Name: 人嵌合抗原受体调节性 T 细胞的产生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 了解人嵌合抗原受体调节性T细胞的制备流程，用于自身免疫疾病、癌症和移植排斥的免疫治疗研究。本方法通过优化CAR亲和力改善Treg细胞因子谱和功能。

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LMRF 由人类胰岛研究网络（HIRN）1型糖尿病新兴领袖资助项目 U24DK104162-07、美国癌症协会（ACS）机构研究资助项目 IRG-19-137-20、南卡罗来纳临床与转化研究（SCTR）试点项目探索资助 1TL1TR001451-01、糖尿病研究连接（DRC）资助项目 IPF 22-1224 以及 Swim Across America 资助项目 23-1579 提供资金支持。RWC 得到细胞、生物化学与分子科学培训资助项目 T32GM132055 以及霍林斯癌症中心 Lowvelo 研究生奖学金的支持。本研究部分由南卡罗来纳医科大学霍林斯癌症中心流式细胞术与细胞分选共享资源（P30 CA138313）提供支持。特别感谢加州大学旧金山分校（UCSF）的 Qizhi Tang 博士慷慨赠送 CAR 突变体质粒。

Engineering and Expansion of Human CAR Tregs for Immune Regulation Therapies

<ol><li>Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy+in+hematological+malignancies%3A+current+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges.</a> Front Immunol. 13, 927153(2022).</li>
<li>Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcomes+following+CAR+T+cell+therapy%3A+what+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).</li>
<li>Choi, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+CARv3-TEAM-E+T+cells+in+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma.</a> N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+delivery+of+IL-13Ralpha2-targeting+CAR-T+cells+in+recurrent+high-grade+glioma%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).</li>
<li>Bagley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+bivalent+CAR+T+cells+targeting+EGFR+and+IL13Ralpha2+in+recurrent+glioblastoma%3A+phase+1+trial+interim+results%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results.</a> Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).</li>
<li>Ghobadinezhad, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+regulatory+cell-based+therapy+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease.</a> Front Immunol. 13, 1075813(2022).</li>
<li>Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and immune tolerance.</a> Cell. 133 (5), 775-787 (2008).</li>
<li>Sakaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and human disease.</a> Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).</li>
<li>Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regulatory+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Next-generation regulatory T cell therapy.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+human+autoimmunity%3A+current+practice+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Treating human autoimmunity: current practice and future prospects.</a> Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121(2012).</li>
<li>Sawitzki, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+cell+therapy+in+kidney+transplantation+%28The+ONE+Study%29%3A+a+harmonised+design+and+analysis+of+seven+non-randomised%2C+single-arm%2C+phase+1%2F2A+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials.</a> Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).</li>
<li>Spanier, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+with+an+MHC+class+II+peptide-specific+chimeric+antigen+receptor+prevent+autoimmune+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice.</a> J Clin Invest. 133 (18), e168601(2023).</li>
<li>Muller, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+engineering+of+an+anti-HLA-A2+chimeric+antigen+receptor+in+regulatory+T+cells+for+transplant+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance.</a> Front Immunol. 12, 686439(2021).</li>
<li>MacDonald, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen-specific+regulatory+T+cells+generated+with+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).</li>
<li>Boardman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-specific+human+CAR+Tregs+for+immune+regulation+in+IBD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD.</a> J Autoimmun. 134, 102961(2023).</li>
<li>Schreeb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+design%3A+human+leukocyte+antigen+Cclass+I+molecule+A%28%2A%2902-chimeric+antigen+receptor+regulatory+T+cells+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int+Rep%22%5BJournal%5D)">Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation.</a> Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).</li>
<li>Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+human+conventional+and+regulatory+T+cells+using+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors.</a> Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+decrease+of+donor-reactive+T%28regs%29+after+liver+transplantation+limits+T%28reg%29+therapy+for+promoting+allograft+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans.</a> Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628(2022).</li>
<li>Bender, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+2+randomized+trial+with+autologous+polyclonal+expanded+regulatory+T+cells+in+children+with+new-onset+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes.</a> Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404(2024).</li>
<li>Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conference+report%3A+Advanced+Therapies+Week+2023%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Conference report: Advanced Therapies Week 2023.</a> Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).</li>
<li>Cochrane, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+test+human+CAR+T+cells+in+solid+tumors%2C+the+next+frontier+of+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy.</a> Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).</li>
<li>Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efficiency+of+gamma-irradiated+versus+mitomycin+C-treated+feeder+cells+for+the+expansion+of+normal+human+cells+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematother+Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures.</a> J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Production+everywhere%3A+a+simple%2C+fast%2C+and+reliable+protocol+for+in-house+AAV+vector+production+based+on+chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction.</a> Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).</li>
<li>Velasco Cardenas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+CD3+diversity+to+optimize+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells.</a> Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).</li>
<li>Boomer, J. S., Green, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enigmatic+tail+of+CD28+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">An enigmatic tail of CD28 signaling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436(2010).</li>
<li>Suhoski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).</li>
<li>Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+human+T+cell+subsets+with+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transduction of human T cell subsets with lentivirus.</a> Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).</li>
<li>Bailey-Bucktrout, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-antigen-driven+activation+induces+instability+of+regulatory+T+cells+during+an+inflammatory+autoimmune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response.</a> Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+Helios-deficient+Tregs+is+associated+with+conversion+to+a+T-effector+phenotype+and+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).</li>
<li>Dawson, N. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+chimeric+antigen+receptor+co-receptor+signaling+domains+in+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells.</a> Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866(2020).</li>
<li>Rana, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-+and+TRuC-redirected+regulatory+T+cells+differ+in+capacity+to+control+adaptive+immunity+to+FVIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII.</a> Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).</li>
<li>Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+human+T+regulatory+cells+with+the+mTOR-inhibitor+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin.</a> Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).</li>
<li>Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+allelic+exclusion%3A+an+update+and+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal.</a> J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Samarasinghe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+alloreactive+T+cells+identifies+CD25+and+CD71+as+optimal+targets+for+a+clinically+applicable+allodepletion+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy.</a> Blood. 115 (2), 396-407 (2010).</li>
<li>Voss, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP3+protects+conventional+human+T+cells+from+premature+restimulation-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).</li>
<li>Collison, L. W., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Treg+suppression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro Treg suppression assays.</a> Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).</li>
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LMRF 是发明人，已从工程化免疫细胞相关专利中获得专利使用费，并为 Guidepoint Global 和 McKesson 提供咨询服务。其余作者声明不存在利益冲突。

