Name: 生长因子对微藻叶绿素 a 和 b 生产的影响评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 了解微藻叶绿素a和b生产的分析方法，探索光色和二氧化碳供应对Chlorella sorokiniana和Haematococcus pluvialis叶绿素产量的影响。该研究为优化微藻代谢物生产提供了重要的生物技术指导。

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作者们衷心感谢墨西哥国立技术学院（TecNM）在联邦理工学院“科学、技术发展与创新研究项目”（16898.23-P）资助计划下提供的部分经费支持。同时，他们也感谢米却肯州奥坎波科学、技术和创新研究所（FCCHTI23_ME-4.1.-0001）给予的支持。

1. 培养基制备与接种物制备
<ol>
	<li>制备1 L的3N-BBM+ V(CCAP)培养基（大量营养素：NaNO3 [0.75 g L-1]，CaCl2 [0.019 g L-1]，MgSO4 [0.019 g L-1]，K2HPO4 [0.057 g L-1]，NaCl [0.025 g L-1]，KH2PO4 [0.175 g L-1]；微量营养素：Na2 EDTA [0.0186 g L-1]，FeCl3 [0.0024 g L-1]，MnCl2 [0.001 g L-1]，ZnCl2 [1.25 × 10-4 g L-1]，CoCl2 [5 × 10-5 g L-1]，Na2MoO4 [9.98 × 10-5 g L-1])8，并在121 °C、1.5 psi条件下灭菌15分钟。</li>
	<li>将约1 L培养基接种至锥形瓶中，微藻C. sorokiniana的接种浓度约为3 × 106 个细胞 mL-1；或向培养基中加入5%至10%（v/v）的接种物。 
	注意：为保持无菌条件，建议使用超净工作台、手套、实验服和口罩。</li>
	<li>将接种后的锥形瓶置于红光光源下培养，光照强度约为3,600至4,200 lux，温度控制在22–26 °C之间，C. sorokiniana采用12小时光照/12小时黑暗的光周期，H. pluvialis采用16小时光照/8小时黑暗的光周期，每天手动振荡一次，两种菌株均培养约7天。 
	注意：C. sorokiniana需在生长条件下维持至少7–10天（直至呈现深绿色），H. pluvialis则需10–12天。为获得用于动力学实验的微藻浓缩接种物，需去除藻体产生的上清培养基。</li>
	<li>在无菌环境下，将约10 mL接种培养基加入无菌的15 mL锥形离心管中，在25–30 °C条件下以3,000 × g离心20分钟。</li>
	<li>在无菌条件下，使用移液器或倾倒法去除上清液，并将生物质浓缩至无菌的50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>根据需要重复此过程，直至获得动力学实验所需的接种物体积。</li>
	<li>测定接种物在550 nm处的光密度（OD550&#160;nm），以确定微藻的细胞浓度，并将其储存于3–4 °C，待用。 
	注意：最初通过直接细胞计数建立细胞浓度与吸光度之间的相关性。计数完成后，接种物可在冷藏条件下保存不超过4天。</li>
</ol>
2. 生长动力学研究
<ol>
	<li>制备适用于每项实验所需体积的3N-BBM+ V(CCAP)（光生物反应器级别测试需8 L） C. sorokiniana 以及用于烧瓶级别测试的0.5 L H. pluvialis按照标准实验室操作规程进行，确保充分灭菌。</li>
	<li>对于光生物反应器和烧瓶，将光源设置为所需的颜色光谱（蓝色为460 nm，紫色为460 nm与630 nm的混合光） C. sorokiniana 630 nm 处为红色 H. pluvialis）；覆盖两个系统以避免外界光线干扰。 
	注意：由于每个发光二极管发射的波长存在差异，需使用光谱辐射计对光源进行光谱辐射测量，以确定每个二极管的波长和辐射功率9通过组合红色和蓝色LED获得紫光，波长为460 nm，发射功率为1.65 W/nm-1&#160;对于蓝光LED和发射功率为0.6 W/nm的630 nm光-1&#160;用于红光LED。这些测量数据被用于仅在蓝光和红光条件下进行的实验。</li>
	<li>将定时器设置为在12小时光照和12小时黑暗周期之间交替 C. sorokiniana 16小时光照和8小时黑暗循环 H. pluvialis.</li>
	<li>连接CO₂培养箱2 将通气系统连接至光生物反应器培养容器，以每12小时间隔提供二氧化碳供应 C. sorokiniana.</li>
	<li>接种足够体积的预培养液至培养容器中，以达到初始细胞密度为 3 x 105 细胞/mL-1 或其在光密度（OD）上的等效值550&#160;nm) = 0.180 
	注意：接种过程中须确保无菌操作，以防止污染。</li>
	<li>每隔12小时定期取样培养物 C. sorokiniana 8小时 H. pluvialis 监测细胞生长和生理参数。采用无菌技术采集样品，以保持培养物的完整性。</li>
</ol>
3. 叶绿素的定量分析
注意：细胞定量的数据见补充文件1。
<ol>
	<li>将40 mL样品放入塑料锥形离心管中。</li>
	<li>在15 °C条件下以3,000 × g离心20分钟，通过倾倒或使用巴斯德吸管弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀转移至用铝箔包裹并带有螺旋盖的玻璃管中，以防止氧化。</li>
	<li>使用涡旋振荡器将细胞沉淀用3 mL 90%纯丙酮溶液重新悬浮。</li>
	<li>将悬浮样品置于冰浴中超声处理两个循环，每个循环5分钟，并在4 °C下静置16小时10。</li>
	<li>16小时后，按照前一步骤（步骤3.5）所述相同条件再次进行超声处理，并按照先前描述的条件（步骤3.2）再次离心。</li>
	<li>使用巴斯德吸管分离色素提取液，并转移至另一支避光的洁净试管中。</li>
	<li>将色素提取液放入石英比色皿中，在分光光度计中分别于630 nm、647 nm和664 nm波长下测定吸光度。 
	注意：使用90%丙酮预先校准分光光度计。</li>
	<li>计算叶绿素浓度时，使用以下公式11： 
	叶绿素 a = 11.93 A664 - 1.93 A647 
	叶绿素 b = 20.36 A647 - 5.50 A664 
	注意：结果以µg mL-1提取液表示，乘以提取液体积后除以样品体积（mL），即可得到以µg mL-1培养液表示的叶绿素浓度。</li>
	<li>若需获得以µg chl cell-1为单位的数值，请使用以下公式： 
	μg chl cell-1 = 1 mL培养液中的μg chl / [cells mL-1] 培养液中的细胞浓度。</li>
</ol>

