优化低温电子显微镜的样品制备

制冷剂样品制备面临的挑战可能会限制其有效性，尤其是颗粒分布不均匀。这个问题通常会导致新构建的蛋白质结构的分辨率差和准确性降低。使用各种实验方法来克服颗粒分布不均匀的问题，包括向样品中添加去污剂或膜模拟物、修改网格支撑膜以及在数据收集过程中倾斜特定阶段。

该方案分析了一种简单的实用方法，通过样品制备优化来解决颗粒分布不均匀的问题，为研究人员使用制冷剂有效说明大分子结构提供了参考。首先，收集含有 MJ 小热休克蛋白 16.5 的合并蛋白质组分。使用截留分子量为 50 千道尔顿的离心过滤器将馏分浓缩在 4 摄氏度至约 65 毫克。

浓缩后，将样品在 4 摄氏度下以 16， 000 G 离心 10 分钟，以去除聚集体。将 50 微升体积的上清液分装到 0.2 毫升薄壁 PCR 管中。对于透射电子显微镜，在冰上解冻两个冷冻的蛋白质管。

解冻后，轻弹试管数次以混合。然后将蛋白质溶液在 4 摄氏度下以 16， 000 G 离心 10 分钟以去除聚集体。接下来，将上清液注入体积排阻色谱柱上，并收集 0.5 mL 洗脱馏分。

收集与峰相对应的 elucian 级分，在 280 纳米处表现出最高的紫外吸光度。对于缓冲液更换，用一把剪刀将透析膜切成 30 x 30 毫米的小块。将碎片在蒸馏水或缓冲溶液中孵育以平衡它们。

接下来，将 55 微升蛋白质溶液添加到带有 50 微升微量透析按钮的腔室中。使用镊子垂直握住透析膜，轻轻地将膜的一侧边缘与薄纸接触以排出多余的液体。小心地用膜盖住微量透析按钮。

将 O 形圈放在透析膜顶部，轻轻将其卷入按钮边缘的凹槽中。将每个透析按钮浸入装有目标缓冲液的单独烧杯中，膜面朝上。使用带有细针的注射器小心地刺穿膜，并从微量透析室中回收蛋白质溶液。

将 5 微升浓度为每毫升 20 至 120 纳克的样品加载到辉光放电网格上。在石蜡薄膜片上准备三滴 50 微升的水滴。将网格表面与水滴摩擦以清洗样品。

现在将 5 微升过滤后的 1% 尿瓶醋酸盐溶液加载到网格上，并立即移出尿瓶醋酸盐溶液。将另外 5 微升小便池醋酸盐溶液加载到网格上。用滤纸轻轻接触网格的镊子侧，去除多余的染色液，然后让网格干燥。

将镊子和辉光放电网格组件安装到仪器上。然后将 4 微升样品加载到网格的碳侧。启动投入式冷冻过程。

为了准备加载到透射电子显微镜或 TEM 上的网格，首先将一个包含玻璃化网格的网格盒放入自动网格组装站，然后拧下包含玻璃化网格的网格盒的盖子。将自动网格环放在装配站的指定切口空间中。小心地将玻璃化网格从网格盒中移出，并将其放入自动网格环中。

现在对齐光盘，将圆形开口定位在自动网格环和网格组件的顶部。要将网格固定到自动网格环中，请将 C 形夹插入工具放在网格顶部，然后轻轻按下以将 C 形夹固定在内部。将光盘向后旋转，将组装好的网格移动到自动网格存储盒中。

组装盒装载站并用液氮冷却。将自动网格存储箱放入装载站。将栅格组件从自动栅格存储盒移动到盒中。

使用手柄将包埋盒放入自动加载机胶囊中。检查自动加载器中的销钉以确认其自由移动并确保它没有冻结。在所有测试的网格上观察到颗粒在阵列中积累，无论缓冲条件或表面电荷修饰如何。

较高的蛋白质浓度与 9 毫摩尔 mobstress、50 毫摩尔氯化钠和 0.1 毫摩尔 EDTA 缓冲液中的带负电荷的网格相结合，导致单个颗粒在网格孔内的理想分布，从而减少蛋白质阵列的形成。这种优化条件导致锥形 FSC 面积比值为 0.80，SCF 值为 0.859，证实了均匀的颗粒分布。