固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

我们的实验室研究常用麻醉剂对睡眠相关神经元及其通讯通路的影响。我们的目标是更深入地理解麻醉剂如何影响内源性睡眠通路，以及如何干扰围手术期的睡眠与认知功能。近期，我们确定了某些类型全身麻醉剂引起睡眠改变的解剖学基础。

我们通过使用经过基因改造的小鼠来实现这一目标，这些小鼠内源性表达神经元激活标志物 C-fos。然而，利用这一新技术，我们将能够直接测量与睡眠相关的脑干神经元群体的细胞兴奋性。相比仅通过量化 C-fos 表达作为神经元激活的替代指标，这一方法具有显著优势。

下一步，我们将探究由某些类型全身麻醉药诱导的睡眠变化所涉及的细胞与分子机制。这包括使用神经像素探针测量与睡眠相关的脑干神经元的细胞兴奋性，以及采用空间转录组学方法对这些区域中与睡眠相关的基因表达进行定量和定位分析。首先，通过将糠醛烷氧基包被的不锈钢丝焊接到一个三针连接器接头上，制作皮层脑电图（ECoG）头戴装置。

根据小鼠立体定位图谱确定插入坐标后，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪框架中。将动物的鼻部放入鼻锥内，并用头部固定杆稳定头部。随后进行足趾夹捏测试，以检查麻醉深度。

在顶骨和枕骨上方做一处5毫米的头皮切口后，用手术刀刀片刮除脑膜并将其去除。使用手术刀刀片切断肌肉附着处，暴露顶骨和枕骨。使用过氧化氢控制出血，并干燥颅骨表面。

接下来，确定颅骨上的前囟点（bregma）和人字缝点（lambda）解剖标志。然后，调整鼻锥位置，使颅骨的前后方向处于水平。为使颅骨的内外侧方向水平，从前囟点与人字缝点之间选取两个对称的相对点，并检查其水平度。

现在测量前囟与后囟之间的距离，并将其与Franklin Paxino立体定位图谱中报告的距离进行比较。利用实测距离与报告距离之间的差异，按比例调整前后坐标。使用无菌铅笔在颅骨上标记开颅坐标。

使用立体定位仪微操作器，将头固定板直接置于人字缝上方。在头固定板及其周围涂抹牙科水泥，以将其固定在颅骨上，并静置干燥10分钟。随后，钻出两个皮层电极和一个参考电极的钻孔。

将镀层银丝电极的裸露端置于钻孔内，并使用紫外线激活树脂固定。用牙科水泥完全覆盖镀层不锈钢丝，确保无任何金属丝外露。再用牙科水泥覆盖头戴装置的底部和侧面，以确保其牢固固定，并让小鼠恢复七天。

将麻醉后的小鼠置于立体定位仪框架中。确定前囟和后囟位置，确保这两个标志点之间的高度差不超过100微米。用无菌铅笔在颅骨上找到并标记计算出的坐标位置。

在坐标周围绘制一个2毫米×2毫米的颅骨开窗轮廓。检查麻醉深度后，使用高速钻头制作一个2毫米×2毫米的颅骨开窗。滴加0.5至1毫升生理盐水，以防止脑表面干燥。

使用注射器针头和精细镊子去除硬脑膜。接着，使用高速钻头在颅骨窗口附近一到两毫米处为硅探针的参考电极单独钻一个骨孔。在颅骨上涂抹0.2毫升低毒性硅胶粘合剂，以完全封闭开颅部位。

使用头板和螺丝将小鼠头部固定在电生理记录装置上。然后，用荧光染料涂抹硅探针的探针杆，以便在实验后重建探针的轨迹。接着，将探针安装到操纵器上，并设定所需角度。

为了将记录探针降至颅窗中心的脑表面，需手动将探针插入至大约 300 微米的深度。插入至该深度后，以每分钟 200 微米的速度自动缓慢降低探针至目标深度，以尽量减少组织损伤。最后，在颅骨开窗内的脑表面滴加矿物油，以防止组织干燥。

然后，使用 Intan 记录控制器以 30 千赫兹的频率记录硅探针和皮层脑电图（ECOG）的数据。大多数记录到的神经元在七氟烷麻醉期间放电减少。vlPAG 的放电率从基线到七氟烷麻醉期间显著降低。

这种减少在所有腹外侧导水管周围灰质神经元中均一致存在。