Name: 马肠胶质细胞培养及其在马肠神经炎症机制研究中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习从马小肠中分离肠胶质细胞的方法，用于研究术后并发症中的神经炎症机制。该方案可评估炎症性肠胶质细胞对肠道屏障功能的影响，为马匹术后管理提供新思路。

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作者感谢莫里斯动物基金会对本项目的资助。

马肠神经胶质原代培养物来自三匹因与本研究无关原因而被人道实施巴比妥类药物过量安乐死的马。用于培养研究的马匹均为成年马，且无当前胃肠道疾病病史。
1. 马肠黏膜下层肠胶质细胞原代培养
<ol>
	<li>从三匹成年马的空肠隐窝中培养马源上皮单层细胞。
	<ol>
		<li>将24孔板用包被液在37 °C孵育2小时，或在室温过夜包被，随后用无菌水洗涤2次，并在室温下保存，直至细胞准备接种。</li>
		<li>在人道安乐死后60分钟内，取出一段空肠组织并置于冰上预冷的林格氏液中。</li>
		<li>从空肠中取出一段约10 cm长的组织，在对系膜缘切开，使非淋巴组织区域位于组织中央。将组织修剪成约7 cm × 7 cm大小的片状。在解剖前，用新鲜的林格氏液充分冲洗组织。</li>
		<li>将组织固定在涂有硅橡胶的培养皿中，黏膜面朝上，置于冷的林格氏液或PBS中，并尽可能拉伸组织（图1A）。</li>
		<li>使用弯头镊子去除肠绒毛（图1B），随后从约5 cm × 5 cm的非淋巴区域去除固有层（图1C）。 
		注：这些层可轻易与黏膜下层分离（图1B）。</li>
		<li>用显微解剖剪在组织一角松解黏膜下层，将其整片剥离，并在剥离过程中观察其与空肠内环肌层之间的自然分离现象（图1D）。</li>
		<li>将收集的黏膜下层组织剪碎为2–5 mm大小的片段，放入含有5 mL &#34;Organo-FBS&#34;（表1）、0.825 mg胶原酶、5 mg蛋白酶和20 mg牛血清白蛋白的50 mL锥形管中。在37 °C孵育2–3小时以进行酶消化。</li>
		<li>孵育结束后，加入10 mL室温的&#34;Organo + FBS&#34;以终止酶反应。使用10 mL移液管将组织混合物上下吹打约15次，使细胞从组织中解离，随后在室温下以3,000 × g离心3分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用10 mL室温PBS重悬沉淀，再次使用10 mL移液管上下吹打约15次，使细胞充分解离。</li>
		<li>将锥形管在室温下以3,000 × g离心3分钟。弃去上清液，加入10 mL室温的&#34;Organo + FBS&#34;，使用10 mL移液管上下吹打约15次，使细胞从组织中解离。</li>
		<li>将细胞依次通过孔径为100 µm、70 µm和40 µm的细胞筛进行过滤。</li>
		<li>将过滤后的细胞和培养基在室温下以3,000 × g离心3分钟。弃去上清液，用1 mL &#34;Organo + FBS&#34;重悬沉淀。</li>
		<li>使用台盼蓝染色以鉴别活细胞，并用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>在24孔板的每孔中加入约400,000个细胞，悬浮于300 µL &#34;Organo + FBS&#34;中，并向每孔添加生长因子：N2 5 µL/孔，G5 5 µL/孔，B27 10 µL/孔。将24孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，使细胞贴壁。24小时后，更换为含上述生长因子的&#34;胶质细胞培养基&#34;（表1），每48小时更换一次培养基（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫荧光细胞学
<ol>
	<li>将肠神经胶质细胞从原代培养（P0）（步骤 2.1.14）培养至 70-80% 汇合度，并传代一次（P1）。</li>
	<li>在加入 0.1% PBS 叠氮化物之前，使用 4% 多聚甲醛将原代培养（P0）细胞在孔板中固定 5 分钟。</li>
	<li>配制含 PBS 叠氮化物、4% 驴血清和 0.5% Triton-X 的封闭液，每孔加入 300 µL 封闭液，在室温下孵育 2 小时以通透细胞。</li>
	<li>在封闭液中按 1:1,000 稀释比加入胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的一抗，以及成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白的一抗，4 oC 过夜孵育。</li>
	<li>加入二抗前用 PBS 洗涤 3 次，二抗为驴抗兔 IgG Alexa Fluor 594 和羊抗小鼠 IgG Alexa Fluor 488，按 1:500 稀释比溶于封闭液中，孵育 2-3 小时。</li>
	<li>用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）按 1:1,000 稀释比溶于 PBS 中染色细胞核，孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次后，将细胞保存在 0.1% PBS 叠氮化物中。</li>
</ol>
3. 黏膜下层马肠道胶质细胞原代培养物暴露于IL-1β
<ol>
	<li>当第一代（P1）细胞达到70-80%融合度时，进行IL-1β处理实验。将各孔分别暴露于0 ng、10 ng和25 ng的IL-1β中，持续24小时。处理24小时后，收集并储存每孔的培养基于-80 °C。</li>
</ol>