本方案提供了一种简化的综合性方法，用于生成和评估人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR Tregs）。CAR技术在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得的成功，推动了其在具有免疫抑制功能的T细胞亚群——调节性T细胞（Tregs）中的应用。与传统的T细胞不同，Tregs能够抑制免疫反应，因此在治疗由异常免疫应答引起的疾病方面具有潜在价值，例如自身免疫病、器官移植排斥反应、移植物抗宿主病以及过敏反应。9利用CAR Treg可实现抗原特异性治疗，有望避免广谱免疫抑制剂相关的副作用11. 这里我们描述 体外 验证CAR工程化Treg细胞谱系稳定性和功能的方案。尽管本文未予讨论，免疫缺陷型NSG小鼠为测试人源CAR Treg细胞功能提供了可能 体内 在移植物抗宿主病和器官移植模型中13,14在向人类应用之前的一个重要步骤。
本方案中的关键步骤是使用连续的磁珠...

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗，使以往无法治疗的癌症达到极高的缓解率1,2。早期在胶质母细胞瘤治疗中应用CAR T细胞所取得的令人鼓舞的结果3,4,5，凸显了CAR技术的多功能性及其未来靶向多种恶性肿瘤的潜力。随着该领域不断探索CAR的更多应用，调节性T细胞（Tregs）已成为一种极具前景的细胞类型。Tregs在维持免疫稳态方面发挥着关键作用，并通过多种机制调控免疫反应，包括隔离IL-2、分泌免疫抑制性细胞因子以及调节抗原呈递细胞6,7。
利用CAR技术，Treg细胞可被用于治疗器官移植排斥、自身免疫性疾病以及过敏和哮喘等炎症性疾病6,8,9。CAR Treg细胞有望通过减少对免疫抑制药物的依赖，显著改善患者的预后和生活质量，因为这些药物会整体抑制免疫系统，并伴随严重的不良反应10,11。在临床前模型中，将CAR技术应用于Treg细胞已显示出令人鼓舞的结果，在1型糖尿病、多发性硬化症、移植物抗宿主病和炎症性肠病等疾病中均取得了成功应用9,12,13,14,15。目前，临床研究正在探索CAR Treg细胞在预防实体器官移植排斥中的应用16。
本文介绍了一种生成人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR Treg）的详细方法。该方案包括从人外周血中分离调节性T细胞（Treg），并利用慢病毒转导、CRISPR/Cas9基因编辑结合腺相关病毒（AAV）载体介导的精确基因敲入等技术对其进行遗传修饰。我们还描述了对这些工程化Treg细胞表型稳定性及抑制功能的评估方法，这些是验证其治疗潜力的关键步骤17,18,19。该方法简化了CAR Treg疗法的设计与早期测试流程，有望将CAR T细胞疗法的变革性影响拓展至免疫系统的调控领域。通过分享本方法，我们希望推动CAR Treg疗法这一新兴领域的进一步研究与创新9,20。