Enhancing Chlorophyll Production in Microalgae via Growth Factor Optimization

<ol><li>Ramírez, M. E., Rendón, L., Veléz, Y. Microalgas para la industria alimenticia. , 1ra edición, Universidad Pontífica Bolivariana. 
 <a target="_blank" href="http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306">http://hdl.handle.net/20.500.11912/2306</a> (2013).</li>
<li>Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promising+future+of+microalgae%3A+Current+status%2C+challenges%2C+and+optimization+of+a+sustainable+and+renewable+industry+for+biofuels%2C+feed%2C+and+other+products%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">The promising future of microalgae: Current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products.</a> Microb Cell Fact. 17 (1), 36(2018).</li>
<li>Otero-Paternina, A. S. M., Cruz-Casallas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrocarbon+phenanthrene+on+Chlorella+vulgaris+%28Chlorellaceae%29+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biol+Col%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrocarbon phenanthrene on Chlorella vulgaris (Chlorellaceae) growth.</a> Acta Biol Col. 18 (1), 87-98 (2013).</li>
<li>Pancha, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salinity-induced+oxidative+stress+enhanced+the+biofuel+production+potential+of+microalgae+Scenedesmus+sp.+CCNM+1077%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour+Techno%22%5BJournal%5D)">Salinity-induced oxidative stress enhanced the biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077.</a> Bioresour Techno. 189, 341-348 (2015).</li>
<li>Ortiz, M. L., Cortés, C. E., Sánchez, J., Padilla, J., Otero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+microalgae+Chlorella+sorokiniana+growth+in+different+culture+mediums+in+autotrophic+and+mixotrophic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Orinoquia%22%5BJournal%5D)">Evaluating microalgae Chlorella sorokiniana growth in different culture mediums in autotrophic and mixotrophic conditions.</a> Orinoquia. 16 (1), 11-20 (2012).</li>
<li>Camacho Kurmen, J. E., González, G., Klotz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astaxanthin+production+in+Haematococcus+pluvialis+under+different+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nova%22%5BJournal%5D)">Astaxanthin production in Haematococcus pluvialis under different stress conditions.</a> Nova. 11 (19), 94-104 (2013).</li>
<li>Pérez Zambrano, E., Ayala Agudelo, Y. Production of chlorophyll and astaxanthin from Haematococcus pluvialis under nitrogen deficiency stress in a 5-liter Biostat Aplus bioreactor. , Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 
 <a target="_blank" href="https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735">https://repositorio.unicolmayor.edu.co/handle/unicolmayor/2735</a> (2019).</li>
<li>Bischoff, H. W., Bold, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycological+studies+IV.+Some+soil+algae+from+Enchanted+Rock+and+related+algal+species%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+Texas%22%5BJournal%5D)">Phycological studies IV. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species.</a> University of Texas. 6318, 95(1963).</li>
<li>Cerezo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LED+characterization+through+the+use+and+programming+of+a+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Universidad+Polit%C3%A9cnica+de%22%5BJournal%5D)">LED characterization through the use and programming of a spectrometer.</a> Universidad Politécnica de. 22323, (2013).</li>
<li>Arredondo, B. O. Analytical methods and tools for microalgal biomass evaluation. , CIBNOR. México. 
 <a target="_blank" href="http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403">http://dspace.cibnor.mx:8080/handle/123456789/1403</a> (2017).</li>
<li>Couso, I., Vila, M., Vigara, J., Cordero, B. F., Vargas, M. Á <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+carotenoids+and+regulation+of+the+carotenoid+biosynthesis+pathway+in+response+to+high+light+stress+in+the+unicellular+microalga+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Phycol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of carotenoids and regulation of the carotenoid biosynthesis pathway in response to high light stress in the unicellular microalga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eur J Phycol. 47 (3), 223-232 (2012).</li>
<li>Vera-López, F., Martínez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigments+in+microalgae%3A+Functions%2C+applications%2C+and+overproduction+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechnology%22%5BJournal%5D)">Pigments in microalgae: Functions, applications, and overproduction techniques.</a> BioTechnology. 25 (5), 35-51 (2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

