Name: 优化低温电子显微镜的样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 学习优化低温电子显微镜样品制备的实用方法，以Methanocaldococcus jannaschii为例解决颗粒分布不均问题。该方案为研究人员高效解析大分子结构提供可靠参考。

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我们感谢韩国成均馆大学的联合研究设施中心（CCRF）慷慨地向我们开放其冷冻电镜设施的使用权。本工作由韩国国家研究基金会（NRF）通过韩国政府（MSIT）资助给 K.K.K. 的项目（编号：2021M3A9I4022936）支持。&#160;使用NEXUS联盟的冷冻电镜设施得到了韩国国家研究基金会项目RS-2024-00440289的资助。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 蛋白质纯化
<ol>
	<li>在 E. coli BL21(DE3) 中诱导表达重组 MjsHSP16.5 蛋白，并按照先前所述方法使用镍螯合层析柱纯化该蛋白26。经尺寸排阻层析（SEC）柱进一步纯化后26，取洗脱峰组分 5 µL 上样至 12.5% SDS-PAGE 凝胶，通过标准考马斯亮蓝染色法检测蛋白纯度28（图 2）。</li>
	<li>使用截留分子量为 50 kDa 的离心过滤器，根据制造商说明书（见材料表），在 4 °C 下将含有 MjsHSP16.5 的合并组分浓缩至约 65 mg/mL。 
	注意：离心过程中每 5 分钟轻柔吹打一次&#160;蛋白溶液，以防止蛋白聚集。</li>
	<li>浓缩完成后，在 4 °C 下以 16,000&#160;x&#160;g 离心 10 分钟，去除聚集物；将上清液分装至 0.2 mL 薄壁 PCR 管中，每管 50 μL，用液氮速冻后于 -80 °C 保存，待后续使用。</li>
</ol>
2. 用于透射电子显微镜（TEM）成像的蛋白质制备
<ol>
	<li>将两管冷冻蛋白置于冰上解冻。解冻后，轻轻弹击管壁数次以充分混匀溶液，并在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟，以去除聚集物。</li>
	<li>将上清液上样至&#160;SEC 柱，并收集每管 0.5 mL 的洗脱组分。</li>
	<li>收集在 280 nm 处具有最高紫外吸光度的峰对应的洗脱组分，并使用 Bradford 法测定这些组分中的蛋白浓度29。 
	注意：为确保下游应用中单个峰组分含有足够的蛋白浓度，需在不超过 SEC 柱推荐载样量的前提下，上样较大量的蛋白样品。</li>
</ol>
3. 缓冲液置换
<ol>
	<li>配制所需的缓冲液（9 mM MOPS-Tris（pH 7.2）、50 mM NaCl 和 0.1 mM EDTA），将缓冲液分装至 50 mL 烧杯中，并将缓冲液烧杯置于 4 °C 保存。 
	注意：根据目标蛋白生化特性的已有知识，配制多种不同组成的缓冲液（如缓冲类型、pH 和离子强度），例如 20 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl 和 0–5 mM DTT，以确定能够促进蛋白在后续载网制备中具有最佳溶解性、均一性和稳定性的条件。</li>
	<li>按照制造商说明书准备透析膜（参见材料表）。</li>
	<li>使用剪刀将透析膜剪成 30 mm&#160;× 30 mm 的小片。通过将这些膜在去离子水或缓冲液中孵育进行平衡（图 3A）。</li>
	<li>向 50 μL 微型透析装置的腔室中加入 55 μL 蛋白溶液（浓度约为 2.5 mg/mL）（图 3B）。</li>
	<li>用镊子垂直夹住透析膜，轻轻将膜的一边接触滤纸以去除多余液体（图 3C）。小心地将透析膜覆盖在微型透析装置上，确保微型透析腔内无气泡产生（图 3D）。将 O 形圈置于透析膜上方，轻轻将其滚入装置边缘的凹槽中。</li>
	<li>替代方法：将 O 形圈套在高尔夫球座的轴线上，并将高尔夫球座倒置放在膜上（图 3E）。轻轻将 O 形圈沿高尔夫球座滑下，使其脱离并套在装置边缘（图 3F）。小心引导 O 形圈进入装置边缘的凹槽中（图 3G）。</li>
	<li>将每个透析装置浸入盛有终末缓冲液的独立烧杯中，确保膜面朝上（图 3H）。</li>
	<li>透析过程中将烧杯保持在 4 °C。2 小时后更换透析缓冲液，并继续透析过夜。</li>
	<li>使用带有细针的注射器（如 Hamilton 注射器或胰岛素注射器）小心刺穿膜，从微型透析腔中回收蛋白溶液（图 3I）。将蛋白样品收集至微量离心管中，置于冰上保存以备后续使用。采用 Bradford 法测定蛋白浓度29。</li>
</ol>
4. 载网制备
<ol>
	<li>选择合适的载网类型。 
	注意：通常使用铜支持膜上的无定形有孔碳膜。应根据所需的冰层厚度选择碳膜厚度、孔径大小和网格数目。本实验中 MjsHSP16.5 样品制备采用了有孔碳膜载网。</li>
	<li>使用镊子轻轻夹住载网边缘，避免损坏载网上的孔洞。将载网放置于载网架上，使碳膜面朝上。将载网架放入电晕放电系统的腔室中。</li>
