Name: 来自头部固定小鼠脑干的急性单单位多电极记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习头部固定小鼠脑干急性单单位多电极记录技术，用于研究全身麻醉对腹外侧中脑导水管周围灰质睡眠相关神经元放电活动的影响。该方法可直接测量细胞兴奋性变化。

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图1、图3、图4、图8 和 图9 使用 BioRender.com 制作。我们感谢 Scott Kilianski 在 MATLAB 代码方面的帮助以及分享他的脚本。感谢 Anna Grace Carns 在探针轨迹重建方面的协助。

所有研究均经弗吉尼亚大学（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）机构动物护理和使用委员会批准。实验使用了5只雄性C57BL/6J&#160;小鼠，年龄为3-7个月，体重25-30 g&#160;。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。
1. 头部固定板和头戴装置的植入
<ol>
	<li>通过将全氟烷氧基（PFA）包被的不锈钢丝焊接到3针连接器插头上，制作一个ECoG头戴装置（图2A）。</li>
	<li>根据小鼠立体定位图谱确定插入坐标17。当文献中相关信息较少时，使用勾股定理计算探针插入的角度和深度是一个合理的起点（图1）18。 
	注意：最终坐标需通过反复试验进行调整。为靶向vlPAG，在成年小鼠中使用的坐标如下：前后向（AP）-3.6 mm，内外侧（ML）+0.5 mm，背腹向（DV）-4 mm。探针以20°角（AP方向）插入。</li>
	<li>将小鼠置于诱导室中，使用1.5%-3%异氟烷与氧气混合气体诱导全身麻醉。麻醉后，将小鼠固定于立体定位仪框架中，鼻部置于鼻罩内，并用头夹固定头部。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜损伤。使用温控系统将体温维持在37 °C。</li>
	<li>在头皮区域使用脱毛膏或剃除毛发，随后用聚维酮碘和70%酒精消毒。采用“仅限操作尖端”的无菌技术以维持无菌手术区域。</li>
	<li>进行足趾夹捏测试以检查麻醉深度。</li>
	<li>给予镇痛处理：皮下注射卡洛芬（carprofen）2.5 mg/kg。</li>
	<li>做一条5 mm长的头皮切口，去除顶骨和枕骨上方的圆形皮肤区域。用手术刀片轻轻刮除脑膜。</li>
	<li>使用手术刀片切断肌肉附着点，暴露顶骨和枕骨19。根据需要使用过氧化氢控制出血并干燥颅骨表面。必须在干燥的颅骨上涂抹牙科水泥和树脂，以确保牢固粘合。</li>
	<li>首先识别颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）标志点20。然后调整鼻罩位置，使颅骨的前后方向水平，确保这两个标志点之间的高度差不超过100 µm。</li>
	<li>为校准颅骨的内外侧方向水平，从前囟与后囟之间选取两个对称点，每个点距离矢状缝1 mm，并检测其水平度。若两点间高度差超过100 µm，则通过调节头夹来调整颅骨的内外侧位置。</li>
	<li>测量前囟与后囟之间的距离，并与Franklin-Paxinos立体定位图谱中报告的距离（通常为4.2 mm）进行比较17。利用实测距离与标准距离的差异，按比例缩放AP坐标。使用灭菌铅笔在颅骨上标记开颅位置。 
	注意：如果实测的前囟-后囟距离不等于4.2 mm，则需按比例缩放坐标。立体定位图谱中报告的所有AP坐标均对应于标准化的前囟-后囟距离。由于小鼠颅骨大小存在个体差异，因此必须相应调整坐标。</li>
	<li>使用立体定位微操器，将头固定板直接放置在后囟缝上方，并通过在头板及其周围涂抹牙科水泥将其固定于颅骨上（图3A、B）。至少等待10分钟使水泥完全干燥。</li>
	<li>钻出三个直径为0.5 mm的骨孔，分别用于两个皮层电极（额叶皮层和顶叶皮层）以及一个作为参考电极的电极（小脑）。将包被银丝电极裸露端（0.5 mm）置入骨孔中，并使用紫外光活化树脂固定。</li>
	<li>用牙科水泥完全覆盖包被的不锈钢丝，确保无任何金属丝暴露。同时用牙科水泥覆盖头戴装置的底面和侧面，使其牢固固定。确保头戴装置固定后，前囟和后囟缝仍清晰可见（图2B）。</li>
	<li>让小鼠至少恢复7天，每天检查动物状况及手术部位是否存在异常。根据需要给予镇痛药（卡洛芬 2.5 mg/kg，皮下注射）。</li>
