利用器官培养的猪角膜和上皮伤口愈合评估治疗和化学毒性
2025年1月10日
猪角膜 离体 器官培养与上皮伤口愈合为检测化学物质的眼部毒性提供了经济、符合伦理、可重复且可定量的方法。同时，该方法有助于阐明上皮化及组织修复调控机制，并可用于评估治疗糖尿病性角膜病变及延迟性伤口愈合的治疗方法。
我们正在研究糖尿病伤口愈合过程中角膜的固有免疫。具体而言，我们的目标是理解为何糖尿病患者更容易受到细菌感染，以及高血糖导致伤口愈合延迟的原因。我们发现，IL-1β 与 IL-1 受体拮抗剂之间，以及 TGF-β1 与 TGF-β3 之间的平衡对角膜伤口愈合具有重要作用。
这可能为糖尿病性角膜病变提供新的治疗方法。我们的模型模拟了糖尿病患者中人类伤口愈合延迟的情况，使我们能够研究细胞程序性死亡通路并开发靶向治疗策略。
首先，取置于1升烧杯中的猪眼。用镊子夹住眼球，在无菌培养皿中用剪刀去除眼外组织。进行上皮损伤时，使用无菌无尘纸巾固定眼球，并用6毫米角膜环钻标记角膜中心位置。
然后，使用小型解剖刀或尖角钝化的软质剃须刀片，轻轻刮除角膜环钻标记圈内的上皮细胞。清除所有细胞碎片，同时确保基底膜保持完整。随后，用棉签清洁伤口区域。
使用手术刀和剪刀沿角膜巩膜缘切开眼球进行解剖。然后，将角膜放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌500毫升烧杯中冲洗。接着，将切除的角膜倒置放入无菌模具中。
用含有1%琼脂糖（保持在48摄氏度）的最低必需培养基（MEM）填充角膜内皮腔。然后将角膜倒置并转移至35毫米培养皿中。以滴加方式在中央角膜表面加入2毫升MEM，可含或不含待测试剂，确保覆盖角膜缘结膜区域，同时使上皮暴露于空气中。
然后，将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的湿化培养箱中。在损伤后40小时，用Richardson染色液对受损的培养角膜进行染色。染色后，在拍照前用PBS洗涤角膜。
然后，使用相同尺寸的环钻标记原始伤口，并用小型手术刀刮取标记圈内的上皮细胞。收集刮下的细胞并转移至预冷的离心管中。
与使用溴芬酸 0.09% 和酮咯酸 0.45% 处理的角膜相比，使用奈帕芬酸 0.1% 处理的角膜剩余伤口面积显著更大。在高葡萄糖条件下，用 LL-37 在 0.2 和 0.5 微克/毫升浓度下处理的角膜与未处理的角膜相比，伤口愈合显著加快。
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概述
本研究探讨糖尿病伤口愈合过程中角膜的先天免疫，重点关注糖尿病患者对细菌感染的易感性及愈合延迟的问题。该研究鉴定了可能为糖尿病性角膜病变提供新疗法依据的关键分子平衡机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 免疫学
背景
- 糖尿病患者会出现伤口愈合延迟。
- 这些患者的感染易感性增加。
- 了解其潜在机制对于开发治疗方法至关重要。
- 角膜伤口愈合是重要的研究领域。
研究目的
- 研究糖尿病条件下角膜伤口愈合的机制。
- 探讨特定细胞因子在愈合过程中的作用。
- 开发针对糖尿病性角膜病变的靶向治疗策略。
使用的方法
- 猪角膜的离体器官培养。
- 细胞因子平衡分析，包括 IL-1β 和 TGF-β。
- 人类延迟伤口愈合的建模。
- 程序性细胞死亡通路的研究。
主要结果
- 明确了IL-1β与IL-1受体拮抗剂之间的关键平衡作用。
- 强调了TGF-β1与TGF-β3在组织修复过程中的重要性。
- 建立了一种模拟人类糖尿病伤口愈合的模型。
- 针对所发现的信号通路，具有开发新疗法的潜力。
结论
- 了解细胞因子相互作用对于改善糖尿病伤口愈合至关重要。
- 研究结果可能为糖尿病性角膜病变带来创新疗法。
- 离体模型为测试眼部毒性和治疗手段提供了可重复的平台。
常见问题
执行层面的行业相关性
器官培养的猪角膜为评估眼部毒性和治疗性伤口愈合提供了一个具有转化相关性的体外平台，能够高度模拟人角膜的生理特性。该系统有助于对候选药物进行作用机制层面的风险评估，并提升早期眼科药物研发中预测结果的可信度。该模型通过定量的伤口愈合数据和分子分析结果，为项目筛选及基于风险评估的推进决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在与疾病相关的角膜系统中验证治疗假设。
- 通过量化糖尿病和非糖尿病条件下的伤口愈合，支持作用机制的风险评估。
- 有助于对细胞因子通路等分子靶点进行功能验证。
- 为推进眼科药物候选物提供可预测的信心支持。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化、可重复的体外实验，用于评估化学物质的毒性和治疗效果。
- 生成定量的伤口闭合和通透性数据，用于化合物评价。
- 支持多种测试试剂间的实验可扩展性及平台重复使用。
- 可进行下游分子分析，包括免疫组织化学和定量PCR（qPCR）。
转化与临床前研究
- 与人类疾病机制一致，特别是糖尿病性角膜病变和伤口愈合延迟。
- 利用生理学相关模型，将发现结果转化为临床前验证。
- 支持识别和优先筛选用于眼科治疗的转化生物标志物。
- 通过提供早期的机制性见解，降低后期生物学风险。
流程与工作流整合
这种离体猪角膜模型可融入从发现到临床前研究的连续过程，支持眼用治疗药物的靶点验证和先导化合物的筛选。
- 发现生物学：通过量化伤口愈合和细胞因子通路效应，阐明治疗机制。
- 筛选：提供可重复的定量读数，用于评估毒性和疗效。
- 分析：实现分子和细胞水平的分析，以比较不同干预因素对愈合和炎症的影响。
- 转化研究：模拟与人类相关的疾病状态，支持生物标志物的匹配以及临床前研究的连续性。
- 企业级复用：提供可重复使用的平台，用于化合物的迭代测试和机制研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高眼科药物研发中预测的可信度，降低作用机制的不确定性。
- 操作价值：通过可扩展且可重复的标准化流程，统一毒性与疗效测试。
- 战略价值：为候选药物的推进或终止决策提供依据，通过降低早期候选药物的风险提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的眼科治疗项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备离体组织处理和角膜生物学方面的专业知识。
- 需要具备无菌培养设施及分子分析仪器的使用条件。
- 要求跨团队在伤口制备与测量方面实现标准化，以确保可重复性。
- 可适用于多种化学物质和治疗剂，但仅限于角膜应用。
- 依赖于新鲜猪角膜组织的可获得性以及稳定的培养条件。