	<li>在 15 mA 条件下进行 60 秒的电晕放电处理，使载网具有亲水性。建议在此过程中施加负电荷。 
	注意：推荐的参数是本研究所用电晕放电系统的起始条件。根据不同的电晕放电仪器类型以及特定载网材料所需达到的亲水程度，可能需要进行优化。对于等离子清洗，可考虑测试其他气体或气体混合物，如氢气或氩-氧混合气体。</li>
	<li>可选步骤：将额外的化学溶液（如装在敞口玻璃瓶中的 99% 戊胺）引入载网架旁边的腔室中，以在载网上产生净正电荷。</li>
	<li>放电处理后的载网应在 0.5–1 小时内使用，以确保最佳性能。</li>
</ol>
5. 负染电镜载网制备
<ol>
	<li>将5 µL样品（50-300 nM 或 20-120 ng/mL）加到辉光放电处理的载网上。让样品在载网表面静置1分钟，以促进蛋白质沉降。</li>
	<li>在石蜡膜片上制备三滴各50 µL的水。通过轻轻将载网表面与第一滴水接触并轻擦，对载网上的样品进行清洗。用剩余的两滴水重复此清洗步骤。 
	注意：清洗时间可根据每个实验的具体需求进行优化。</li>
	<li>向载网上加入5 µL过滤后的1%（w/v）醋酸铀酰溶液，并立即用移液器吸除醋酸铀酰溶液。</li>
	<li>再次向载网上加入5 µL的1%（w/v）醋酸铀酰溶液。让载网在醋酸铀酰溶液中孵育90秒以进行染色。 
	注意：染色时间可根据具体样品进行调整和优化。</li>
	<li>用滤纸轻轻接触载网的镊子一侧，以去除多余的染色液。让载网在室温下完全自然干燥。将干燥后的载网置于载网盒中，在室温下保存直至观察。</li>
</ol>
6. 样品玻璃化
<ol>
	<li>将蛋白样品稀释至所需浓度。 
	注意：蛋白浓度应足够高，以最大化每个孔中的颗粒数量，但又需足够低，以确保单颗粒的分布。冷冻电镜蛋白浓度通常在 0.5 至 2 mg/mL 范围内。然而，某些蛋白根据其分子量和特定的样品制备条件，可能需要超出此范围的浓度。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心 10 分钟，以去除任何聚集体。</li>
	<li>开启冷冻固定仪器。将蒸馏水注入加湿器储水槽中。在吸水纸垫上安装带环的滤纸。设置玻璃化参数（温度：4 °C，湿度：100%，吸水时间：6 秒，吸水力度：5 单位，等待时间：10 秒）。 
	注意：吸水时间和力度是优化玻璃化装置的重要参数，因为从载网中去除水分以及颗粒暴露于气液界面可能导致解离或取向偏好。</li>
	<li>将冷冻剂容器组件（包括黄铜杯、载网盒支架、蜘蛛单元和防污染环）组装到底板托盘中。通过向托盘中注入液氮来冷却容器组件。向黄铜杯中加入冷冻剂（液态乙烷）。当冷冻剂达到熔点温度时，移除蜘蛛单元。</li>
	<li>将镊子和载网组件安装到仪器上，将样品（通常为 4 µL）加载到载网的碳膜面，然后启动浸入冷冻过程。</li>
	<li>小心地将镊子从仪器上取下，将载网放入储存用载网盒中，并用盖子密封盒子。将含有玻璃化样品的载网盒存放在液氮中。</li>
</ol>
7. 将载网加载到透射电子显微镜
<ol>
	<li>组装自动网格装配站，并用液氮冷却。</li>
	<li>将含有玻璃化网格的网格盒放置到位，小心拧开盖子以接触网格。在附近放置一个空的自动网格储存盒，以便于转移已组装的网格。</li>
	<li>将自动网格环放置在装配站上为环设计的切口位置。小心地将玻璃化网格从网格盒中移出，并将其嵌入自动网格环内。确保网格与环对齐。</li>
	<li>调整圆盘，使圆形开口对准自动网格环和网格组件的上方。为将网格固定在自动网格环中，将C型夹插入工具置于网格上方，轻轻下压，使C型夹卡入到位。</li>
	<li>将圆盘旋转回位，并将组装好的网格移入自动网格储存盒中。</li>
	<li>组装样品盒装载站，并用液氮冷却装载站。</li>
	<li>将自动网格储存盒放入装载站中。将网格组件从自动网格储存盒转移至样品盒中，并轻轻敲击网格以确保其正确就位。</li>
	<li>使用手柄将样品盒装入自动进样胶囊中。检查自动进样器中的销钉，确认其可自由移动，并确保其未被冻结。</li>
	<li>将自动进样胶囊对接至透射电子显微镜（TEM），以进行网格观察。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所有蛋白质结构研究都始于蛋白质纯化，这是一个迭代过程，旨在实现高纯度和均一性地分离目标蛋白质，同时保持其天然功能活性。尽管在纯化过程中会精心选择用于纯化和保存蛋白质样品的缓冲液组成，但这些缓冲液在后续的冷冻电镜（cryo-EM）样品制备和成像中常常带来挑战6。这一问题源于缓冲液成分与冷冻电镜分析所需条件之间的不匹配，因此必须进行一个关键步骤：将蛋白质储存缓冲液优化为适用于高效冷冻电镜分析的兼容缓冲液。然而，并不存在适用于所有蛋白质的通用方案，因为每种蛋白质都具有独特的结构和功能特性24。因此，最佳的样品制备方案可能因具体研究的蛋白质而异。
蛋白质在特定pH范围内才具有基本的稳定性34，因此必须将缓冲液的pH值维持在蛋白质的稳定pH范围之内。对于研究较为充分的蛋白质，此类信息通常可在文献中便捷获取；而对于其他蛋白质，则需通过特定的生化实验来确定。此外，蛋白质的稳定状态有助于提高蛋白质晶体成功生长的可能性35...

