Name: iPSC 衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养，以模拟肺部健康和疾病中的气道屏障完整性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞衍生上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞构建气道屏障模型的方法。该模型可在气液界面培养中研究气道重塑与环境毒素反应机制。

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本研究由 CIRM（DISC2COVID19-12022）资助。

Airway Model for Studying Lung Barrier Integrity, Disease, and Drug Discovery

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).</li>
<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
<li>Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+airway+blood+vessels+and+lymphatics%3A+Lessons+from+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation.</a> Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).</li>
<li>Parker, D., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the respiratory epithelium.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).</li>
<li>Davis, J. D., Wypych, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+functional+heterogeneity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium.</a> Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).</li>
<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
<li>Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+organoid+and+air-liquid+interface+models+as+a+screening+method+in+the+development+of+new+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).</li>
<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long-term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), e71098(2013).</li>
<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
<li>Ardini-Poleske, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungmap%3A+The+molecular+atlas+of+lung+development+program%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lungmap: The molecular atlas of lung development program.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).</li>
<li>Ronaghan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1-like%2C+but+not+m0-+or+m2-like%2C+macrophages%2C+reduce+RSV+infection+of+primary+bronchial+epithelial+cells+in+a+media-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion.</a> PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在大气道中建立和实施用于研究病毒感染及其他毒素的血液-空气屏障模型，需要细致入微的操作，以确保所涉及的各种细胞类型能够成功分化并发挥正常功能。本文将探讨实现成功分化的关键因素、可能面临的挑战、其他潜在应用以及在人类疾病研究中的意义。
为了确保成功分化，需注意细胞培养小室的类型和孔径大小。应使用较大的孔径，以确保通过细胞外基质（ECM）各层实现细胞间的相互通讯。确保诱导性多能干细胞（iPSC）系的最佳接种密度至关重要。适当的密度有助于实现均匀分化，并防止形成不希望的细胞团块，从而获得更均一且具有功能性的上皮层。为了维持健康且具有功能的上皮层，在添加任何化合物、毒素或病毒之前，清洗顶端表面非常重要。这有助于去除积聚的黏液、死亡细胞及其他碎片，从而促进稳定且可存活的培养环境，并使化合物能够有效接触上皮细胞。
对于内皮组分，必须确保细胞经过适当分选且具有均一性。可通过FACS等技术实现，以确保仅使用所需的目的内皮细胞，从而维持实验的一致性和细胞功能。
对于巨噬细胞组分，尽管巨噬细胞易于黏附于塑料表面，但其对上皮细胞顶侧的黏附能力较弱。增加巨噬细胞数量可能有助于确保iAirway系统中存在足够数量的巨噬细胞。黏附状态的巨噬细胞更有利于与病原体及其他免疫细胞相互作用，从而增强该模型的相关性。若研究重点为内皮免疫信号通路，可将巨噬细胞接种至细胞培养小室的基底侧培养基中，以模拟循环单核细胞群体22。
iAirway 模型还具有其他若干重要应用，包括研究气道的肺发育过程。该模型可用于研究肺发育中涉及的不同细胞群体之间的多细胞信号传导等复杂过程，从而为正常和病理状态提供深入见解。为了研究肺泡发育及疾病，可用远端肺类器官（DLOs）替代气道类器官23,24。这使得研究人员能够研究远端肺组织，包括肺泡的发育与功能。该方法在生成和研究肺泡巨噬细胞方面尤为有用，因为肺泡巨噬细胞在肺部免疫中发挥关键作用。
建立大呼吸道气-血屏障的可靠且可重复的模型面临多项挑战。肺前体细胞必须表达超过50%的NKX2-1，才能成功实现分化。如果未达到该产量，气液界面（ALI）培养物中可能含有更多的间充质细胞，或被非肺来源的上皮细胞污染。在接种内皮细胞时维持无菌环境是一项重大挑战，因为这些细胞培养在细胞培养小室的基底外侧。这导致培养板盖无法完全封闭无菌环境，因此在接种内皮细胞时必须使用其他培养板。污染物可能破坏培养体系并损害模型的完整性。大多数ALI培养需至少孵育3周，以生成包括纤毛细胞在内的大部分气道细胞。大多数方案接种的是基底细胞，因此需要足够时间让信号通路诱导其他气道细胞的分化。本方案则采用解离的气道类器官，其中已包含多种气道细胞类型，尽管其数量较成熟的原代人支气管上皮细胞（HBEC）来源的ALI培养物更低。目前观察到的纤毛细胞数量较少，同时存在上皮和间充质细胞类型（图2D）。为增加纤毛细胞数量，可在气道类器官培养或ALI培养基中添加DAPT25。该平台目前仅检测了气-液界面建立后短期内顶侧和基底外侧细胞的存活情况，此时基底外侧培养基已更换为1:1的上皮与内皮培养基混合液。未来还需进一步研究数周时间范围内细胞的存活能力，这可能有助于提升ALI培养体系中细胞的复杂性。
血液-空气屏障模型对研究人类疾病和开发治疗干预措施具有深远意义。该模型可通过提供模拟人类气道的生理相关环境（尤其是使气道细胞暴露于空气中的条件），用于筛选和优化治疗药物，包括抗病毒药物。可采用基因敲除技术研究屏障功能障碍和宿主-病原体相互作用的特定机制。该模型为研究人类呼吸系统疾病的多个方面提供了平台，从病毒感染到哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等慢性疾病。这些理解有助于开发更有效且具有靶向性的治疗方法。
综上所述，大气道（iAirway）的血-气屏障模型是研究病毒感染及其他呼吸系统疾病所致屏障功能障碍的有力工具。确保细胞类型的成功分化、应对发育过程中的挑战以及探索替代性应用，将有助于提升该模型的实用性和准确性。该模型在治疗靶点研究和基因敲除研究中的应用，凸显了其在推动人类呼吸系统疾病机制理解与治疗发展方面的潜力。