H. pluvialis 与 C. sorokiniana 之间的比较研究揭示了叶绿素生成动态的显著差异。H. pluvialis 在整个实验过程中表现出叶绿素浓度的下降，而 C. sorokiniana 则显示出持续增加的趋势。此外，两种物种在初期叶绿素 a 的比例均较低，但在特定生长条件下该比例发生逆转，这可能提示通过特定波长的选择性或暴露诱导了这些叶绿素的生成。这些发现表明，每种物种对实验条件具有独特的响应，突显了所用分析技术在检测生物模型内部及之间变化时的敏感性。能够分辨叶绿素 a 与 b 比例中的细微变化，为微藻色素合成调控机制提供了新的见解，可能在生物技术和环境研究等领域具有重要意义。
检测叶绿素产量增加的时期至关重要，因为叶绿素是光合作用过程中的主要色素。叶绿素a对于捕获光能并将其转化为化学能至关重要，该化学能随后用于驱动细胞生长和代谢。因此，叶绿素a产量的增加表明生物体光合能力的提升，提示微生物生长处于最佳条件12；这一现象支持了在C. sorokiniana中观察到的结果，即叶绿素浓度较高的实验组也获得了更高的细胞生长量，从而为光合微生物在何种环境条件下最有利于其发育和增殖提供了重要依据。
特别是，了解H. pluvialis中叶绿素的比例具有重要意义，因为这些比例可提供关于微藻胁迫状态的重要信号。当环境条件不利时，例如在强光或营养缺乏的情况下，微藻可能会减少叶绿素的合成，转而合成虾青素等类胡萝卜素色素11。这种从以高叶绿素含量为特征的绿色生长期向富含虾青素的胁迫诱导期的转变，有利于最大化虾青素的产量。这凸显了在H. pluvialis培养过程中监测叶绿素水平的重要性，可将其作为评估胁迫响应及色素生成动态的间接指标。
此外，尽管该技术因其高选择性而局限性较少，但仍需采取一些预防措施，例如将提取物避光保存以防止氧化，以及小心处理离心后的样品以消除生物量残留引起的浑浊。另外，该方法的一个缺点是需要相对较大的样品体积，特别是在稀释培养基或摇瓶水平的长期动力学研究中，这可能带来操作上的挑战。这些因素凸显了在微藻研究中精心设计实验和妥善处理样品的重要性，以最大限度地提高叶绿素分析技术的有效性。