随着仪器硬件1,2和图像处理软件3,4,5的最新进展，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为现代结构生物学中一种广受欢迎且功能强大的工具。尽管取得了这些突破，但在利用 cryo-EM 获得高分辨率大分子结构方面仍存在瓶颈。其中一个重大挑战是颗粒分布不均，包括取向偏好现象，这种现象主要出现在气液界面6,7,8,9。
在样品玻璃化过程中，某些分子倾向于在载网上沿特定轴向排列，这会导致最终数据集中粒子视角分布不均。某些取向可能被过度代表，而其他取向则可能被低估甚至完全缺失，从而造成对完整蛋白质结构采样的不充分。那些优先朝向电子束的蛋白质区域在密度图中会显得更为明显，而背离电子束的区域则可能分辨率较差或完全缺失10,11。因此，粒子分布不均会向最终重建的三维（3D）结构引入潜在的偏差和伪影。值得注意的是，α螺旋和β折叠等关键结构元件可能出现扭曲，氨基酸或核苷酸链可能呈现断裂状，特定蛋白质或核酸片段的密度可能出现畸变12。最终，这些错误表征对准确解析生物大分子的结构与功能构成了重大挑战。
目前有多种实验方法可用于应对这些挑战，包括样品制备优化13,14,15、载网处理16,17,18,19,20,21,22以及数据采集策略23。值得注意的是，建议在可行的情况下优先在样品制备阶段解决这些问题7。样品制备中的常见优化措施包括调整缓冲液组成、引入小分子或大分子结合伴侣、生成分子内交联以及更换去垢剂。对于膜蛋白同样适用这些方法24,25，但去垢剂必须专门用于纯化和稳定目的。在这些方法中，蛋白质缓冲液优化因其可定制性强、成本效益高且在大多数实验室中易于实施，成为首选策略。该方法允许针对每种蛋白质样品的具体需求，精确且即时地调节各种参数。通过迭代优化，研究人员可以系统地测试不同的缓冲条件，并调整多种参数，以尽量减少优势取向并提高冷冻电镜数据的整体质量。仅通过改变蛋白质缓冲液组分及其浓度，已被证明可通过调节蛋白表面电荷来影响蛋白质稳定性，从而进一步影响蛋白质在玻璃态冰中的行为25。因此，优化蛋白质缓冲液组成被认为是解决冷冻电镜中常见问题最便捷且最直接的方法之一。
本文提出了一种解决冷冻电镜（cryo-EM）中常见难题——颗粒分布不均问题的实验方案。该方案以嗜热甲烷球菌的小热休克蛋白（Methanocaldococcus jannaschii sHSP16.5，简称MjsHSP16.5）为案例研究（图1），详细阐述了蛋白质制备与缓冲液筛选的关键步骤，并结合载网制备流程进行说明26。该小热休克蛋白具有天然稳定性，单体分子量为16.5 kDa，可组装成由24个亚基构成的八面体笼状结构26,27，是利用冷冻电镜进行结构分析的理想候选分子。然而，在冷冻电镜数据采集过程中出现的颗粒分布不均现象并未被预先预料，成为实验中的一大挑战。本文还讨论了可能有助于研究人员应对类似问题的潜在策略，从而推动利用冷冻电镜高效解析大分子结构的研究进程。