大气道中的气血屏障包括气管、支气管和细支气管。它在维持呼吸系统健康方面发挥着关键作用，由气道上皮、基底膜、血管和内皮细胞以及免疫细胞组成。气道中的主要上皮细胞包括基底细胞、club细胞、纤毛细胞和杯状细胞。基底细胞作为气道上皮的干细胞，是具有高度增殖和自我更新能力的多能前体细胞，可分化为成熟的气道上皮细胞1。club细胞为非纤毛的分泌性细胞，通过分泌保护性蛋白和表面活性物质，参与维持气道内衬的稳定2。杯状细胞位于管腔及黏膜下腺体中，可分泌黏蛋白以捕获异物，保护气道3。纤毛细胞是黏液纤毛清除系统的重要组成部分，可防止有害微生物的积聚4。基底膜由细胞外基质构成，为组织提供结构支持5。气管及其余气道周围分布着丰富的血管网络，其内壁由内皮细胞构成，这些细胞通过提供营养和氧气、清除代谢废物、调节炎症反应以及参与组织修复和血管生成，在维持气管功能中发挥重要作用6。最后，气道巨噬细胞是组织特异性的免疫细胞，对于防御感染、清除吸入颗粒物以及维持免疫反应的平衡至关重要7。
上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的协同作用对于呼吸道抵御病原体的有效免疫反应至关重要8。上皮细胞通过形成物理屏障构成抗病毒感染的第一道防线，其紧密连接可限制有害物质的通过。纤毛细胞与杯状细胞的协同作用有助于捕获并清除吸入的颗粒物、病原体及碎片4。此外，呼吸道上皮细胞还能分泌细胞因子和趋化因子，以招募免疫细胞9。内皮细胞维持血管完整性，防止病毒颗粒通过血液扩散，同时上调黏附分子（VCAM-1）以促进免疫细胞黏附，并产生促炎性细胞因子，将免疫细胞从血液募集至感染部位10。呼吸道巨噬细胞可吞噬并降解病毒颗粒、受感染的细胞及碎片，将病毒抗原呈递给T细胞，并分泌细胞因子以激活和招募其他免疫细胞，同时产生I型干扰素以抑制病毒复制11。上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的协同作用构建了一个强大而动态的防御系统，可保护呼吸道免受病毒感染，并维持呼吸系统健康。
了解人类肺部中各种细胞类型之间的动态相互作用，对于理解肺部对病毒感染、炎症性疾病和药物递送的反应至关重要。体外共培养系统可用于研究上皮细胞、内皮细胞和先天免疫细胞之间的细胞间信号传导12。我们开发了首个来源于患者特异性hiPSCs的真实多细胞类型肺模型13，该模型包含上皮和间充质细胞群体，并以三维结构形成。随后，肺前体细胞可进一步分化为&#34;气道类器官&#34;14，接种于无菌细胞培养小室上，并暴露于气液界面（ALI）条件下，以模拟人体气道的生理环境15,16,17。来源于iPSC的内皮细胞培养在膜的基底侧，模拟其在人体气道中的定位，即位于基底膜中上皮/间充质层下方。最后，将来源于iPSC的巨噬细胞添加至膜的顶端侧，使其与上皮细胞相互作用并等待激活信号（图1A）。该模型能够准确再现气道的生物学特性与功能。我们认为，来源于hiPSC的、患者特异性的、真实多细胞类型的iAirway培养体系最适合用于阐明气道屏障对病原体（包括病毒感染）所产生固有急性反应的机制。例如，该模型可用于：（1）研究病毒的进入与复制过程；（2）探究上皮细胞和组织特异性免疫细胞引发的初始免疫反应；（3）评估屏障的完整性与功能；（4）测试治疗药物的有效性；以及（5）在患者特异性模型中研究发病过程中的细胞与分子机制。
本文介绍了一种制备多细胞肺共培养体系的详细方案，用于研究细胞对病毒感染的响应。