4. 用于生成肠上皮细胞单层的马源类器官培养
注意：根据 Stewart 等人于 2018 年发表的实验方案，将已冷冻保存的马肠道隐窝和芽状结构进行扩增，用于二维肠类器官研究10。
<ol>
	<li>每个transwell小室使用约700-1,000个芽/隐窝片段（解离为单细胞时约为40,000-50,000个细胞）。在加入肠上皮细胞前，用42 µL的0.05% Matrigel包被transwell小室。于37 oC孵育1小时，使Matrigel固定。吸除多余液体，并将transwell小室在未加盖的情况下干燥30分钟。每个transwell小室中加入200 µL DMEM-F12培养基，将培养板置于37 °C保存备用。</li>
	<li>用PBS洗涤含有类器官的Matrigel凝胶块，然后在冰上加入500 µL细胞回收溶液进行处理。反复吹打，确保将所有细胞完全收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃上清液，并将细胞沉淀重悬于目标体积的肠上皮干细胞（IESC）培养基中。目标体积可通过将所需单层培养数量乘以200 µL培养基计算得出。（表1）。</li>
	<li>先用IESC培养基预润1 mL注射器，然后通过16 G针头吸取细胞悬液。将16 G针头更换为28 G针头，再将细胞悬液经28 G针头推出，以促进类器官的进一步分散。</li>
	<li>将200 µL上述细胞悬液加入包被后的transwell小室的顶侧，同时在基底侧加入500 µL IESC培养基及前述生长因子10。每24-48小时更换一次培养基和生长因子，直至达到汇合状态。汇合状态定义为细胞密度对应跨上皮电阻（TEER）达到1,000 ohms×cm2,11。测量方法见步骤5.1。</li>
</ol>
暴露于炎性细胞因子及马肠道胶质细胞产物后马肠上皮细胞单层的通透性
<ol>
	<li>使用双电极TEER测量室定量测定单层细胞的TEER值，并在每个Transwell可渗透膜上建立基础读数。测量前确保IESC培养基和Transwell放置15分钟以升至室温。向培养杯中加入1.5 mL IESC培养基，并确保Transwell插入物内恰好含有200 µL培养基，使测量时液面高度一致。</li>
	<li>将Transwell插入物的基底外侧暴露于以下物质：每孔含25 ng IL-1β、10 ng和25 ng白细胞介素6（IL-6）的炎症性细胞因子，或暴露于含10 ng或25 ng IL-1β的胶质细胞培养物所产生的胶质产物。对照组Transwell插入物的基底外侧则暴露于胶质细胞培养基，以及未暴露于IL-1β的胶质细胞培养物所获得的培养基。</li>
	<li>将每个Transwell放入培养杯中，每隔10–15分钟测量一次TEER，持续测量45分钟。</li>
</ol>
6. 统计学
<ol>
	<li>计算每个transwell在0、10、20、30和45分钟时间点的TEER变化倍数。</li>
	<li>使用选定的软件（参见材料表），通过非配对单尾t检验，比较TEER降低与基底外侧暴露于IL-1β（25 ng）、IL-6（10 ng、25 ng和100 ng）以及胶质细胞培养基（分别暴露于0 ng IL-1β、10 ng IL-1β和25 ng IL-1β）相对于对照培养基的相关性。</li>
</ol>

Studying Enteric Glial-Epithelial Interactions in Colic-Related Inflammation

<ol><li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Vet J. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>Morton, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+and+postoperative+factors+influencing+short-term+survival+of+horses+following+small+intestinal+resection%3A+92+cases+%281994-2001%29%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Surgical and postoperative factors influencing short-term survival of horses following small intestinal resection: 92 cases (1994-2001).</a> Equine Vet J. 34 (5), 450-454 (2002).</li>
<li>French, N. P., Smith, J., Edwards, G. B., Proudman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+surgical+colic%3A+risk+factors+for+postoperative+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Equine surgical colic: risk factors for postoperative complications.</a> Equine Vet J. 34 (5), 444-449 (2002).</li>