近年来，人类活动引发的环境问题日益加剧，对生态系统的健康与平衡造成了不利影响，这促使人们寻求更高效且环境友好的生产系统。这一需求加速了工业领域的相关进程，并推动了生物修复技术的应用以及用于减轻这些有害影响的生物化合物的开发1。
这一背景推动了微藻研究的显著发展，其驱动力在于需要寻找应对当前环境与经济挑战的创新解决方案。微藻在水生环境中生长旺盛，分别利用阳光和二氧化碳作为能量和碳源。这一特性使其成为生产多种高价值产品的可持续且极具前景的替代途径。该领域的研究主要集中在深入了解这些细胞的生理学与代谢机制，以及开发高效的培养与加工技术2。
迫切需要开发易于使用且可靠的工具来研究微藻，以加快研究进程并加深对其生理学、代谢过程及潜在应用的理解。这些工具应能够快速分析环境因素和生产条件对关键参数的影响，例如叶绿素浓度，这是反映这些生物体健康状况和发育程度的基本指标。叶绿素含量的降低可能表明存在环境胁迫、营养缺乏或疾病。
这些绿色色素在光合作用中发挥着关键作用，能够捕获太阳光能，将二氧化碳和水转化为葡萄糖和氧气，占微藻生物量的0.5%至5%3。除了在维持生命过程中具有重要作用外，叶绿素还在多个行业中得到应用。叶绿素提取物被用于食品和饮料加工中作为天然着色剂，为产品赋予鲜艳的绿色，同时提供抗氧化特性。此外，基于叶绿素的膳食补充剂因其宣称的解毒和抗炎功效，在健康与保健领域日益受到青睐。通过利用叶绿素的多种特性，各行业可开发出既提升视觉吸引力又促进消费者健康的创新产品1。
在这一领域中，一种具有重要生物技术价值的微藻是C. sorokiniana。该微生物因其快速的生长速率而备受关注，在生物量生产方面具有很高的效率。此外，C. sorokiniana含有多种高营养价值的化合物，包括蛋白质、脂质和维生素，使其在食品、饲料和生物燃料生产等多个应用领域中具有重要价值2。而且，已发现这种微藻能够产生具有多种功能的胞外酶，为废水处理、生物修复以及制药等生物技术应用提供了新的可能性4。除了生长迅速和应用广泛之外，C. sorokiniana在叶绿素生产方面也表现出显著潜力。作为一种光合微生物，C. sorokiniana具备合成叶绿素所必需的代谢机制，叶绿素可占微藻生物量的0.5%至5%3。这一特性使C. sorokiniana成为实现规模化叶绿素生产的理想候选者，并有望为当前紧迫的环境与营养挑战提供可持续的解决方案5。
另一方面，另一种备受关注的微藻物种是 H. pluvialis。这种微藻以其产生虾青素的能力而闻名，虾青素是一种具有多种工业应用的强效抗氧化色素。虾青素可作为 H. pluvialis 光合系统的保护机制，使其免受环境因素引起的氧化应激损伤。由于其抗氧化特性及潜在的健康益处，该色素在化妆品、营养补充剂和水产养殖行业中备受青睐。凭借其高效的虾青素生产能力，H. pluvialis 为开发满足多种工业和消费者需求的创新产品提供了广阔前景6。
最近的研究还强调了H. pluvialis1在叶绿素生产方面的潜力，进一步提升了其工业价值。例如，一项研究考察了在不同生长条件下H. pluvialis的叶绿素含量，发现当培养参数处于最佳状态时，H. pluvialis表现出显著的叶绿素生成速率，超过其他微藻物种7。该发现凸显了H. pluvialis作为可持续叶绿素来源的潜力，为其在多个工业领域的应用提供了新的机遇。

<table><tbody><tr><td>C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;O</td><td>迈耶</td><td>67-64-1</td><td>90%丙酮</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Biologix</td><td>10-9502</td><td>试管</td></tr><tr><td>2510-DTH</td><td>Branson</td><td>D-73595</td><td>超声波破碎仪</td></tr><tr><td>5 mL 螺口试管</td><td>Kimax</td><td>45066-13100</td><td>试管</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Biologix</td><td>10-9151</td><td>试管</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Reynolds</td><td>611 标准，12&quot; x 1000 英尺</td><td>试管盖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>迈耶</td><td>0925-250</td><td>氯化钙</td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Dynamica</td><td>14 R</td><td>制冷离心机</td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>1057-100</td><td>二氯化钴</td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>157740</td><td>三氯化铁</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>迈耶</td><td>2051-250</td><td>磷酸氢二钾</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>迈耶</td><td>2055-250</td><td>磷酸二氢钾</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>迈耶</td><td>1605-250</td><td>硫酸镁</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>LabNet</td><td>型号 Beta-Pette</td><td>微量移液器</td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>429449</td><td>氯化锰(II)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Na2 EDTA&amp;nbsp;</td><td>默克</td><td>200-449-4</td><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>243655</td><td>钼酸钠</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>迈耶</td><td>2365-500</td><td>氯化钠</td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>迈耶</td><td>2465-250</td><td>硝酸钠</td></tr><tr><td>RGB LED 灯带</td><td>Steren</td><td>GAD-LED2</td><td>光源</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>PerkinElmer</td><td>型号 Lambda35</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>光谱辐射计</td><td>Gigahertz-Optik</td><td>型号 BTS256</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie&amp;reg; 2</td><td>涡旋振荡器</td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>208086</td><td>氯化锌</td></tr></tbody></table>