<table><tbody><tr><td>腺相关病毒&amp;nbsp;(AAV)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>表达CAR靶标的K562细胞</td><td></td><td></td><td>例如，CD19-K562</td></tr><tr><td>铯-137辐照仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗人CD8 PerCP（克隆SK1）</td><td>Biolegend</td><td>344708</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD4 PE/Cy7（克隆SK3）</td><td>Biolegend</td><td>344612</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15磁力架</td><td>ThermoFisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Ghost BV510活率染料&amp;nbsp;</td><td>TONBO</td><td>13-0870-T100</td><td></td></tr><tr><td>K562细胞</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵溶液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD127 PE（克隆hIL-7R-M21）</td><td>BD Biosciences</td><td>557938</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD25 APC（克隆BC96）</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>302610</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD4 FITC（克隆SK3）</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>344604</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD71 PE（克隆SK1）</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>抗人CD8 PerCP（克隆SK1）</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>抗人CTLA-4 PerCP-e710</td><td>ThermoFisher</td><td>46-1529-42</td><td></td></tr><tr><td>抗人EGFR APC（克隆AY13）</td><td>Biolegend</td><td>352905</td><td></td></tr><tr><td>抗人FOXP3 eFluor 450</td><td>ThermoFisher</td><td>48-4776-42</td><td></td></tr><tr><td>抗人HELIOS PE</td><td>Biolegend</td><td>137216</td><td></td></tr><tr><td>无Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;和Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪（TC20全自动细胞计数仪）</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数载玻片</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet细胞增殖检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>C34571</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep磁力架&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep人CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep人CD8&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T细胞富集试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>EasySep磁力架&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3转录因子染色缓冲液套装</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>带滤网螺帽的Falcon圆底聚苯乙烯试管，5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>CytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2</td></tr><tr><td>荧光激活细胞分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACS Aria III细胞分选仪</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>人CD3/28 T细胞扩增与激活Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Neon转染系统</td><td>ThermoFisher</td><td>10431915</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Neon转染系统100 &amp;mu;L试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>10114334</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒</td><td>VectorBuilder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Myc标签抗体A647（克隆9B11）</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2233S</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I减血清培养基</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>重组人白细胞介素-2（rhIL-2）</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基，不含谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>光谱流式细胞仪</td><td>Cytek</td><td></td><td>Northern Lights</td></tr><tr><td>TRAC gRNA</td><td>Synthego</td><td></td><td>序列（CAGGGTTCTGGATATCTGT）</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9蛋白v2</td><td>ThermoFisher</td><td>A36496</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T8154-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1/10 Leukopak</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0092</td><td>10-20亿PBMC</td></tr></tbody></table>

人源嵌合抗原受体调节性t细胞的制备

Generation of Human Chimeric Antigen Receptor Regulatory T Cells

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法彻底改变了癌症治疗的格局，使先前无法治愈的血液系统恶性肿瘤实现了创纪录的缓解率。这些成功推动了将CAR技术平台拓展至一小部分关键的CD4+ 主要负责调节和抑制免疫反应的T细胞，即调节性T细胞（Tregs）。将Tregs的免疫抑制活性重定向至任意细胞外靶点的能力，对于开发治疗自身免疫性疾病、器官移植排斥反应以及移植物抗宿主病的细胞疗法具有重大意义。本文详细描述了以下方法 真正有效的 从人外周血中分离Treg细胞，利用慢病毒或借助腺相关病毒介导的同源定向修复（HDR）模板递送实现CRISPR/Cas9辅助的基因敲入技术对人Treg细胞进行遗传修饰，以及 离体 稳定人源CAR Treg的扩增。最后，我们描述了人源CAR Treg表型稳定性的评估方法 体外 抑制功能，这为了解人源CAR Treg在临床前和临床应用中的行为提供了见解。

本文所述方案提供了一种简化且标准化的流程，用于评估人调节性T细胞（Tregs）中的新型嵌合抗原受体（CAR）结构，旨在开发用于自身免疫病、移植物抗宿主病、器官移植排斥反应及过敏等疾病的活体治疗手段。 图1 展示我们如何利用FACS从外周血中获得高纯度的人类Treg细胞图1A），通过检测其Treg谱系转录因子FOXP3和HELIOS的高水平表达来评估 离体 扩增（图1B).
我们介绍了两种在人调节性T细胞（Tregs）中进行基因修饰的方法：慢病毒转导（图2）和CRISPR/Cas9介导的基因敲入（图3），两种方法均具有较高的效率。我们委托第三方合成慢病毒骨架载体，并进行慢病毒的生产与滴定，随后将病毒运送至本实验室，并在-80 °C保存直至使用。然而，也可通过在HEK293...