<li>Lisowski, Z. M., Lefevre, L., Mair, T. S., Clark, E. L., Hudson, N. P. H., Hume, D. A., Pirie, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+the+local+inflammatory+response+in+the+intestinal+mucosa+and+muscularis+of+horses+undergoing+small+intestinal+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine the local inflammatory response in the intestinal mucosa and muscularis of horses undergoing small intestinal resection.</a> Equine Vet J. 54 (1), 52-62 (2022).</li>
<li>Sheats, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+review+of+equine+SIRS%2C+sepsis%2C+and+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparative review of equine SIRS, sepsis, and neutrophils.</a> Front Vet Sci. 6, 69(2019).</li>
<li>Mazzotta, E., Villalobos-Hernandez, E. C., Fiorda-Diaz, J., Harzman, A., Christofi, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+and+postoperative+gastrointestinal+tract+dysfunction%3A+pathogenic+mechanisms+and+novel+treatment+strategies+beyond+colorectal+enhanced+recovery+after+surgery+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharm%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus and postoperative gastrointestinal tract dysfunction: pathogenic mechanisms and novel treatment strategies beyond colorectal enhanced recovery after surgery protocols.</a> Front Pharm. 11, 583422(2020).</li>
<li>Stoffels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+involves+interleukin-1+receptor+signaling+in+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia.</a> Gastroenterology. 146 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Yu, Y. B., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+and+their+role+in+the+intestinal+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier.</a> World J Gastroenterol. 20 (32), 11273-11280 (2014).</li>
<li>Savidge, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+regulate+intestinal+barrier+function+and+inflammation+via+release+of+S-nitrosoglutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enteric glia regulate intestinal barrier function and inflammation via release of S-nitrosoglutathione.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1344-1358 (2007).</li>
<li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Vet J. 50 (2), 241-248 (2018).</li>
<li>Hellman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+equine+enteroids+and+enteroid-derived+2D+monolayers+that+are+responsive+to+microbial+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of equine enteroids and enteroid-derived 2D monolayers that are responsive to microbial mimics.</a> Vet Res. 52 (1), 108(2021).</li>