评估生长因子对微藻中叶绿素a和b生成的影响

Evaluation of the Effect of Growth Factors on Chlorophylls a and b Production from Microalgae

微藻包含两类主要色素：叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素是一种绿色色素，能够吸收光能并将其转化为化学能，从而促进有机化合物的合成。由于具有较强的抗氧化性和着色能力，该色素在食品、制药和化妆品工业中可作为重要的生物技术原料。本研究旨在通过采用Taguchi L4正交实验设计，评估生长因子（CO2浓度、光色和光强）对Chlorella sorokiniana细胞生长以及叶绿素a和b细胞内含量的影响，并进一步利用雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）微藻作为额外的研究模型对方法进行验证。细胞生长通过在550 nm波长下测定光密度的分光光度法进行定量。对于叶绿素的定量，首先使用90%纯度的丙酮溶液提取细胞内容物，随后根据Jeffrey和Humphrey所述方法，在647 nm和664 nm波长下采用分光光度法测定叶绿素a和b的浓度。实验结果表明，控制低浓度CO2添加、紫光照射及低光强条件，可同时促进细胞生长并提高细胞内叶绿素a和b的含量。该叶绿素定量方法的实施可实现快速、简便且精确的叶绿素含量测定，所用波长恰好位于两类叶绿素的吸收峰处，因此该技术易于在任何研究中的微藻样本上重复应用。