</ol>
2. 硅探针放置与记录
<ol>
	<li>使小鼠适应记录装置和头部固定（在两个不同的日期各至少1.5小时）图 2D).</li>
	<li>记录当天，将小鼠放入麻醉室（氧气中异氟烷浓度为1.5%–3%）。</li>
	<li>将小鼠置于立体定位仪中，按照1.3步骤所述调整鼻锥和头夹位置，维持麻醉状态&#160;（氧气中异氟烷 1.5%-3%）贯穿整个立体定位手术过程。&#160;通过脚趾夹捏测试检查麻醉深度。</li>
	<li>涂抹眼药膏于眼睛，并维持适当的体温。</li>
	<li>确定前囟和后囟，确保这两个解剖标志之间的高度差不超过100 µm。</li>
	<li>用无菌铅笔在颅骨上找到并标记计算出的坐标，然后在坐标周围绘制一个 2 mm × 2 mm 的颅窗轮廓。</li>
	<li>通过脚趾捏压测试检查麻醉深度。</li>
	<li>使用高速钻头制作一个 2 mm × 2 mm 的颅骨开窗。滴加 0.5–1 mL 生理盐水，防止脑表面干燥。用注射器针头和精细镊子去除硬脑膜。 
	注意：注意避开主要血管（上矢状窦、横窦），以防止大量出血（图3).</li>
	<li>使用高速钻头为硅探针的参考电极单独钻一个环形孔，通常位于颅窗周围约1-2 mm处。</li>
	<li>使用附带的涂抹工具，将0.2 mL低毒性硅胶粘合剂涂于颅骨上，完全封闭开颅部位。</li>
	<li>让小鼠恢复约1小时。</li>
	<li>使用头板和螺丝将小鼠头部固定在电生理记录装置上（图 2D).</li>
	<li>用荧光染料DiI（DiI:乙醇 = 1:4）包被硅探针杆，以便实验后可重建探针轨迹。</li>
	<li>将探针安装到操纵器上，并设定所需角度。为定位腹外侧导水管周围灰质（vlPAG），采用前后方向（AP）角度为15–20°。</li>
	<li>将记录探针降至颅窗中心的脑表面。首先，手动将探针插入至约300 µm深度。达到该深度后，以自动方式缓慢继续降低探针（例如，200 µm/min），直至目标深度，以尽量减少组织损伤21 (图 2C). 
	注意：建议最初手动插入探针。手动插入探针可确保在探针初次插入时若发生弯曲，能够及时停止并回撤探针。一旦探针完全穿透组织，通常可安全地切换至自动模式继续下探。</li>
	<li>在颅骨开窗处的脑表面涂抹矿物油，以防止干燥。</li>
	<li>插入记录电极后，静置10分钟。</li>
	<li>使用 Intan Recording Controller 以 30 kHz 的采样率记录硅探针和 ECoG 数据。</li>
	<li>记录后1-2小时，采用经心脏灌注技术用4%多聚甲醛固定脑组织22. 
	注意：由于骨水泥的存在，移除颅骨的吻侧部分可能会比较困难。因此，建议通过去除颅骨的背侧部分来切除脑组织。</li>
	<li>将小鼠断头，沿背部中线从颈部至下颌切开皮肤。剥离附着在颅骨上的肌肉和组织，切除下颌以更方便地暴露脑组织。</li>
	<li>如果灌注已完成&#160;大脑应略微收缩&#160;留出足够的空间以插入&#160;精细&#160;背侧部分的剪刀&#160;枕骨大孔&#160;在枕骨上制作一个中线切口、一个外侧切口和一个对侧切口，切口大小约为1 mm。</li>
	<li>使用眼科镊子小心地移除颅骨的背侧部分。从枕骨开始，逐步清除所有颅骨碎片，直至整个脑部背侧完全暴露。</li>
	<li>用微型刮铲从嗅球处开始，插入脑组织下方，将脑取出。</li>
	<li>灌注并取出后，脑组织可在4%多聚甲醛中于4 °C保存24-48小时。</li>
</ol>
3. 用于探针轨迹重建的组织学
<ol>
	<li>使用振动切片机将脑组织切成70 µm的冠状切片。</li>
	<li>使用可对细胞核进行DAPI染色的封片剂将切片贴附于载玻片上。加盖盖玻片，并用透明指甲油封片。</li>
	<li>在荧光显微镜下对载玻片进行成像。调整对比度/亮度，使探针轨迹清晰可见。确保生成的TIFF图像文件大小小于10 MB，以保证MATLAB代码顺利运行。使用MATLAB代码23重建探针轨迹。</li>
</ol>
4. 电生理数据分析
<ol>
	<li>使用离线检测和自动分类软件（Kilosort）分析来自硅探针记录的神经信号24。</li>
	<li>使用Phy手动将检测到的簇分类为多单元或单单元25。当簇具有生理性的尖峰波形形状、在互相关图中显示不应期，并且幅值分布呈正态分布时，将其分类为单单元。</li>
	<li>将单单元数据导入MATLAB进行分析23。</li>
</ol>