<li>Al-Sadi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+modulation+of+intestinal+epithelial+tight+junction+permeability+is+mediated+by+JNK+pathway+activation+of+claudin-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 modulation of intestinal epithelial tight junction permeability is mediated by JNK pathway activation of claudin-2 gene.</a> PLoS One. 9 (3), e85345(2014).</li>
<li>Ochoa-Cortes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells%3A+A+new+frontier+in+neurogastroenterology+and+clinical+target+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells: A new frontier in neurogastroenterology and clinical target for inflammatory bowel diseases.</a> Inflamm Bowel Dis. 22 (2), 433-449 (2016).</li>
<li>Ziegler, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cell+network+function+is+required+for+epithelial+barrier+restitution+following+intestinal+ischemic+injury+in+the+early+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cell network function is required for epithelial barrier restitution following intestinal ischemic injury in the early postnatal period.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 326 (3), G228-G246 (2024).</li>
<li>Grubišić, V., Gulbransen, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia%3A+the+most+alimentary+of+all+glia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enteric glia: the most alimentary of all glia.</a> J Physiol. 595 (2), 557-570 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究旨在建立一种可重复的马源性肠黏膜下层肠胶质细胞原代培养方法，并展示其在腹痛发生时模拟上皮-胶质细胞相互作用的应用。肠胶质细胞的分离与培养在马属动物中尚属首次，此前在猪、啮齿类动物模型及人类研究中已证实该技术有助于理解肠道疾病的发生机制6,7,13,14。研究此类细胞群体具有潜在重要意义，因其不仅作为肠道环境的上皮下感受器，还具备与肠壁内周围细胞相互作用和通讯的能力。鉴于其敏锐的感知功能，不难设想胶质细胞在马腹痛中可能发挥关键作用——在此过程中，肠组织受到扩张、缺血以及可能的外科操作等因素的应激6。
Lisowski 等人的前期研究已证实，马在绞痛手术时其肠道组织处于高度炎症状态。啮齿类动物肠胶质细胞培养实验进一步凸显了缓解此类炎症环境的重要性，这些实验表明肠胶质细胞能够合成破坏肠道屏障功能的产物7,12。肠道腔内容物渗漏至肠壁不仅会引发炎症反应，还可能进入血液循环，进而导致内毒素性休克或败血症。令人遗憾的是，马绞痛术后患者常面临多种与炎症相关的术后并发症，包括败血症和术后肠梗阻，这些并发症不仅降低存活率并影响动物舒适度，还会增加客户经济负担和情感压力3。建立绞痛发生时上皮细胞与胶质细胞相互作用的模型，可能有助于阐明马在绞痛状态下肠道屏障通透性的潜在机制，并为预防提供可能的途径。
马亚黏膜下肠胶质细胞的培养因物种特性而存在相应的调整与局限性。最重要的是，有效的酶消化所需时间需要进行滴定优化。作者发现，在37 °C条件下用酶孵育2-3小时对于成功分离马肠胶质细胞是必要的。此外，若在传代前让马肠胶质细胞培养物汇合度超过80%，似乎会对细胞培养的活力产生不利影响。目前该方法的主要局限在于样本量。本研究仅涉及从因腹痛接受手术或因非研究相关原因实施安乐死的马匹中获取的组织/细胞。若能从更多个体中持续培养马肠胶质细胞，并建立马肠胶质细胞的冻存与保存方案，将显著提升本研究的效力。
本研究介绍了马源性肠黏膜下层肠胶质细胞培养以及马源性肠上皮细胞原代培养的新用途，这些方法有望成为研究马腹痛及胃肠道疾病的有效手段。此外，尽管过去已成功建立从分离的肠隐窝和类器官培养马肠上皮单层细胞的模型，本研究不仅进一步展示了该模型的应用价值，还鼓励开展更多关于马肠上皮细胞与肠壁内其他细胞类型相互作用的研究。
这些细胞类型之间观察到的相互作用在肠绞痛及其他炎症性胃肠道疾病（如炎症性肠病（IBD）和结肠炎）中具有潜在应用价值。此外，随着肠胶质细胞和肠上皮细胞培养方法的持续优化，未来将有望建立共培养研究体系。进一步而言，尽管本研究重点关注黏膜下层肠胶质细胞群体，因其靠近上皮单层且与肠道屏障功能密切相关，但仍可开展后续工作，以培养并评估来源于肠壁肌间神经丛的马源性肠胶质细胞功能，这有助于明确炎症状态下马源性肠胶质细胞对肠道运动功能的影响15。