<table><tbody><tr><td>14 mL 圆底管</td><td>SPL Life Sciences</td><td>40114</td><td></td></tr><tr><td>250 &amp;micro;L 气密式进样器，型号 1725 LTN</td><td>Hamilton</td><td>81100</td><td>固定针头，22s 规格，2 英寸，2 号针尖类型</td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L 透析按钮</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-326</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 玻璃烧杯</td><td>DIAMOND</td><td>HA.1010D.50</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA pure 25 L</td><td>Cytiva</td><td>29018224</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤单元</td><td>Millipore</td><td>UFC905024</td><td>50 KDa 截留分子量</td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Supelco</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Dumoxel Style N5 镊子</td><td>Dumont</td><td>0103-N5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Glacios 2 冷冻透射电子显微镜</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GLACIOSTEM</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 层析柱</td><td>Cytiva</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.5 mL</td><td>HD Micro</td><td>H23015</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管，0.2 mL，平盖</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow 等离子清洗仪</td><td>Ted Pella</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO 透射电镜载网支架块</td><td>Ted Pella</td><td>16820-25</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 1.2/1.3 200 目，铜网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q2100CR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 RC 透析膜管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>086705B</td><td>3500 道尔顿截留分子量</td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL 层析柱</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VITROBOT</td><td></td></tr><tr><td>VitroEase 缓冲液筛选试剂盒及去垢剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A49856</td><td></td></tr></tbody></table>

优化冷冻电子显微镜样品制备

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

冷冻电子显微镜（cryo-EM）通过在玻璃态冰中悬浮生物大分子，使其在接近天然状态下进行结构研究，从而彻底改变了结构生物学。该技术无需结晶即可实现对蛋白质及其他生物大分子的高分辨率可视化，为理解其功能与作用机制提供了重要见解。近年来，随着单颗粒分析技术的进步以及计算数据处理能力的提升，冷冻电镜已成为现代结构生物学不可或缺的工具。尽管该技术的应用日益广泛，但仍面临一些持续存在的挑战，可能限制其有效性，尤其是颗粒分布不均的问题。这一问题常导致重构蛋白结构的分辨率降低和准确性下降。本文介绍一种简单且实用的方法来应对这一挑战，所用模型为小热休克蛋白 Methanocaldococcus jannaschii 以MjsHSP16.5为例。该方法优化了样品制备流程，以最大限度减少优先吸附现象，确保更均匀的颗粒分布，从而获得更高品质的蛋白质冷冻电镜结构。该技术为致力于克服结构研究中类似难题的研究人员提供了有价值的指导。