Angled Silicon Multielectrode Recordings for Deep Brainstem Structures in Mice

<ol><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithically+integrated+%C2%B5LEDs+on+silicon+neural+probes+for+high-resolution+optogenetic+studies+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monolithically integrated µLEDs on silicon neural probes for high-resolution optogenetic studies in behaving animals.</a> Neuron. 88 (6), 1136-1148 (2015).</li>
<li>Hong, G., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+electrode+technologies+for+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Novel electrode technologies for neural recordings.</a> Nat Rev Neurosci. 20 (6), 330-345 (2019).</li>
<li>Li, N., Daie, K., Svoboda, K., Druckmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+neuronal+dynamics+in+premotor+cortex+during+motor+planning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Robust neuronal dynamics in premotor cortex during motor planning.</a> Nature. 532 (7600), 459-464 (2016).</li>
<li>Kipke, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+neurotechnologies+for+chronic+neural+interfaces%3A+New+horizons+and+clinical+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: New horizons and clinical opportunities.</a> J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).</li>
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<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
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</ol>

作者声明，本研究不存在任何竞争性财务利益或其他利益冲突。

脑干核团介导呼吸、意识和睡眠等基本功能26,27,28脑干的位置（深部且靠后）为其神经元活动的研究带来了挑战 体内 采用标准技术。本文介绍一种倾斜的前部入路，可在头部固定的的小鼠中实现可重复的单单位记录。
精确插入多电极硅探针对于稳定靶向与快速眼动睡眠相关的脑干结构至关重要，同时需避免损伤主要血管。确定最佳的植入坐标和路径需要相当高的技巧、专注力和耐心13。
由于探针轨迹呈一定角度，且需要较长距离才能到达深层结构，即使坐标和颅骨固定板位置存在微小偏差，也很可能导致无法命中目标结构。在植入颅骨固定板时，必须确保前囟（Bregma）和后囟（Lambda）处于同一水平面，并精确测量二者之间的距离。值得注意的是，由于手术是在立体定位仪上进行，而记录则在独立的电生理装置上完成，因此必须将颅骨固定板牢固地固定在水平的颅骨上。额外引入的角度（例如头部倾斜）会增加误差风险，对于体积较小的深部脑结构而言，这种风险尤其高（图9）。
由于硅探针较为脆弱，因此必须清除脑表面的硬脑膜，并确保颅窗内无骨碎片阻塞。去除硬脑膜后可能会出现轻微出血，因此必须清除颅骨开窗表面的凝固血液，以免导致探针弯曲。如果将硅探针插入脑组织时遇到困难（例如探针发生弯曲），则需检查是否存在残留的硬脑膜，或脑表面是否已干燥，因为当液体极少或缺失时，表面可能形成一层薄膜。在人类27中，靠近血管的区域硬脑膜较厚，小鼠也存在类似情况，即在不损伤血管的前提下清除硬脑膜可能具有挑战性。尽管仔细去除硬脑膜通常可实现&#160;探针的顺利插入，但较大的插入&#160;角度可能会带来额外的&#160;困难。
记录的产量在不同动物之间可能存在显著差异，并受多种变量影响。其中一个重要因素是靶向结构中神经元的密度；神经元密度较低的区域（例如皮层）通常记录到的单个神经元数量较少。此外，组织损伤（例如脑表面下方血管破裂）可能导致神经元死亡或损伤，进一步降低记录产量21,29。记录质量&#160;也至关重要，高质量的记录更易于区分单个神经元。探针轨迹偏离目标区域同样会导致产量降低。尽管本方案是为在腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）进行记录而设计的，但也可用于记录脑干中邻近结构的神经活动。