<table><tbody><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12 孔插件，0.4 &amp;micro;m，透明&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Tech</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>激活素 A</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>全反式维甲酸（RA）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>不含维甲酸的 B27&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>314-BP/CF</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）V 级，7.5% 溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD14（FITC）</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD31 PECAM-1（APC）</td><td>R&amp;amp;D System</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD45（PE）</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD68（PE）</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&amp;nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD324（APC）</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 培养基</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD326（APC）</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>Fisher</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F12&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s 改良杜尔贝科&amp;rsquo;s 培养基（IMDM）+ Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（KSR）</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>单硫代甘油&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus 试剂盒（每箱 10 个）</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Stem Cell Tech</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 培养基</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>波形蛋白</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632（ROCK 抑制剂）&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

利用ipsc衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

人体肺组织由从鼻咽部上呼吸道到最小肺泡囊的上皮、间充质、内皮以及免疫细胞相互连接而成的网络构成。这些细胞之间的相互作用在肺的发育与疾病过程中至关重要，可作为抵御有害化学物质和病原体的屏障。目前 体外 共培养模型通常使用具有不同生物学背景的永生化细胞系，可能无法准确代表肺部的细胞微环境或细胞间相互作用。我们将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为包含上皮和间充质成分的三维肺类器官、内皮细胞以及巨噬细胞，并在气液界面（ALI）条件下进行共培养，构建出顶端由巨噬细胞包绕的上皮/间充质屏障和基底侧内皮屏障结构（iAirway）。源自iPSC的iAirway模型在受到呼吸道病毒或香烟毒素感染时，表现出屏障完整性的下降。该多谱系肺共培养系统为研究肺发育、稳态维持及疾病进展过程中的细胞互作、信号通路和分子机制提供了平台。iAirway能够高度模拟人体生理状态和细胞相互作用，可由患者来源的iPSCs生成，并可根据需要定制包含气道中不同类型的细胞。总体而言，源自iPSC的iAirway模型为研究屏障完整性提供了灵活而强大的工具，有助于深入理解疾病相关遗传驱动因素、病原体反应、免疫调控以及药物发现或老药新用 体外，有望推动我们对气道疾病的理解与治疗。