为了观察该技术检测C. sorokiniana细胞叶绿素浓度变化的效率，并评估生长因子对其生长的影响，采用Taguchi L4实验设计，考察了CO2通入量、光颜色和光强度三个因素。每个因素均在低水平和高水平下进行评估，具体条件如表1所示，实验设计条件见表2。
实验过程结束后，结果表明，低剂量添加 CO 与特定催化剂结合使用可显著提高反应效率。2，紫光，以及高强度光照（C1，P，I2）对应于处理组2，微生物生长增加至7.83 x 105 细胞/mL-1另一方面，在条件C下，处理4的叶绿素含量较高2P，I2，达到 5.92 x 10 的浓度-7 µg 细胞-1 在132 h（图1与紫光和高光强在两次实验中均为各因素的最佳水平相一致。
同时，在四种评估的细胞系中均观察到类似的行为。然而，在紫光条件下进行的实验中表现出明显的优势。这一模式表明，紫光可能对实验结果产生积极影响，或可促进细胞生长或活性的最佳条件。这些发现凸显了在生物学实验中仔细考虑光照条件的重要性。
通过统计分析，得到了主效应图。在图2中，可以观察到所评估因素的各个水平对C. sorokiniana叶绿素生产的影响。叶绿素生产的最佳条件为高浓度CO2添加、紫光和高光强（C2、P、I2），其中光照颜色和二氧化碳浓度具有非常接近的显著性值，而光强对所评估的响应变量影响相对较小。
此外，生成了一张对比图（图3），展示了细胞叶绿素浓度在不同CO2添加体积和光照颜色条件下的变化行为。
观察到紫光（蓝光与红光的混合）以及高光强显著促进微生物生长和叶绿素的产生。同时，高浓度添加CO2 对这两个参数分别产生正负影响，因为紫光在实验过程中虽能提高叶绿素的细胞浓度至最大值，但会抑制微生物的生长。然而可以明显观察到，在紫光条件下，CO2 20秒脉冲式加入CO体积2 每12小时一次，流速为8.5 ft³/h-1 使这两个参数均获得理想的响应。
为了验证从该方法中获得的结果和数据 C. sorokiniana 在烧瓶水平上进行了一项确证性测试 H. pluvialis 在红光下，由于该生物在胁迫条件下具有降解叶绿素以合成虾青素的天然特性，而胁迫条件是在168小时通过提高培养基盐度诱导产生的。绘制了浓度变化图（图4) 叶绿素浓度在0 h达到最高值，为1.41 x 10-7 µg 细胞-1在此情况下，由于微藻的自然行为，观察到叶绿素浓度下降，表明所研究的生物模型可能发生潜在的生理变化。这一点在下文中进一步得到说明。 图5，显示了一张显微照片 C. sorokiniana (图5A）以及两张显微照片 H. pluvialis：一个处于绿色阶段（图5B）以及一个处于转变期和虾青素生成期的阶段（图5C有趣的是，尽管存在类胡萝卜素化合物——这些化合物本身是存在于微藻中的脂溶性色素——但并未对检测造成干扰；这充分证明了该技术在具有不同能力和行为特性的微藻中具备高度的选择性和可重复性。
该图显示在整个实验过程中总叶绿素浓度呈下降趋势。值得注意的是，在50小时时，叶绿素a相较于叶绿素b有所增加，此时叶绿素b的浓度显著降低。叶绿素浓度最显著的下降出现在指数生长期末期。这种下降归因于雨生血球藻（H. pluvialis）中类胡萝卜素的产生。
类似地，对 C. sorokiniana 产量最高处理组（C1、P、I2）的叶绿素 a 和 b 组成进行了分析，结果如图6所示。与 H. pluvialis 不同，叶绿素的产量在整个实验期间呈现持续上升趋势，且该分析仅在指数生长期进行。可以看出，与 H. pluvialis 相似，在实验初期，叶绿素 a 的比例低于叶绿素 b；然而，在50小时时比例发生显著变化，此后叶绿素 a 的生成速率高于叶绿素 b。
本研究中采用的分析技术在检测生物模型内部及不同生物模型之间的变化方面已证明具有高效性。这些结果凸显了该分析方法的灵敏度与精确性，使得对生物系统内外叶绿素动态的细微差异有了更深入的理解。此类见解对于揭示色素合成与代谢所涉及的复杂机制具有重要价值，并为进一步推动生物技术和环境研究的发展奠定了基础。
<img alt="随时间变化的叶绿素浓度图；处理方式比较；带误差线的折线图；数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67208/67208fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：不同实验设计处理下的细胞内叶绿素含量。在不同实验处理条件下测定的Chlorella sorokiniana细胞内叶绿素含量。数据以n = 3的标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/67208fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="叶绿素含量与二氧化碳、颜色、光照的关系；线形图；光合作用分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67208/67208fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：细胞叶绿素含量的主效应图。 主效应图展示了不同处理对Chlorella sorokiniana细胞叶绿素含量的影响。数据以n = 3的标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/67208fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="叶绿素浓度梯度图，用于光合作用分析的二氧化碳与颜色标度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67208/67208fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：细胞叶绿素浓度的等高线图。该等高线图显示了细胞叶绿素浓度、CO2浓度与光色之间的关系。光色以轴1表示蓝色，轴2表示紫色，中间水平表示添加红光。数据以n = 3的标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/67208fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="叶绿素浓度随时间变化的图表；显示细胞生长及叶绿素a/b的数据趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67208/67208fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：H. pluvialis 生长动力学过程中的叶绿素浓度。 在 Haematococcus pluvialis 的生长动力学过程中测得的叶绿素浓度。数据以 n = 3 的标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/67208fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微分析，藻类细胞观察；网格布局（A），聚类（B）和不同颜色（C）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67208/67208fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：C. sorokiniana 和 H. pluvialis 的显微图像。Chlorella sorokiniana（A）以及 Haematococcus pluvialis 的显微图像，分别展示处于绿色阶段的个体（B）和处于早期红色阶段的个体（C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/67208fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的叶绿素浓度图，显示总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b及细胞生长趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67208/67208fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：C. sorokiniana 生长动力学过程中的叶绿素浓度。在 Chlorella sorokiniana 的生长动力学过程中测得的叶绿素浓度。数据以 n = 3 的标准差表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/67208fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>因素</td>
			<td>低水平</td>
			<td>高水平</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 添加量 (L)</td>
			<td>C1</td>
			<td>C2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光颜色</td>
			<td>蓝色 (B)</td>
			<td>紫色 (P)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光照强度 (Lux)</td>
			<td>I1</td>
			<td>I2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：动力学因素及其水平。 动力学因素及其相应水平的概述：C1 = 0.078 L；C2 = 0.15 L；B = 蓝光；P = 紫光；I1 = 550 lux；I2 = 1200 lux。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">处理</td>
			<td>CO2 添加量</td>
			<td rowspan="2">光颜色</td>
			<td rowspan="2">光照强度 (Lux)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>C1</td>
			<td>B</td>
			<td>I1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>C1</td>
			<td>P</td>
			<td>I2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>C2</td>
			<td>B</td>
			<td>I1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>C2</td>
			<td>P</td>
			<td>I2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：实验设计与处理。 实验设计及所用处理的汇总：C1 = 0.078 L；C2 = 0.15 L；B = 蓝光；P = 紫光；I1 = 550 lux；I2 = 1200 lux。
补充文件 1：细胞定量数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67208/Table%20Cellular%20quantification.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究强调了采用Jeffrey和Humphrey所开发的方法从微藻中提取和定量脂溶性色素的优势。该方法是评估生长因素对这些生物体中叶绿素产生及细胞含量影响的重要工具。