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR Tregs）。

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法彻底改变了癌症治疗的格局，使此前无法治愈的某些癌症患者达到创纪录的缓解率……

我们的实验室设计人工免疫受体（如嵌合抗原受体），并研究这些受体如何影响调节性T细胞的生物学特性。通过设计新的DNA序列并利用人源化小鼠疾病模型，我们致力于开发用于自身免疫性疾病、移植排斥、癌症和衰老的工程化免疫细胞疗法。在为调节性T细胞设计嵌合抗原受体时，必须充分考虑其强度。高亲和力的CAR Treg细胞更类似于效应T细胞，会产生更多的炎症性细胞因子，并表现出更强的杀伤活性。我们正在进行的研究表明，降低CAR的亲和力可改善CAR Treg细胞的细胞因子谱和功能。CAR Treg领域尚处于初期阶段，缺乏标准化。 本方案介绍了一种稳定且通用的CAR Treg制备与检测方法。该方法可提高实验的可重复性，加快创新进程，同时为刚进入CAR Treg研究领域的实验室提供指导，尤其考虑到Treg细胞稀缺及实验条件要求较高的挑战。我们致力于研究调节性T细胞维持免疫平衡及促进组织修复的机制。我们的研究包括了解CAR Treg的信号传导和功能，以及探索CAR Treg疗法相较于现有策略可能具有独特优势的新疾病应用场景。首先，将白细胞富集包（leukopak）中的内容物转移至一个50毫升的锥形管中。加入等体积含2%胎牛血清的DPBS，并用移液器轻轻混匀。在室温下以300g离心10分钟。吸除上清液后，用含有2%胎牛血清的2毫升DPBS重悬细胞沉淀。然后，向细胞悬液中加入8毫升氯化铵溶液，并通过轻柔颠倒混匀。离心后，将洗涤后的细胞在室温下以150g离心10分钟。吸除上清液后，用含2%胎牛血清的30毫升DPBS重悬细胞沉淀。随后，将10⁸至10⁹个PBMC在室温下以500g离心5分钟。将细胞重悬于细胞分离缓冲液中，浓度为每毫升五乘以十的七次方个细胞。对于调节性T细胞的荧光辅助细胞分选，将CD4阳性细胞在500×g离心5分钟。然后，将细胞重悬于200微升DPBS中。每一百万个细胞加入一微升抗人CD4 FITC、一微升抗人CD25 APC和一微升抗人CD127 PE。轻轻涡旋混匀试管后，置于4°C冰箱中孵育30分钟。用含2%胎牛血清的10毫升DPBS洗涤细胞后，在500×g离心5分钟，然后将染色后的细胞轻轻重悬于含2%胎牛血清的DPBS中，浓度为1.5×10⁷个细胞/毫升。接着，将染色后的细胞悬液通过40微米滤膜帽加入荧光辅助细胞分选管中。准备含有3毫升RPMI10培养基的15毫升收集管，并将其置于冰上。最后，使用荧光辅助细胞分选技术分选出CD4阳性、CD25高表达、CD127阴性的调节性T细胞，以及CD4阳性、CD25低表达、CD127阳性的常规T细胞。首先，取激活后48小时从人血中分离的调节性T细胞并重悬。计数细胞后，在室温下以500g离心5分钟。将调节性T细胞重悬于RPMI10培养基中，浓度为每毫升1.25×10⁶个细胞，并加入每毫升1,000国际单位的白细胞介素-2。随后，将每份慢病毒分装液加入含有2.5×10⁵个调节性T细胞的200微升溶液中，置于微量离心管内。在32°C下以1,000g离心一小时。将每个200微升反应体系转移至24孔板中。将转导的调节性T细胞与24孔板一起置于组织培养箱中孵育过夜。用RPMI10培养基将每个孔补至2毫升，使终浓度为每毫升1,000国际单位的白细胞介素-2。使用流式细胞术评估基因修饰效率，如图所示。首先，在激活48小时后，取重悬的调节性T细胞与抗CD3和CD28磁珠混合于15毫升锥形管中。将细胞悬液置于磁铁中孵育三分钟。在磁力作用下，用移液器将培养基中的细胞转移至新离心管中。去除磁珠后，让去除了磁珠的调节性T细胞在RPMI10中静置两小时。然后，在500g条件下离心调节性T细胞5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于预热的低血清培养基中，细胞密度为每毫升4×10⁶个细胞。将细胞分装至低蛋白结合的1.5毫升离心管中，每管100微升。向每个样本中加入嗜性抗原受体腺相关病毒，感染复数为 20,000，并重悬。然后将反应管置于组织培养孵箱中孵育 1 小时。在孵育期间，通过将 8.3 微升 Cas9 蛋白加入 2.5 微升靶向 track 基因位点的单导 RNA 中，制备 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物。将组分充分混合后，在组织培养孵育箱中37摄氏度孵育核糖核蛋白混合物15分钟。接着，用3毫升高渗透压电穿孔缓冲液填充一支新的电穿孔管。将装有缓冲液的电穿孔管插入电穿孔系统的移液站，直至听到咔嗒声。在电穿孔系统中设置电穿孔条件为 2,200 伏、20 毫秒、一次脉冲。腺相关病毒孵育一小时后，将细胞与病毒在室温下以 300 ×g 离心五分钟。吸除上清液后，每份样品用 100 µL 电穿孔系统提供的细胞重悬缓冲液重悬细胞沉淀。然后，每份样品中加入10.8 µL核糖核蛋白复合物，用移液器充分混匀，避免产生气泡。接着，将移液器推至第二档，压开夹钳，插入100 µL电穿孔尖端。将移液器的顶部插入电穿孔尖端，直至夹钳牢固地卡在活塞的安装杆上。在保持向下压力的同时逐渐松开按钮，确保吸头紧密贴合，无任何缝隙。然后将移液器按至第一档，将电穿孔吸头浸入细胞核糖核蛋白混合物中。轻柔地将样品吸入移液器，避免产生气泡。将装有电穿孔尖端并含有样品的移液器垂直插入E管中，直至听到咔嗒声。确认人调节性T细胞的最佳设置后，按下触摸屏上的“开始”按钮以对细胞进行电穿孔。等待触摸屏显示完成。轻轻移除移液管，并立即将样品转移至已准备好的六孔板中，每孔含有2.5毫升预热的无抗生素RPMI10培养基，并添加白细胞介素-2。轻轻以直线动作摇动培养板后，将其放入组织培养孵育箱中。次日（16至18小时后），更换为含抗生素的培养基。计数电穿孔的调节性T细胞，并以每毫升10的6次方个细胞的密度，加入每毫升1,000国际单位的白细胞介素-2进行培养。