马科动物腹痛是急诊会诊中最常见的内科就诊病症1。高达17%的患马需要外科手术干预，因此提高术后疗效应成为马科医学研究的首要任务2。目前，术后腹痛患马面临多种危及生命的疾病风险，包括败血症/内毒素性休克（占患者总数的12.3%）和术后肠梗阻（占患者总数的13.7%）3。尽管在术后并发症治疗方面已取得进展，但仍亟需开发更先进的预防和治疗方法以应对这些状况。
近期研究强调了绞痛患者局部和全身的炎症状态4。例如，与正常肠组织相比，绞痛患者的肠黏膜中肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）以及单核细胞趋化蛋白-1等促炎蛋白的表达水平均显著升高4。从全身角度来看，已有研究表明，肠组织中TNF α水平升高与术后鼻胃反流液量超过2 L的风险增加相关，而后者是术后运动功能障碍的普遍评估指标4。此外，已知给予白细胞介素IL-1β和TNF α可诱发脓毒性休克的临床症状5。
结肠绞痛相关肠道组织炎症状态及其与术后并发症关联的一个可能解释是肠道上皮屏障。在健康状态下，连接肠道单层柱状上皮细胞的紧密连接复合物构成了一道功能性屏障，可限制肠腔内容物及其细菌成分进入黏膜下层和血液循环。然而，由结肠绞痛相关的肠梗阻以及手术过程中肠道操作所引起的肠道扩张和损伤，可能会破坏这种肠道屏障功能。
从肠道壁整体功能组分的角度来看，肠神经系统中的黏膜下层肠胶质细胞网络已被证实对与炎症通路相关的术后并发症的病理生理发展具有关键作用，并可能成为特定的治疗靶点6,7,8,9。肠胶质细胞不仅遍布整个胃肠道，还作为肠道环境的感受器，影响与肠道壁多种细胞类型的信号交流，并直接调控肠道屏障功能6。因此，可以合理推测，这些强大的肠道感受器在受到损伤和炎症刺激时会被激活，并可能引发诸如肠道屏障通透性改变等急性反应。
本研究首次描述了马肠道胶质细胞的培养，以及更具体地探讨了炎症性马肠道胶质细胞对肠屏障功能的作用。本文介绍了马肠黏膜下层肠道胶质细胞原代培养的方法，观察其对炎症因子IL-1β刺激的反应，评估IL-1β刺激后肠道胶质细胞产物对马肠上皮细胞单层通透性的影响，并探讨通过添加马血清实现可能的阻断作用。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>10 mM HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>2 mM GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>25050-061</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-二氨基联苯并咪唑-2-苯基吲哚</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>α-平滑肌肌动蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>7817</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Sigma</td><td>AA9529</td><td>4.4 g/mL 储存液分装，终浓度为 1.1 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗抗真菌素 1x</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>AA3311</td><td></td></tr><tr><td>BSA 50 mg/mL 储存液</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂</td><td>ACROS Organiics</td><td>206791000</td><td>马用林格液成分 &amp;lsquo;s 储液 1：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L，用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。&lt;br/&gt; 与马林格液混合&amp;rsquo;s Stock 2 以制备完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>9891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>21207</td><td></td></tr><tr><td>EVOM EndOhm 双电极 TEER 测量室</td><td>世界精密仪器公司</td><td>EVM-EL-03-01</td><td></td></tr><tr><td>TEER 测量用 EVOM 操作手册</td><td>世界精密仪器公司</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>G5</td><td>Gibco</td><td>17503012</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素溶液</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td>终浓度 20 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Abcam</td><td>4674</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>28175</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&amp;beta; ELISA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ESIL1B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>P330-500</td><td>马用林格液成分&amp;rsquo;s 储液 1：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L。