在诱导多能干细胞来源的气道类器官、内皮细胞、免疫细胞及共培养体系的分化过程中，存在多个可评估其是否成功完成的阶段。该分化方案可在不同的诱导多能干细胞系中进行，且本方案已在至少五个不同的细胞系中经过验证。然而，该方案需针对每一个新的诱导多能干细胞系进行适当调整，特别是通过修改和优化接种密度来实现。
iPSC来源的气道类器官成功获得的产量可进行评估 通过 明场下观察，应具备四个特征：边界清晰、呈半透明/囊状形态、具有增殖/扩展能力，以及无坏死细胞。在培养2周过程中体积不增大、形态模糊或出现坏死的气道类器官，不应用于共培养实验。外周存在厚壁腔层的类器官 与透明/囊状类器官仍可用于后续实验。然而，透明/囊状气道类器官主要由基底细胞组成，而厚壁双层膜类器官则主要由克拉拉细胞（club cells）组成。由于基底细胞易于增殖和扩增，因此更适合气液交界面培养和极化。其他评估iPSC来源肺类器官成功产出的方法还包括在肺前体细胞阶段（分化第16天）通过流式细胞术分析表面标志物CPM表1），成功的分化产出率 &gt;50% CPM+ 细胞
在进行气道类器官解离和气液界面培养时，需确保所有细胞外基质（ECM）聚合物已被完全去除，否则将阻碍细胞在膜上的扩展。在培养第3天进行气液界面培养前，细胞应已达到汇合状态。可通过染色特异性细胞标志物来确认iAirways中的细胞类型：基底细胞（p63+）、club细胞（SCGB1A1+）、杯状细胞（MUC5AC+）和纤毛细胞（AcTub+）。特征性肺部细胞类型的标志性标志物已在LungMAP21中得到验证。间充质成分可通过波形蛋白（vimentin）或平滑肌肌动蛋白抗体检测。若需获得更多纤毛细胞，可延长气液界面培养时间或添加DAPT。
iPSC 分化所得内皮细胞的成功率可通过以下方式评估 通过 明场，显示铺路石样形态（iPSC来源的内皮细胞分化的第6天）。成功的iPSC来源内皮细胞培养应包含 &gt;50% 的 CD31+ 细胞，并应获得足够数量的细胞，以确保分选后细胞产量超过 500,000 个。细胞可进行传代或冻存，且应检测 CD31 标记物 通过 每次传代或建立新培养物时均应进行流式检测。细胞传代不应超过P4代。作为参考，请参见iPSC来源的内皮细胞在CD31分选前后的状态（图1C内皮细胞呈扁平状，具有较大的细胞体，形态呈细长的纺锤形。
对于巨噬细胞分化，拟胚体应保持在超低吸附孔板（ULA）孔底，每孔仅含一个拟胚体。在分化第5至7天应出现囊性改变。若离心后未能形成拟胚体，则可将诱导多能干细胞（iPSCs）直接接种至96孔超低吸附板中，不进行离心。必要时可增加iPSCs的接种数量。iPSC来源免疫细胞的成功获得完全依赖于拟胚体（EBs）能否在分化第7天发育为囊状结构。未能形成囊状结构的iPSC来源免疫拟胚体在接种至明胶包被培养板后不会形成基质，也无法产生髓系前体细胞。转移至明胶包被培养板后，拟胚体应牢固贴附于板底。操作培养板时应小心谨慎，避免扰动或脱落拟胚体。培养基应每周手动更换两次，悬浮细胞应传代至Mac-CM2培养基中或进行冻存。此外，在收获悬浮的髓系前体细胞后，这些细胞应能贴附于未包被的塑料培养瓶表面，并在明场显微镜下呈现具有空泡的明亮细胞形态，提示其为巨噬细胞。单核细胞标志物CD14+应为 &gt;悬浮细胞中占90%。巨噬细胞标志物CD68应随时间增加，培养2周后约有50%的巨噬细胞表达CD68+（图1D）。每种细胞系都应测定其黏附效率。我们的平均黏附效率为20%。对于极化处理，将M0巨噬细胞在添加不同刺激因子的分化培养基II中极化为M1型（iPSC-M1）或M2型（iPSC-M2）巨噬细胞，持续48小时：M1极化使用100 ng/mL LPS和20 ng/mL IFN-γ，M2极化使用50 ng/mL IL-4和20 ng/mL IL-13。M1极化的标志物为CD80+，M2极化的标志物为CD206+。
三重共培养成功建立的评估方法 通过 上皮紧密连接标志物EPCAM、ECAD或ZO-1，或内皮紧密连接标志物CD31的免疫荧光图 2C, 表1）。三重共培养的功能性也可进行评估 通过 跨上皮/内皮电阻（trans-epithelial/endothelial electrical resistance, TEER）。结构良好的气道类器官与内皮细胞共培养体系具有较高的电阻力，表明细胞间通讯和连接处于最佳状态。环境损伤因素（如电子烟暴露或病毒感染）会破坏上皮和内皮屏障的完整性，导致共培养体系的电阻力降低。图3A，B）以及结构紊乱的紧密连接（图3C).
