变的根源在于浦肯野细胞的退化。这些细胞以难以分离著称，且在缺乏其他细胞类型支持的情况下无法在培养中存活。一个独特的实验挑战是利用诱导性多能干细胞技术获得成熟且具有功能的人类浦肯野细胞。

由于目前无法培养分离的浦肯野细胞，细胞型器官培养为在培养皿中于其天然组织环境中研究这些细胞提供了宝贵的机会。以蛋白质相关性作为DNA损伤反应的读出指标具有重要信息价值，特别是针对浦肯野细胞而言。ATM蛋白激酶的主要功能是调控DNA损伤反应，这对于维持基因组完整性和细胞稳态至关重要，因为每个细胞都会持续发生DNA损伤。

我们需要确定在ATM缺陷型浦肯野细胞中修复功能异常的关键DNA损伤，我们希望利用这些小脑器官型培养物来实现这一目标。这将有助于我们更深入地理解共济失调毛细血管扩张症（A-T）最重要且最具破坏性症状——小脑变性——的生理与分子基础。首先，在六孔板的每个孔中加入一毫升的BME基础培养基。

使用无菌镊子将单细胞培养小室放入每个孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，孵育至少两小时。在生物安全柜内准备好解剖区域后，先用70%乙醇清洗手术器械，再用PBS冲洗。

然后，将已处死的动物置于解剖区域，在远离小脑的位置用剪刀做一小切口以暴露脑组织。使用圆头镊子轻轻剥离颅骨，并以小块方式逐步去除颅骨，避免损伤小脑组织。暴露脑组织后，取出小脑，并使用精细弯头虹膜分离铲切断三对小脑脚，使小脑皮层与脑干分离。

然后，将解剖刀片插入小脑、上丘和脑干之间，以分离并取出小脑。首先，从一只出生10天的小鼠幼崽中获取处于冰冷解剖缓冲液中的小脑组织。去除多余缓冲液后，将小脑垂直放置在切割平台上。

以350微米的切片厚度进行矢状切片。用细小的虹膜铲轻轻分离切片，并将其放入冷的解剖液中。在双目显微镜下，使用两把弯头虹膜铲小心地将组织切片彼此分开。

进行培养时，使用来源于器官中线皮质核区的小脑蚓部的组织切片。用宽铲将每一片组织切片转移至培养插件上。将承载组织切片的每个插件移入六孔板的孔中，孔内已预先加入温育过的培养基。

孵育期间，使用无菌玻璃移液管吸除用过的培养基。用5毫升血清移液管，沿孔壁缓缓加入1毫升新鲜的Eagle基础培养基，注意不要扰动组织。首先，将从10日龄小鼠幼崽中获取的切碎的小脑组织置于Eagle基础培养基中进行培养。

将DNA损伤性化学物质直接加入培养基中，调整至适当的终浓度。暴露一段时间后，更换为新鲜配制的含有DNA损伤性化学物质和聚ADP-核糖糖水解酶抑制剂的混合培养基，继续孵育30分钟。30分钟后，用0.1摩尔磷酸缓冲液在室温下洗涤组织切片，随后立即用预冷的丙酮与甲醇混合液进行固定。

将培养板在 -20 摄氏度孵育 20 分钟。然后去除固定液，并用 0.4 mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤。向 48 孔板的每个孔中加入 100 µL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液。

然后使用手术刀和切板切除插件边缘，沿组织切片周围进行切割。将切片放入48孔板的一个孔中。吸除缓冲液后，加入100微升含有1% Triton X-100的0.1摩尔磷酸盐缓冲液，孵育插件。

吸出溶液，随后将小室依次放入各孔中，在摇床上用适量的封闭液孵育，接着进行一抗和二抗孵育。在二抗孵育结束前20分钟，向每孔加入20微升终浓度的DAPI溶液，继续摇床孵育20分钟。用于封片时，将组织面朝上放置于显微镜载玻片上。

加入封片剂，并用盖玻片覆盖。将切片置于平坦表面，在4°C避光条件下静置过夜使其干燥。小脑叶结构在培养过程中得以保持。

浦肯野细胞经Calbindin D-28k染色，神经元核经NeuN染色。浦肯野细胞中的星形胶质细胞经GFAP染色。经溴酸钾和百草枯处理后，浦肯野细胞中PAR染色增强，提示DNA损伤。