用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。&lt;br/&gt; 与马林格液混合&amp;rsquo;s Stock 2 以配制完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>康宁</td><td>25-00-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>M33-500</td><td>马用林格液成分&amp;rsquo;s 储液 1：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L。用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。&lt;br/&gt; 与马林格液混合&amp;rsquo;s Stock 2 以制备完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP332-1</td><td>马用林格液成分&amp;rsquo;s Stock 2：与其他成分混合后，取100 mL该储备液加入量筒中，用去离子水定容至1 L。用5% CO2调节pH至7.4。&lt;br/&gt; 与马林格液混合&amp;rsquo;s Stock 1 以配制完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S271-10</td><td>马用林格氏液成分&amp;rsquo;s Stock 1：与其他成分混合，取100 mL该储备液加入量筒中，用去离子水定容至1 L。用5% CO2调节pH至7.4。&lt;急性腹痛（绞痛）的炎症性术后状况不仅增加了客户成本、患者不适和住院时间，而且在许多情况下可能危及生命。一类独特的肠道细胞——肠胶质细胞，因其在感知胃肠道环境及与周围细胞类型交流中的作用而日益受到关注。肠胶质细胞与肠上皮细胞之间的相互作用，可能在阐明马肠胶质细胞如何在健康状态和绞痛状态下改变黏膜屏障以调节炎症方面发挥关键作用。为研究这种相互作用，本文介绍一种从马空肠建立原代肠胶质细胞培养的方法，并将这些培养细胞暴露于已知存在于绞痛中的炎症条件下。原代肠胶质细胞培养物来源于因与绞痛无关原因被实施安乐死的成年马。通过显微解剖分离肠绒毛和固有层以暴露黏膜下层。分离的黏膜下层使用胶原酶、蛋白酶和牛血清白蛋白进行酶消化处理2–3小时。随后通过机械消化，包括离心、移液和使用细胞筛（40–100 µm），获得细胞沉淀，并以约400,000个细胞/300 µL培养基的浓度接种于经0.05 mg/mL多聚-L-赖氨酸包被的培养孔中。待细胞融合并完成首次传代后，将肠胶质细胞暴露于马重组IL-1β（0、10、25 ng）中24小时。为模拟绞痛发生时的上皮-胶质细胞相互作用，将经对照组或处理组肠胶质细胞条件化培养的培养基直接加入已融合的马空肠单层细胞中，同时使用双电极EndOhm chamber测量跨上皮电阻（TEER）。这些数据展示了马肠胶质细胞培养众多潜在重要应用中的一个实例。&gt; 与马林格氏液混合&amp;rsquo;s Stock 2 以制备完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP329-500</td><td>马用林格液成分&amp;rsquo;s 储液 2：与其他成分混合后，取 100 mL 该储液加入量筒中，用去离子水定容至 1 L。用 5% CO2 调节 pH 至 7.4。&lt;br/&gt; 与马林格液混合&amp;rsquo;s Stock 1 以制备完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>Thermo Fisher</td><td>S637-212</td><td>马用林格液成分&amp;rsquo;s Stock 2：与其他成分混合后，取100 mL该储备液加入量筒中，用去离子水定容至1 L。用5% CO2调节pH至7.4。&lt;br/&gt; 与马林格氏液混合&amp;rsquo;s Stock 1 以配制完全培养基 &amp;ldquo;林格氏液&amp;rsquo;s 溶液&amp;rdquo;.</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>双子座</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td>0.5 mg/mL，溶于1×硼酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>Prism 软件</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠溶液</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td>7.5% 储备液</td></tr></tbody></table>

马肠神经胶质细胞培养及其在马腹痛神经炎症机制研究中的应用