<img alt="iPSC 分化示意图，包含三重共培养体系；显微镜、流式细胞术 E-CAD、CD31 数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：iPSC 来源的气道上皮、内皮及免疫细胞培养物的分化与表征。（A）iPSC 定向分化构建 iAirway 的示意图。（B）iPSC 来源的气道上皮类器官，通过明场（左）和流式细胞术分析（右）检测 EPCAM 和 ECAD 进行表征。（C）iPSC 来源的气道内皮细胞，通过明场（左）、免疫荧光及流式细胞术分析（右）检测 CD31 进行表征。右侧显示 CD31 分选后的相应明场图像。（D）iPSC 来源的巨噬细胞，通过明场（左）和流式细胞术分析（右）检测泛造血标记物 CD45、单核细胞标记物 CD14 及巨噬细胞标记物 CD68 进行表征。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="三重培养细胞实验示意图，显示上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：iPSC 分化来源的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的共培养。（A）iAirway 构建的示意图。（B）分别显示上皮细胞和内皮细胞单培养、上皮-内皮双培养，以及上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞三重共培养的明场图像。巨噬细胞用红色细胞追踪染料标记。比例尺：100 µm。（C）细胞培养小室顶端侧紧密连接标志物 ZO-1 和基底外侧 CD31 的免疫荧光染色。比例尺：100 µm。（D）细胞培养小室的横截面图，顶端侧接种解离的气道类器官，气液界面培养 1 周后。左侧面板为 H&amp;E 染色，黑色箭头指示纤毛细胞。中间面板为免疫荧光成像，显示上皮标志物 E-钙黏蛋白（ECAD）。右侧面板为免疫荧光成像，显示间充质标志物，如波形蛋白（VIM）和平滑肌肌动蛋白（SMA）。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子烟和病毒暴露后气道屏障功能变化的上皮-内皮共培养TEER图、ZO-1、DAPI、ECAD分析的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：电子烟和病毒暴露后iAirways气道屏障功能的变化。（A）跨上皮/内皮电阻（TEER）测量装置示意图。（B）在培养基中添加薄荷味电子烟7天后的TEER柱状图。数据表示为均值 ± 95% 置信区间。N = 5个生物学重复，3个技术重复；p值 &lt;0.001。（C）SARS-CoV-2感染前后紧密连接蛋白ZO-1的免疫荧光染色。注意感染后ZO-1排列紊乱。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>应用</td>
			<td>稀释比例</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 31 PECAM-1(APC)</td>
			<td>流式细胞术 (FC)</td>
			<td>10 μl 加入 100 μl 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPCAM/CD 326 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-CAD/CD 324 (APC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl 加入 100 μl 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPM</td>
			<td>FC</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 45 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl 加入 100 μl 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 14 (FITC)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl 加入 100 μl 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD 68 (PE)</td>
			<td>FC</td>
			<td>5 μl 加入 100 μl 缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO-1</td>
			<td>免疫荧光 (IF)</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin</td>
			<td>IF</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>IF</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：流式细胞术和免疫荧光中使用的抗体。
补充文件 1：培养基和缓冲液的组成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在气液界面培养系统中构建包含诱导性多能干细胞（iPSC）来源的肺上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和巨噬细胞的复杂多细胞气道屏障模型的方法。