为了确定 MjsHSP16.5 的最佳载网条件，首先进行了冷冻电镜初步筛选，主要聚焦于考察多种蛋白质缓冲条件：（1）最终纯化缓冲液，该缓冲液可确保 MjsHSP16.5 的稳定性和均一性，对其结晶至关重要30；（2）根据获得高分辨率衍射质量的 MjsHSP16.5 晶体所需条件优化的缓冲液30；以及（3）先前在 MjsHSP16.5 的电子显微镜（EM）研究中使用的缓冲液31,32。
在进行缓冲液优化（如步骤3所述，使用微透析装置进行缓冲液置换）的同时，还考察了不同的辉光放电参数以改变载网表面电荷，具体如步骤4所述。载网可保持未放电状态（疏水性），或进行辉光放电处理以形成带负电荷或正电荷的亲水性表面。无论缓冲液种类或载网电荷状态如何，所有载网上均观察到颗粒呈阵列状聚集，表明颗粒分布不均（图4A-<...

本方案以Methanocaldococcus jannaschii（MjsHSP16.5）为例，通过优化样品制备流程解决颗粒分布不均的问题，为研究人员高效解析大分子结构提供利用低温电子显微镜（cryo-EM）的技术参考。

冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）通过实现对近天然状态下大分子结构的研究，彻底改变了结构生物学领域。

冷冻样品制备面临一些可能限制其有效性的挑战，尤其是颗粒分布不均的问题。这一问题常常导致新构建的蛋白质结构分辨率降低和准确性下降。为克服颗粒分布不均，已采用多种实验方法，包括在样品中添加去污剂或膜模拟物、修饰载网支撑膜，以及在数据采集过程中倾斜特定角度的样品台。本方案介绍了一种通过优化样品制备来解决颗粒分布不均问题的简单实用方法，为研究人员高效利用冷冻电镜揭示大分子结构提供了参考。首先，收集含有MJ小热休克蛋白16.5的蛋白组分混合液。使用截留分子量为50千道尔顿的离心过滤装置，在4°C条件下将组分浓缩至约65毫克/毫升。浓缩后，在4°C条件下以16,000 G离心10分钟，以去除聚集体。将上清液分装至0.2毫升薄壁PCR管中，每管50微升。进行透射电子显微镜观察时，将两管冷冻保存的蛋白质样品置于冰上解冻。解冻后，轻轻弹击离心管数次以混匀。随后在4摄氏度条件下，以16,000 G离心10分钟，去除蛋白溶液中的聚集体。接着将上清液上样至尺寸排阻色谱柱，并收集0.5毫升的洗脱组分。收集对应于峰值的洗脱组分，该组分在280纳米处表现出最高的紫外吸收。为进行缓冲液置换，用剪刀将透析膜剪成30 × 30 毫米的片状。将这些片状物在蒸馏水或缓冲溶液中孵育，以使其平衡。接着，将55 µL蛋白溶液加入含有50 µL微透析按钮的腔室中。用镊子将透析膜垂直夹住，轻轻将膜的一边接触滤纸以吸去多余液体。小心地用透析膜覆盖微透析按钮。将 O 型圈放在透析膜顶部，轻轻将其滚入按钮边缘的凹槽中。将每个透析按钮分别浸入盛有目标缓冲液的烧杯中，透析膜一侧朝上。使用带细针头的注射器小心刺穿膜，从微透析室中回收蛋白质溶液。将浓度为每毫升20至120纳克的样品5微升加样至经辉光放电处理的载网。在石蜡膜片上制备三滴各50微升的水滴。将载网表面轻轻擦拭水滴，以洗涤样品。现在将5 µL过滤后的1%醋酸铀溶液滴加到载网上，立即用移液器吸除醋酸铀溶液。再向载网上滴加5 µL醋酸铀溶液。用滤纸轻轻接触载网的镊子一侧，除去多余的染色液，然后让载网自然干燥。将镊子和辉光放电处理的载网组件安装到仪器上。然后将四微升样品加载到载网的碳膜面。启动浸入式冷冻程序。为准备将载网装入透射电子显微镜（TEM），首先将装有玻璃化载网的载网盒放入自动载网组装站，并拧开装有玻璃化载网的载网盒盖。将自动载网环放置在组装站指定的凹槽位置。小心地将玻璃化载网从载网盒中取出，并将其安装到自动载网环内。现在将圆盘对齐，使圆形开口位于自动网格环和网格组件的上方。要将网格固定到自动网格环中，请将C型夹插入工具放在网格上方，轻轻按压以将C型夹固定到位。然后将圆盘旋转回原位，并将组装好的网格移入自动网格储存盒中。组装卡带装载站并用液氮冷却。将自动网格存储盒放入装载站中。将网格组件从自动网格存储盒转移至卡带中。使用手柄将盒式架放入自动加载胶囊中。检查自动加载器中的针头，确认其可自由移动，确保针头未被卡住。在所有测试的载网上均观察到阵列中的颗粒聚集现象，无论缓冲条件或表面电荷修饰如何。在9毫摩尔的mobstress、50毫摩尔的氯化钠和0.1毫摩尔的EDTA缓冲液中，较高的蛋白浓度结合带负电荷的载网，可实现网格孔内单颗粒的理想分布，减少蛋白聚集物的形成。该优化条件获得了0.80的高圆锥形FSC面积比值和0.859的SCF值，证实了颗粒分布的均匀性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