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

马科动物绞痛（急性腹症）的术后炎症状态不仅会增加客户的治疗费用、导致患者不适并延长住院时间，而且在许多情况下可能危及生命。一类独特的肠道细胞——肠胶质细胞，其在感知胃肠道环境并与周围细胞类型进行通讯方面的作用正日益受到重视。肠胶质细胞与肠上皮细胞之间的相互作用，可能在揭示马肠胶质细胞如何在健康状态及绞痛状态下通过改变黏膜屏障来调节炎症反应方面具有关键意义。
为了研究这种相互作用，我们提出一种方法，即从马的空肠组织建立原代马肠胶质细胞培养物，并将这些培养物暴露于已知存在于绞痛中的炎症条件下。原代肠胶质细胞培养物来源于因与绞痛无关原因被实施安乐死的成年马。通过显微解剖分离肠绒毛和黏膜下层，以暴露黏膜下层组织。分离出的黏膜下层组织使用胶原酶、蛋白酶和牛血清白蛋白进行酶消化处理，持续2-3小时。随后，通过离心、移液和细胞筛（40-100 µm）进行机械消化，获得细胞沉淀，并将其以约400,000个细胞/300 µL培养基的浓度接种于经0.05 mg/mL多聚-L-赖氨酸包被的培养孔中。
在达到汇合状态并进行首次传代后，肠胶质细胞被暴露于马重组IL-1β（0、10、25 ng）中处理24小时。为模拟腹痛发生时的上皮-胶质细胞相互作用，将经对照或处理后的肠胶质细胞条件化培养基直接加入汇合的马空肠单层细胞中，同时使用双电极EndOhm室测量跨上皮电阻（TEER）。这些数据仅展示了马肠胶质细胞培养众多潜在重要应用中的一个实例。

对马空肠进行显微解剖，分离至黏膜下层（图1），再结合酶消化与机械消化，可成功获得具有活性的马肠胶质细胞培养物。这些细胞表现出多形性，其中以梭形细胞为主，形态特征与其他物种的肠胶质细胞一致（图2A）。免疫染色显示，培养细胞表达特异性胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP），且成纤维细胞污染较少（α-SMA，图2B）。但在某些情况下，黏膜下层的显微解剖操作控制不够精确，导致培养物中成纤维细胞比例较高，通过成纤维细胞标志物平滑肌肌动蛋白的免疫荧光染色可观察到这一污染现象（图3）。
接下来，以马肠胶质细胞培养的应用价值为例，评估了经IL-1β处理的肠胶质细胞对肠道上皮屏障功能的影响。将肠上皮细胞基底侧暴露于马肠黏膜下层肠胶质细胞培养液（该培养液经10 ng和25 ng IL-1β处理24小时）后，上皮通透性显著增加（p值分别为0.05和0.04；对照组培养液均值为0.9，胶质细胞+10 ng IL-1β组均值为0.8，95%置信区间为-0.2至0.02，胶质细胞+25 ng IL-1β组均值为0.8，95%置信区间为-0.1995至0.01060，n = 3–4）（图4A）。然而，将马源上皮单层细胞暴露于基底外侧的10–25 ng马源IL-6（一种炎性细胞因子）时，该细胞因子已被证实可由暴露于IL-1β的肠胶质细胞产生，并可在啮齿类动物模型中诱导肠上皮细胞通透性增加12，未显著增加马肠上皮单层细胞的通透性（图4B)
<img alt="组织解剖过程；显微镜图像分析；装置包括培养皿、镊子和组织。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过显微解剖及酶消化与机械消化法从马空肠中分离肠胶质细胞。（A）沿对系膜缘切开空肠，并将黏膜面朝上固定。（B）在显微镜下观察肠绒毛，并通过轻柔刮除将其去除，直至观察到纤细的固有层。（C）继续去除固有层，直至透过半透明的黏膜下层刚好可见平滑肌纤维。（D）将黏膜下层提起并从肌层剥离，必要时切断纤维状组织残留。图像由10倍解剖显微镜拍摄（B,C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞显微镜分析；相差显微镜、免疫荧光；DAPI染色细胞核、GFAP、平滑肌肌动蛋白。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：马肠黏膜下层肠胶质细胞培养物的成像。（A）通过相差显微镜观察到马肠胶质细胞的星形（箭头）、梭形（空心箭头）和神经节样（实心箭头）形态。（B）通过GFAP染色以及成纤维细胞标志物平滑肌肌动蛋白染色评估培养物纯度。比例尺 = 100 µm（A），400 µm（B）。缩写：GFAP = 胶质纤维酸性蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞培养物中蛋白质表达和分子标志物的荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：马肠黏膜下层肠胶质细胞培养失败的成像结果。 通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP，红色）和成纤维细胞标志物平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，绿色）染色评估培养物纯度，结果显示存在大量成纤维细胞污染。黄色箭头指示GFAP，白色箭头指示平滑肌肌动蛋白。比例尺 = 400 mm。缩写：GFAP = 胶质纤维酸性蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示随时间变化的倍数变化；IL-1β/IL6对培养基的影响；生物学反应分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67244/67244fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：马肠上皮单层细胞在暴露于炎症性细胞因子及炎症性胶质细胞产物后的TEER变化。（A）基底外侧暴露于经10 ng和25 ng IL-1β处理24小时的马肠黏膜下层肠胶质细胞培养上清液后，上皮通透性显著增加（*p = 0.05 和 0.04，分别，n = 3-4）。（B）马肠上皮细胞单层急性暴露于基底外侧25 ng IL-1β以及10–25 ng 马IL-6，未显著增加马上皮单层细胞的通透性（n = 2–4）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：分离与培养用试剂。 以下试剂用于配制马源肠胶质细胞分离、肠胶质细胞培养以及马源肠道上皮干细胞培养的培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67244/67244_Table%201_rev.xlsx" target="_blank">请点击此处下载本表。</a>