基于硅的多电极记录技术正日益普及，可用于在单个动作电位分辨率下测量多个脑区的神经元活动1,2,3,4。在过去十年中，高密度记录技术取得了显著发展。目前基于硅的记录电极可集成大量通道、光纤以及皮层脑电图（ECoG）记录装置5,6。此外，这些电极的慢性植入可实现长期记录7,8。
尽管近年来技术不断进步，使用多通道探针靶向脑干等深部尾侧结构仍然具有挑战性。当靶向腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）等脑干结构时，一个主要障碍是确定一条能够避开主要血管（例如上矢状窦和横窦）的探针路径。损伤这些大静脉可能导致大量出血、下方脑组织受损，甚至死亡9,10。我们建议从前方坐标以一定角度靶向脑干结构，使记录探针能够穿过这些高风险血管结构下方进入脑组织（见图1）。与垂直进针相比，这种倾斜入路可最大程度地增加可记录的脑区数量。此外，在需要进行颅外脑电图（ECoG）记录的实验条件下，由于探针插入的颅窗位置更靠前，倾斜前入路为ECoG头戴装置的植入提供了更大的颅骨表面积10,11。
确定介导麻醉诱导的快速眼动（REM）睡眠变化的特定细胞群和神经环路，仍是麻醉研究的主要目标之一。因此，本研究的目的是在头固定小鼠中可重复且可靠地进入与REM睡眠相关的脑干区域——腹外侧导水管周围灰质（vlPAG），以获取单细胞单位的多电极记录，分别在七氟烷麻醉前和麻醉期间进行12,13。以往研究曾利用清醒小鼠vlPAG区域的电生理局部场电位（LFP）测量，来识别与麻醉相关的神经状态变化14,15。然而，LFP测量主要对记录区域内的突触活动敏感，而非动作电位16。因此，目前对麻醉药如何直接影响vlPAG神经元产生的神经活动模式仍了解有限。本文描述了一种方法，可在头固定小鼠的脑干中获得高密度的单神经元记录。该方法也可经调整后用于记录其他多种深部及后脑干结构中的单神经元活动。

<table><tbody><tr><td>1024通道RHD记录控制器</td><td>美国加利福尼亚州洛杉矶市 Intan Technologies 公司</td><td>C3008</td><td>硅探针记录；记录硬件与软件</td></tr><tr><td>24 mm × 50 mm No. 1.5 VWR 盖玻片</td><td>VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺</td><td>48393-081</td><td>组织学</td></tr><tr><td>PBS 中的 4% PFA</td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司</td><td>J61899.AK</td><td>组织学；灌注液</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B metabond</td><td>美国弗吉尼亚州里士满，Patterson Dental公司</td><td>粉末：5533559，快固基质：5533492，催化剂：55335007</td><td>头板 &amp;耳蜗植入物植入术</td></tr><tr><td>4-6周龄雄性C57/6J小鼠</td><td>美国缅因州巴港杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Capnomac Ultima</td><td>Datex，芬兰赫尔辛基&amp;nbsp;</td><td>ULT-SVi-27-07</td><td>气体分析仪；已停产；可从 Bionet America 购买替代气体分析仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司</td><td>V22888</td><td>用于硅探针包被的红色荧光染料</td></tr><tr><td>连接器接头</td><td>DigiKey，美国明尼苏达州索尔特河福尔斯</td><td>1212-1788-ND</td><td>ECoG 头戴装置</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech，美国阿拉巴马州伯明翰</td><td>0100-20</td><td>组织学</td></tr><tr><td>iBOND Universal</td><td>美国弗吉尼亚州里士满，Patterson Dental公司</td><td>044-1113</td><td>头板 &amp;耳蜗植入；耳机植入；用于&amp;nbsp; 将不锈钢丝固定在颅骨上</td></tr><tr><td>低毒性硅胶粘合剂</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司</td><td>KWIK-SIL</td><td>头板</td></tr><tr><td>显微操作仪系统</td><td>New Scale Technologies，维多利亚，纽约州，美国</td><td>多探针操作器：XYZ 载物台组件：06464-0000，MPM 系统套件：06267-3-0001，MPM-Platform-360，MPM 手动臂用 MPM 环形支架，MPM_Ring-72 DEG：06262-3-0000</td><td>硅探针记录；将探针插入大脑</td></tr><tr><td>微电极</td><td>美国加利福尼亚州洛杉矶市，加州大学洛杉矶分校</td><td>256 个自主神经系统，64 兆</td><td>已停产；可从 Neuropixels 购买替代的硅探针</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>M8410-100ML</td><td>硅探针记录；防止记录过程中组织干燥</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司</td><td>Z1376</td><td>头板 &amp;&耳机植入；防止手术过程中脑组织干燥</td></tr><tr><td>PFA涂层不锈钢丝 - 直径0.008英寸，两端带条纹涂层</td><td>A-M 系统公司，美国华盛顿州瑟quam</td><td>791400</td><td>ECoG 头戴装置 &amp;用于ECoG的放大器和参比电极&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>铂丝 24AWG&amp;nbsp;</td><td>美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司</td><td>PTP201</td><td>用于硅探针记录的参考电极&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shandon Colorfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司</td><td>99-910-01</td><td>组织学</td></tr><tr><td>不锈钢头板</td><td>中国深圳速星科技有限公司</td><td>定制部件</td><td>头板 &amp;耳蜗植入体与耳机植入；设计可应要求提供</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>KOPF，美国加利福尼亚州图洪加</td><td>Model 940 小动物立体定位仪，配备数字显示控制台</td><td>头板 &amp;耳蜗植入与耳机植入</td></tr></tbody></table>