微藻包含两大类主要色素：叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素是一种绿色色素，能够吸收光能并将其转化……

本项目评估了生长因子调控对不同规模下微藻（如索科瑞金小球藻和雨生红球藻）中生物技术相关次生代谢产物（如叶绿素）生产的影响。我们的研究重点是建立一种定量分析微藻中叶绿素的分析方法。在这一传统领域中，一些新兴技术包括利用计算技术进行过程建模与优化。然而，要实施这些过程，必须获得有关这些过程的实验信息。在评估对蛋白核小球藻（Chlorella sorokiniana）叶绿素产量影响最大的生长因子时，光照颜色和二氧化碳供应流量是两个最重要的因素。而光照强度的变化对这种代谢产物的产量影响不显著。通过使用能够诱导微藻增加次级代谢产物生成的生长因子，并结合快速、简便且可靠的分析技术，可推动该研究领域的发展。我们的研究为探索和理解微藻在不同底物条件下进行的生化与能量代谢过程提供了指导，并通过评估环境变量的影响，优化其生物量及细胞化合物的生产，以满足多种应用需求。首先，将浓度约为每毫升3×10⁶个细胞的索科灵克小球藻（Chlorella sorokiniana）接种至含有1升培养基的锥形瓶中。将接种后的锥形瓶置于强度为3,600至4,200勒克斯的红光光源下培养，保持温度在22至26摄氏度之间。在7天的培养期间，每隔24小时手动振荡锥形瓶一次。在无菌环境下，将10毫升培养物转移至15毫升锥形管中，并在25至30摄氏度下以3000 G离心20分钟。然后，从离心管中弃去上清液，并将菌体转移至一个无菌的50毫升锥形离心管中。在3至4摄氏度保存以备后续使用前，于550纳米处测定接种物的光密度，以确定小球藻（Chlorella sorokiniana）和雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）的细胞浓度。首先，制备接种物以研究小球藻和雨生红球藻的生长动力学。根据标准实验室操作规程配制所需体积的无菌培养基。将光生物反应器和锥形瓶的光源调节至所需的颜色光谱。遮盖两个系统以防止外部光线干扰。调整光照周期设置后，将二氧化碳曝气系统连接到光生物反应器，为小球藻提供12小时的二氧化碳。接着，接种培养容器，使起始细胞密度达到每毫升300,000个细胞，或在550纳米处的光密度值为0.180。对蛋白核小球藻每12小时、对雨生红球藻每8小时定期取样一次。将40毫升样品放入一个塑料锥形离心管中。在15摄氏度下，以3000 ×g离心20分钟。弃去上清液，加入3毫升90%纯丙酮溶液重悬细胞。然后将细胞转移至用铝箔包裹的玻璃管中，以防止氧化，并使用涡旋振荡器混匀。将悬浮样品在冰浴中进行超声处理，每次5分钟，共两个循环，随后将样品在4摄氏度下静置16小时。静置后，在相同条件下再次对样品进行超声处理，每次5分钟，共两个循环，然后在15摄氏度下以3000 G离心20分钟。使用巴斯德移液管分离色素提取液，并将其转移至另一避光的洁净离心管中。随后将色素提取液放入石英比色皿，在分光光度计中于 630、647 和 664 纳米波长处测定吸光度。利用公式计算叶绿素浓度。在高浓度二氧化碳添加、紫光和高光强条件下处理时，索罗金小球藻的叶绿素含量最高。主效应图显示，光强的影响较二氧化碳和紫光的影响更小。在索罗金小球藻中，叶绿素a和叶绿素b在整个实验过程中均呈现持续上升趋势，且在50小时时叶绿素a含量超过叶绿素b。在50小时时，雨生血球藻的叶绿素浓度下降，其中叶绿素b显著减少，而叶绿素a仍保持较高水平。