肠胶质细胞在肠道稳态及疾病过程（包括术后并发症）中的作用正日益受到重视。接受急诊探查性剖腹手术后恢复的马匹患者面临较高的炎症性术后并发症风险，这凸显了建立可重复的马源性肠胶质原代细胞培养体系以供研究的重要性。

马科动物绞痛（急性腹症）的术后炎症状态不仅会增加客户费用和患畜不适，还会导致……

马匹在结肠手术后常面临严重的炎症性术后并发症。在人类医学研究中，肠胶质细胞因其对肠道环境的关键感知作用以及对炎症的调控影响而日益受到关注。本研究旨在从马的小肠中分离肠胶质细胞，以评估其在理解与预防术后并发症中的作用。我们已建立了一种可重复的实验方案，用于从马肠组织中分离黏膜下层的肠胶质细胞。我们还成功展示了其在研究炎症性肠胶质细胞对肠道屏障功能影响方面的应用，这可能对未来腹痛、术后并发症及肠道疾病的研究具有重要意义。本实验室将继续聚焦肠胶质细胞在炎症性肠道环境中的作用关系，以及抗炎生物制剂如何通过防止屏障功能丧失来预防术后并发症。首先，用包被液对24孔板进行包被，并在37摄氏度下孵育2小时，或在室温下过夜孵育。用无菌水将培养板洗涤两次，并在室温下保存，直至细胞准备好进行铺板。现在，取一段马的空肠，将其置于冰上的冷林格液中。从空肠上取下一段10厘米长的组织，在对系膜缘切开，使非淋巴区域位于中央。然后将组织修剪成约七乘七厘米的片状，并在解剖前用新鲜的任氏液充分冲洗。现在，将组织黏膜面朝上置于盛有冷任氏液或PBS的硅胶弹性体涂层培养皿中，并用大头针固定，尽可能将其拉伸。使用弯头镊子去除肠绒毛，然后从约五乘五厘米的非淋巴区域去除黏膜下层。接下来，使用显微解剖剪从一角开始，将黏膜下层完整剥离并取出。在剥离黏膜下层与内环行肌层时，观察其自然分离的现象。然后将收集的黏膜下层组织剪切成2至5毫米大小的片段。将它们放入含有5毫升不含FBS、胶原酶、蛋白酶和BSA的Organo的50毫升锥形管中。在37摄氏度下孵育组织2至3小时，以进行酶消化。孵育后，加入10毫升室温下含FBS的Organo以终止酶反应。使用10毫升血清移液管将组织混合物上下吹打15次，以使细胞从组织中解离。然后在室温下以3,000 G离心3分钟。随后弃去上清液，并用10毫升室温的PBS重悬沉淀，使用10毫升血清移液管将溶液上下吹打15次。将锥形管在室温下以 3,000 G 离心三分钟。弃去上清液后，加入 10 毫升室温含 FBS 的 Organo 溶液，通过上下吹打 15 次重悬沉淀。接着，依次通过孔径为 100 微米、70 微米和 40 微米的细胞滤筛过滤细胞。离心细胞并弃去上清液后，用1毫升含FBS的Organo重悬细胞沉淀。然后用台盼蓝染色以鉴别活细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。随后，将约400,000个细胞接种于24孔板的每个孔中，每孔体积为300微升含FBS的Organo。向每个孔中加入 5 µL N2、5 µL G5 和 10 µL B27。将培养板置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中，以促进细胞贴壁。当第一代细胞达到 70% 至 80% 汇合度时，分别用 0、10 和 25 纳克的白细胞介素-1β 处理各孔 24 小时。在培养物中观察到呈梭形的细胞，其形态与肠胶质细胞一致，具有多形性，且其他细胞类型的污染极少。首先，用42微升0.05% Matrigel包被Transwell小室。在37摄氏度下孵育1小时，使Matrigel凝固。吸去多余培养基，将Transwell小室敞口干燥30分钟。随后向每个插入物中加入200微升DMEM/F12培养基，于37摄氏度保存备用。用PBS洗涤含有类器官的Matrigel凝胶块。将细胞置于冰上，加入 500 µL 细胞回收液，反复吹打混匀，确保将细胞完全收集至 15 mL 离心管中。随后在 4 °C 条件下以 300 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于目标体积的肠道上皮干细胞（IESC）培养基中。现在，用 IESC 培养基预润一毫升注射器。用16号针头吸取细胞悬液。然后将16号针头更换为28号针头，并推出悬液，以促进类器官的分离。接下来，将200 µL上述细胞悬液加入经包被的Transwell小室的顶端。在基底侧加入500 µL IESC培养基和生长因子。使用双电极TEER测量装置定量单层细胞的TEER值。向培养杯中加入 1.5 毫升 IESC 培养基，并确保 Transwell 小室中恰好含有 200 微升培养基，以便在测量期间保持液面水平一致。将 Transwell 小室的基底侧暴露于白细胞介素-1β 的炎性细胞因子或经白细胞介素-1β 处理的培养物所释放的胶质细胞产物中。通过将每个 Transwell 放入培养杯中，每隔 10 至 15 分钟测量一次 TEER，持续 45 分钟。基底外侧暴露于经10和25纳克白细胞介素-1β处理的胶质细胞培养上清液，可显著增加上皮屏障通透性。在不同浓度马白细胞介素-6处理后，未观察到上皮通透性显著增加。

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