固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

Acute Single-Unit Multi-Electrode Recordings from the Brainstem of Head-Fixed Mice

基于硅多电极的记录技术正日益广泛应用于研究多个脑区神经元活动，其时间分辨率可达到动作电位水平。然而，使用多通道探针记录脑干等深部尾侧结构的神经活动仍具挑战性。其中一个主要问题是寻找合适的探针插入路径，以避开上矢状窦和横窦等大型血管。损伤这些大静脉可能导致严重出血、下方脑组织受损，甚至引发死亡。本方法通过结合前部坐标与倾斜入路的方式精确定位脑干结构，使记录探针能够穿透高风险血管结构下方的脑组织。与严格的垂直入路相比，倾斜入路可最大化可靶向的脑区数量。采用该策略，可重复且可靠地进入与快速眼动（REM）睡眠相关的脑干区域——腹外侧导水管周围灰质（vlPAG），在固定头部的小鼠中获取单细胞单位及多电极记录数据，实验可在七氟烷麻醉前及麻醉期间进行。以高时间分辨率记录vlPAG及其周围核团神经元活动的能力，是深入理解REM睡眠与麻醉之间关系的重要进展。

五只雄性C57BL/6J小鼠植入了ECoG耳机和头固定板（图4A）。术后恢复后，小鼠在两天内分别进行两次、每次1.5小时的头部固定适应训练，并熟悉电生理记录装置（图4B）。随后，在小鼠清醒且头部固定的状态下，制作一个2 mm × 2 mm的颅骨开窗（图4C），并插入硅探针（图4D）。实验中使用了两种类型的UCLA硅探针：（1）64 M：单束、64通道电极探针；（2）256 ANS：四束、256通道电极探针。通过固定在电生理记录装置上的鼻罩给予七氟烷和氧气，每5分钟使用串联气体分析仪监测一次氧气和七氟烷浓度。经心脏灌注后取出脑组织（图4E），并评估探针轨迹（图4F）。随后将记录到的动作电位整理为单细胞单位数据（图4G）。
进行了五次记录，其中使用在 MATLAB 中开发的现有探针重建算法验证了探针的放置位置23。利用这些算法，硅探针的每个电极均被定位至特定的脑区结构，从而获得了探针在脑内位置的三维视图（图5）。这些重建算法还结合免疫组织化学标记物进一步验证了探针的穿行轨迹（图6）。随后，将数据与经过筛选的单个神经元放电单元进行匹配（图7）。
共记录到64个单个神经元，其中13个位于腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）。其余51个神经元位于邻近核团：中脑、中脑网状核、副滑车核、楔形核、背外侧被盖核、臂旁核以及小脑上脚。每只小鼠中神经元的放电活动以热图形式呈现（图7）。小鼠3因单细胞记录质量差而被排除在分析之外。大多数记录到的神经元在七氟烷麻醉期间放电频率降低。
比较每只小鼠在基线期5分钟（即记录开始后10-15分钟）与七氟烷暴露期间5分钟（即记录开始后40-45分钟）时vlPAG神经元的平均放电率。vlPAG神经元的放电率显著降低（图8A），并且这种降低在所有vlPAG神经元中均具有一致性（图8B）。
<img alt="静力平衡示意图；利用三角函数计算角度；β = arctan(b/a)；脑内的角度 β。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：计算探针插入的立体定位坐标。 左图：利用几何方法计算探针插入的倾斜角度。确定了直角三角形的以下组成部分：(a) 目标结构自脑表面的背腹向（DV）深度（通过立体定位图谱获得）；(b) 假设垂直下降时的前后向（AP）坐标与目标结构实际 AP 坐标之间的距离。右图：根据 (a) 和 (b)，可利用勾股定理计算探针插入的前后向角度（β）和长度（c）。用于定位腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）的坐标如下：(AP) -3.6 mm，(ML) +0.5 mm，(DV) -4 mm。实验中采用 20° 的 AP 角度（β）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="光学激发下的手术装置；图A-C显示颅骨手术，D：光子设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：头固定板植入与单细胞记录。（A）植入过程中ECoG耳机导线的放置。（B）ECoG耳机和头固定板植入后小鼠颅骨的顶视图。（C）插入脑组织的硅探针针体。