利用iPSC衍生的上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞和免疫细胞共培养模拟肺部健康与疾病状态下的气道屏障完整性

人体肺组织由上呼吸道的上皮、间充质、内皮以及免疫细胞相互连接形成的网络构成。

我的研究重点是了解人类气道重塑。人类气道作为一道屏障，可抵御包括病毒、空气污染和烟草烟雾在内的环境毒素。这些毒素可能损伤气道，导致其发生改变或重塑，从而引起呼吸困难。该模型系统不仅包含形成屏障的上皮细胞，还包括在气道稳态中起重要作用的其他细胞，如血管细胞和称为巨噬细胞的免疫细胞。目前的实验挑战包括在体外模型系统中模拟人类肺组织。获取原代肺组织样本十分困难，且这些样本的培养也非常困难。因此，使用由干细胞衍生的肺气道细胞，并结合内皮细胞和巨噬细胞，是克服这些挑战的下一步。首先，用浓度为4毫克/毫升的细胞外基质溶液（ECM）包被孔径为3微米的聚酯细胞培养小室的顶端表面。用移液器吸除残留的ECM溶液。然后将培养板置于37摄氏度的培养箱中孵育1小时。使用洁净的镊子，将细胞培养小室从12孔板中无菌转移至一个大培养皿中。接着，用ECM溶液包被细胞培养小室的基底外侧表面。吸除残留的ECM溶液后，将培养皿置于37摄氏度培养箱中过夜干燥。用PBS洗涤含有iPSC来源内皮细胞的T75培养瓶。吸去溶液后，向培养瓶中加入5毫升类胰蛋白酶消化液，在37摄氏度孵育8分钟。轻敲培养瓶，确保内皮细胞脱落。然后将细胞转移至15毫升锥形管中。加入5毫升终止培养基以终止消化反应。随后，以 300 G 离心 5 分钟。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于 1 毫升含有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的内皮细胞培养基中。取 150,000 个细胞分装后，重悬于 100 微升培养基中，并用移液器将其接种至倒置的细胞培养小室上，确保基底侧朝上。小心地将细胞转移至培养箱中，并静置 3 小时，期间不要扰动。接着，在 12 孔板的每个孔中加入 1 毫升内皮细胞培养基。从培养箱中取出盛有内皮细胞的培养皿。使用洁净的镊子，小心地将细胞培养小室转移至含有内皮细胞培养基的培养板中。在显微镜下确认内皮细胞已贴壁后，将培养板置于37摄氏度培养箱中过夜培养。在从ECM聚合物中分离类器官并用胰蛋白酶消化15-20分钟后，加入3毫升终止培养基以终止蛋白酶反应。使用 P1000 移液器重悬溶液，并在 400 G 条件下离心 5 分钟。随后，吸除气道类器官的上清液，将类器官重悬于 1 毫升含 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的气道扩增培养基中。取 10 微升样品进行血细胞计数板细胞计数，并在计数期间将剩余细胞置于冰上。接下来，将300,000个iPSC来源的气道细胞接种于每片12毫米细胞培养小室中，每孔加入500微升气道扩增培养基。从37摄氏度培养箱中取出含有内皮细胞的细胞培养小室板。重悬iPSC气道细胞，用移液器将含有300,000个细胞的500微升细胞悬液加入每个细胞培养小室的顶室中。将培养板置于37摄氏度培养箱中培养48小时，保持顶端细胞处于液-液界面条件。培养结束后，移除细胞培养插件顶端侧的培养基。将基底外侧培养基更换为气道分化培养基与内皮细胞培养基按1:1比例混合的培养基。将培养板放回培养箱。使用细胞刮从培养瓶中分离iPSC来源的巨噬细胞。以300 G离心5分钟。随后，吸除上清液。将iPSC巨噬细胞重悬于1毫升MAC-CM2培养基中。取10微升样品进行细胞计数，其余细胞在计数期间置于冰上。计数后，将300,000个巨噬细胞转移至1.5毫升微量离心管中。以200 ×g离心5分钟。离心后，用移液器吸出管中的上清液。从培养箱中取出含有内皮细胞和气道细胞共培养的插入式培养小室。将300,000个巨噬细胞悬浮于35微升MAC-CM2培养基中，接种至细胞培养插入小室的顶端侧。

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