evaluation-effect-growth-factors-on-chlorophylls-b-production-from

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

生长因子对微藻叶绿素 a 和 b 生产的影响评价

本文描述了一种基于机械细胞破碎、溶剂法脂质提取、转酯化反应以及气相色谱对脂肪酸进行定性和定量分析的方法，用于测定微藻中的脂肪酸含量及组成。采用三棕榈酸甘油酯作为内标物，以校正提取过程中可能发生的损失以及转酯化反应不完全所造成的影响。...

微藻中脂肪酸含量与组成的分析

发电厂烟气是一种廉价的CO2 藻类生长的来源。我们已构建了原型 "烟气用于藻类培养" 系统，并描述了如何放大藻类培养过程。我们展示了利用传质生物反应模型来模拟和设计烟气最优操作条件以促进藻类生长的方法。 小球藻 藻类光生物反应器中的sp.

通过计算机模拟优化烟气参数以促进光生物反应器中微藻的生长

本实验的目的是展示采用微孔板形式进行微藻筛选的可重复性和适应性。该快速筛选方法结合了 WATER-脉冲振幅调制（WATER-PAM）荧光测定技术，以光合产量作为光系统...

利用 WATER-脉冲振幅调制（WATER-PAM）荧光测定法评估细菌/浮游植物共培养的小体积生物测定法

将微藻培养与工业烟气相结合，最终会将重金属和其他无机化合物引入培养基中。本研究介绍了一种用于确定重金属及无机污染物对在光生物反应器中培养的Nannochloropsis...

微藻生产力中重金属及其他无机污染物的定量分析

本文介绍了可用于估算相关动力学生长参数的台式光合生物反应器的组装过程和操作方法。该系统利用传感器、数据采集与控制单元以及开源数据采集软件，对pH值、光照和温度进行连续监测。...

用于动力学生长测试的台式藻类光合生物反应器的构建与设置：具备温度、光照和pH监测功能

本文介绍了一种构建实验室规模气泡柱式光生物反应器的方案，并利用该反应器培养微藻的方法。同时提供了测定微藻培养物生长速率和中性脂质含量的实验方法。...

气泡柱光生物反应器中绿藻的培养及中性脂质检测方法

在小试规模下进行无菌培养，有助于在后续工艺放大之前对微藻进行表征并优化其生产效率。光生物反应器可提供必要的控制条件，以确保微藻实验的可靠性与可重复性，并可改造用于安全培养利用城市或工业燃烧排放的腐蚀性气体（CO2、SO2、NO2）作为营养源的微藻。...

微型藻类在小型光生物反应器中利用腐蚀性烟道气的培养及生物量定量

本实验方案展示了如何利用表型微阵列（phenotype microarray, PM）技术平台，确定绿色微藻Chlamydomonas...

高通量代谢谱分析用于微藻模型的优化

本文介绍了具有可定制光照条件的实验室光生物反应器（PBRs）的设计。通过连续测量体积氧产量，可对以碳酸氢盐为碳源的蓝细菌或微藻的生长进行实时监测。这些光生物反应器能够在实验过程中减少人为干预，实现快速、重复的实验室生长比较。...

在线生长监测与可定制光照条件的实验室光生物反应器操作

本实验方案详细描述了基于光谱分析的红藻藻胆蛋白变化的自发荧光成像与评估步骤。该方法无需标记且对样品无损伤，适用于仅能获取少量材料、细胞在实验室条件下生长缓慢或完全无法生长时，对细胞适应极端生境能力的评估。...

利用自发荧光成像评估红藻生理状态

本方案概述了以下方法的使用 根癌农杆菌介导的转化（AMT），用于将目的基因整合到绿色微藻的核基因组中...

Agrobacterium tumefaciens介导的绿色微藻Chlorella vulgaris遗传工程

了解微藻叶绿素a和b生产的分析方法，探索光色和二氧化碳供应对Chlorella sorokiniana和Haematococcus pluvialis叶绿素产量的影响。该研究为优化微藻代谢物生产提供了重要的生物技术指导。

评估生长因子对微藻中叶绿素a和b生成的影响

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