generation-of-human-chimeric-antigen-receptor-regulatory-t-cells

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人嵌合抗原受体调节性 T 细胞的产生

我们介绍一种从单一人血供体中分离获得调节性T细胞、记忆性T细胞和初始T细胞的方法。在遗传同质性的条件下，可将极化后的调节性T细胞与其他T细胞亚群在多种遗传学和功能学实验中进行比较，其中包括本文详细描述的抑制功能实验。...

从人初始T细胞和记忆T细胞诱导生成调节性T细胞

本视频展示了一种制备嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术 离体...

一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。...

一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

本视频演示了一种通过逆转录病毒转导生成抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将活化的小鼠CD8+...

一种生成抗原特异性CAR T细胞的技术

我们介绍了一种可靠生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并在体外和体内检测其分化与功能。...

制造用于过继性免疫治疗的嵌合抗原受体（CAR）T细胞

本方案概述了将目的基因转导至原代人T细胞的过程，确保符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。...

一种符合药品生产质量管理规范的基因修饰T细胞制备流程

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。...

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本文介绍了一种生成缺氧敏感型嵌合抗原受体（CAR）-T细胞及其功能验证的实验方案。该方案描述了基于慢病毒系统生成缺氧敏感型CAR-T细胞的方法，并对其进行了表征，包括验证缺氧依赖性的CAR表达以及选择性细胞毒性。...

缺氧敏感型嵌合抗原受体T细胞的生成与功能验证

CD4+调节性T细胞是强大的免疫调节因子，在免疫稳态中发挥重要作用。由于外周血中这类细胞数量稀少，使其功能研究具有挑战性，特别是在HIV-1感染的背景下。本文介绍一种从HIV-1感染者外周血中分离并扩增功能性CD4+...

从HIV-1感染者体内扩增调节性T细胞的新工具

了解人嵌合抗原受体调节性T细胞的制备流程，用于自身免疫疾病、癌症和移植排斥的免疫治疗研究。本方法通过优化CAR亲和力改善Treg细胞因子谱和功能。

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

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