（D）进行硅探针记录时头部固定的动物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑静脉窦示意图；上矢状窦、横窦走行。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：颅窗位置相对于主要血管的解剖关系。 小鼠脑表面血管结构的示意图，标出了上矢状窦和横窦。白色方框表示颅窗的位置，红色圆点代表探针插入点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类动物ECoG实验：头固定板手术、开颅、脑组织采集、七氟烷记录装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：实验设计。 对五只雄性C57BL/6J小鼠植入ECoG耳机和头固定板（A）。术后恢复后，使小鼠适应头部固定及记录装置（B）。随后进行开颅手术（C），并在小鼠清醒且头部固定的状态下插入硅探针。通过鼻罩给予挥发性麻醉剂和氧气（D）。记录完成后，取出脑组织（E），并利用免疫组织化学技术分析探针轨迹（F）。记录到的动作电位随后被整理为单细胞单位数据（G）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑连接图；神经通路比较；五只动物分析；神经科学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：带有重建探针轨迹的脑部3D模型。 每条彩色直线代表一个探针轨迹。每个点标记了在冠状脑切片上可见的DiI染料位置。对硅探针的每个叉臂均重建了探针轨迹。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于神经研究分析的突出显示导水管周围灰质区域和核团的小鼠脑图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：vlPAG内探针位置的事后重建。 每只记录小鼠（1-5）的代表性冠状脑切片经DAPI染色（蓝色），显示探针轨迹（DiI，红色，绿色箭头标记）及脑区轮廓。比例尺：500 µm。小鼠1-3使用单束硅探针（即64通道）记录，而小鼠4和5使用四束硅探针（即256通道）记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经活动热图、七氟烷效应、脑区、小鼠研究、颜色标度数据表示" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：七氟烷麻醉前和麻醉期间的分箱放电活动。热图表示64个单个神经元在一分钟时间间隔内产生的动作电位数量。根据探针轨迹重建结果，将单个神经元分配至其来源脑区。白色虚线表示七氟烷给药开始时间，n = 4只小鼠。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="七氟烷对小鼠神经元放电频率的影响；折线图显示频率显著降低。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8：七氟烷麻醉期间vlPAG神经元放电被完全抑制。（A）每只小鼠在麻醉前和麻醉期间产生的平均动作电位数量。（B）每个vlPAG神经元产生的动作电位数量（B）。配对t-检验，**P = 0.0036，P = 0.0053，分别对应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑成像装置；电极对准示意图，显示神经定位与通路分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67205/67205fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9：头固定板放置不平整如何影响探针轨迹的示例。（A）小鼠头部上头固定板放置不平整。（B,C）三维小鼠脑重建图像，显示由于头固定板放置不平整导致探针轨迹出现非预期的内外侧角度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67205/67205fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种在固定头部的小鼠脑干中获取体内高密度单神经元记录的方法。该方法用于在全身麻醉前和麻醉期间，测量腹外侧导水管周围灰质（即快速眼动（REM）睡眠期间不活跃的脑干区域）神经元的动作电位发放。