优化低温电子显微镜的样品制备

冷冻电子显微镜，包括扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM），广泛用于含水量较高的生物样品或其他材料的表征1。利用扫描电镜/聚焦离子束（FIB）可识别样品中感兴趣的结构特征，并切割出一片薄而电子束可穿透的薄片，用于转移至冷冻透射电镜中进行进一步分析。...

利用聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样品

本文介绍了冷冻电子显微镜技术，该方法可用于获得大分子在接近天然状态下的高质量显微图像。该技术所获得的图像适用于后续基于单颗粒分析方法的计算机处理，以实现大分子的三维结构重建。...

冷冻电镜技术的注意事项：大分子三维重构的样品制备与高质量数据采集入门指南

本文介绍了一种用于制备纳升级样品体积以进行透射电子显微镜观察的仪器及方法。该方法无需滤纸吸 blotting...

用于透射电子显微镜的微型化样品制备

本文介绍了一种结合两种样品处理技术的实验方案：高压冷冻与微波辅助样品处理，随后进行极小树脂包埋，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）获取数据。本方法以小鼠胫神经样品和Caenorhabditis...

高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

本方案介绍了一种用于同步辐射X射线吸收光谱实验的生物冷冻样品制备的详细步骤。我们描述了优化样品制备和冷冻保存所需的所有步骤，并以癌细胞和浮游植物细胞为例展示了该方案的应用。该方法为生物样品的冷冻制备提供了通用标准。...

使用高分辨率X射线吸收光谱法在低温条件下进行物种分析的生物样品制备

低温聚焦离子束（FIB）与扫描电子显微镜（SEM）技术可为完整固液界面的化学性质和形貌提供关键信息。本文详细介绍了此类界面高质量能量色散X射线（EDX）光谱图的制备方法，重点聚焦于储能器件。...

通过将冷冻聚焦离子束刻蚀与扫描电子显微镜及光谱技术联用实现液-固界面的纳米尺度表征

数据的信噪比是进行微晶X射线衍射测量时最重要的考虑因素之一。VMXm光束线为此类实验提供了低噪声环境和微束条件。本文介绍了适用于VMXm及其他微聚焦大分子晶体学光束线的微晶样品制备、安装与冷却方法。...

用于VMXm光束线微晶样品制备的工作流程

利用冷冻电镜（cryoEM）解析大分子复合物的结构已成为某些类别蛋白质和复合物的常规方法。本文概述了该流程（包括样品制备、筛选、数据采集与处理），并引导读者参考更详细的资源，以针对更具挑战性的样品调整相关变量。...

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

本文概述了用于手动冷冻生物样品以进行单颗粒冷冻电子显微镜观察的印迹-投入法。...

生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

本文介绍了一种用于引导冷冻电子断层成像样品制备的三维关联聚焦离子束切削技术流程。首先通过冷冻荧光显微镜确定荧光标记的目标蛋白的三维位置，随后对该位置进行聚焦离子束切削。该方案适用于哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。...

用于高分辨率冷冻电子断层扫描的三维关联聚焦离子束切片样品制备

该方法提供了一种简便且灵活的电镜（EM）载网制备方案，适用于 原位...

样品制备 原位 哺乳动物细胞的冷冻断层扫描技术

学习优化低温电子显微镜样品制备的实用方法，以Methanocaldococcus jannaschii为例解决颗粒分布不均问题。该方案为研究人员高效解析大分子结构提供可靠参考。

优化冷冻电子显微镜样品制备

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