基于硅多电极的记录技术正日益广泛地用于以动作电位的时间分辨率研究大量神经元活动……

我们的实验室研究常用麻醉剂对睡眠相关神经元及其通讯通路的影响。我们的目标是更深入地理解麻醉剂如何影响内源性睡眠通路，以及如何干扰围手术期的睡眠与认知功能。近期，我们确定了某些类型全身麻醉剂引起睡眠改变的解剖学基础。我们通过使用经过基因改造的小鼠来实现这一目标，这些小鼠内源性表达神经元激活标志物 C-fos。然而，利用这一新技术，我们将能够直接测量与睡眠相关的脑干神经元群体的细胞兴奋性。相比仅通过量化 C-fos 表达作为神经元激活的替代指标，这一方法具有显著优势。下一步，我们将探究由某些类型全身麻醉药诱导的睡眠变化所涉及的细胞与分子机制。这包括使用神经像素探针测量与睡眠相关的脑干神经元的细胞兴奋性，以及采用空间转录组学方法对这些区域中与睡眠相关的基因表达进行定量和定位分析。首先，通过将糠醛烷氧基包被的不锈钢丝焊接到一个三针连接器接头上，制作皮层脑电图（ECoG）头戴装置。根据小鼠立体定位图谱确定插入坐标后，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪框架中。将动物的鼻部放入鼻锥内，并用头部固定杆稳定头部。随后进行足趾夹捏测试，以检查麻醉深度。在顶骨和枕骨上方做一处5毫米的头皮切口后，用手术刀刀片刮除脑膜并将其去除。使用手术刀刀片切断肌肉附着处，暴露顶骨和枕骨。使用过氧化氢控制出血，并干燥颅骨表面。接下来，确定颅骨上的前囟点（bregma）和人字缝点（lambda）解剖标志。然后，调整鼻锥位置，使颅骨的前后方向处于水平。为使颅骨的内外侧方向水平，从前囟点与人字缝点之间选取两个对称的相对点，并检查其水平度。现在测量前囟与后囟之间的距离，并将其与Franklin Paxino立体定位图谱中报告的距离进行比较。利用实测距离与报告距离之间的差异，按比例调整前后坐标。使用无菌铅笔在颅骨上标记开颅坐标。使用立体定位仪微操作器，将头固定板直接置于人字缝上方。在头固定板及其周围涂抹牙科水泥，以将其固定在颅骨上，并静置干燥10分钟。随后，钻出两个皮层电极和一个参考电极的钻孔。将镀层银丝电极的裸露端置于钻孔内，并使用紫外线激活树脂固定。用牙科水泥完全覆盖镀层不锈钢丝，确保无任何金属丝外露。再用牙科水泥覆盖头戴装置的底部和侧面，以确保其牢固固定，并让小鼠恢复七天。将麻醉后的小鼠置于立体定位仪框架中。确定前囟和后囟位置，确保这两个标志点之间的高度差不超过100微米。用无菌铅笔在颅骨上找到并标记计算出的坐标位置。在坐标周围绘制一个2毫米×2毫米的颅骨开窗轮廓。检查麻醉深度后，使用高速钻头制作一个2毫米×2毫米的颅骨开窗。滴加0.5至1毫升生理盐水，以防止脑表面干燥。使用注射器针头和精细镊子去除硬脑膜。接着，使用高速钻头在颅骨窗口附近一到两毫米处为硅探针的参考电极单独钻一个骨孔。在颅骨上涂抹0.2毫升低毒性硅胶粘合剂，以完全封闭开颅部位。使用头板和螺丝将小鼠头部固定在电生理记录装置上。然后，用荧光染料涂抹硅探针的探针杆，以便在实验后重建探针的轨迹。接着，将探针安装到操纵器上，并设定所需角度。为了将记录探针降至颅窗中心的脑表面，需手动将探针插入至大约 300 微米的深度。插入至该深度后，以每分钟 200 微米的速度自动缓慢降低探针至目标深度，以尽量减少组织损伤。最后，在颅骨开窗内的脑表面滴加矿物油，以防止组织干燥。然后，使用 Intan 记录控制器以 30 千赫兹的频率记录硅探针和皮层脑电图（ECOG）的数据。大多数记录到的神经元在七氟烷麻醉期间放电减少。vlPAG 的放电率从基线到七氟烷麻醉期间显著降低。这种减少在所有腹外侧导水管周围灰质神经元中均一致存在。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

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固定头部小鼠脑干的急性单细胞多电极记录

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