Name: 利用基因组编辑技术为功能性水稻设计育种 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解利用基因组编辑技术培育功能性水稻的完整流程，包括SBE2b基因编辑、表型分析及农艺性状评估。该方法为开发高产优质、抗逆性强的水稻新品种提供了有效途径。

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本工作获得了生物育种重大项目（2023ZD04074）的资助。

本研究在中国贝尔基因生物技术有限公司进行，遵循人类研究伦理委员会的指导原则。在参与研究之前，已向受试者详细说明研究方案，并获得其知情同意。
1. 设计sgRNA并构建载体（耗时5-7天）
注意：使用了双元载体来表达CRISPR/Cas-SF01系统21。sgRNA与潜在脱靶位点之间的错配核苷酸（nt）不得少于3个。sgRNA接头需要与编辑载体经Bsa I酶切后产生的黏性末端互补。软件的选择依据是该软件在水稻中报道的高效性和特异性14，以及其易用性和对研究团队的可及性。
<ol>
	<li>访问 NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以检索 Japonica 中的&#160;OsSBEIIb（LOC4329532）基因。在 SnapGene 软件中下载并访问参考基因组。</li>
	<li>分析 X134 品种 OsSBEIIb 基因外显子序列中的插入/缺失（InDel）和单核苷酸多态性（SNP），并与参考基因组进行比较。利用 NCBI Primer Blast22 设计位于外显子区域两侧的引物（补充表 1）。</li>
	<li>为通过 Sanger 测序验证 X134 中 OsSBEIIb 基因的外显子序列，按如下方式配制反应体系：10 µL 聚合酶混合缓冲液，加入 1 µL 正向引物、1 µL 反向引物、1 µL X134 组织的基因组 DNA 以及 7 µL 蒸馏水。PCR 程序设置如下：95 °C 预变性 3 min；然后进行 35 个循环：(95 °C 变性 20 s - 56 °C 退火 30 s - 72 °C 延伸 60 s)，最后 72 °C 延伸 5 min。</li>
	<li>根据 Tsakirpaloglou 等人14的方案，在 X134 的 OsSBEIIb 外显子序列上设计 sgRNA，并确保 PAM 序列为 TTN。</li>
	<li>对 sgRNA 序列进行修饰：在正向引物的 5' 端添加 -ACAC- 寡核苷酸，在反向引物的 5' 端添加 -GGCC- 寡核苷酸。将修饰后的正向/反向引物（用于 sgRNA）进行商业合成。</li>
	<li>将正向和反向引物溶解至浓度为 10 µmol/L，各取 1 µL 加入 8 µL 退火缓冲液（Tris-EDTA 缓冲液 + 50 mM NaCl）中，用移液器混匀。放入 PCR 仪中，运行退火程序：从 95 °C 缓慢降温至 16 °C，降温速率为 0.1 °C/s。</li>
	<li>将 sgRNA 片段连接至基因组编辑载体中。按如下方式配制连接反应体系：20 µL 混合缓冲液中加入 0.5 µL T4 DNA 连接酶、1 µL Bsa&#160;I 限制性内切酶、2 µL 10x 限制性酶切缓冲液、2 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、2 µL 退火后的引物、2.5 µL 载体（其体积可根据比例调整）以及 10 µL 蒸馏水。所有情况下均采用 2:1 的插入片段与载体摩尔比，以提高连接效率。PCR 组装程序设置为：(37 °C 2 min；16 °C 3 min)，共 30 个循环，最后 55 °C 保温 30 min。</li>
	<li>按照文献所述方法23，将构建好的载体转化至 E. coli 感受态细胞中。</li>
	<li>设计跨越质粒中 gRNA 插入位点的引物，对单个菌落进行 PCR 扩增，以筛选成功插入的克隆。对 PCR 产物进行 Sanger 测序，确认克隆正确后提取质粒24。</li>
</ol>
2. 转化 农杆菌 （耗时 4 天）
<ol>
	<li>解冻 EHA105 农杆菌 将感受态细胞置于冰上。向细胞悬液中加入1-2 µL质粒DNA（含约100-200 ng DNA），轻轻混匀。</li>
	<li>将试管置于冰上5分钟，液氮中5分钟，37 °C热激5分钟，再置于冰浴中5分钟，进行热激转化。</li>
	<li>向离心管中加入700 µL不含抗生素的酵母提取蛋白胨（YEP）培养基，轻轻混匀。将细胞置于28 °C、200–250 rpm的摇床培养箱中恢复培养2–3小时。</li>
	<li>将培养物在 2,800 x g 1分钟。弃去大部分上清液，保留约100 µL，重悬细胞。将细胞铺于含有1%抗生素（卡那霉素和利福平）的YEP琼脂平板上，用于质粒筛选。在28 °C培养24–48小时。</li>
	<li>用含有单菌落的移液枪头在YEP（含抗生素抗性）平板上划线 农杆菌 含有CRISPR/Cas的细胞转入5 mL添加适当抗生素的YEP液体培养基中，于28 °C培养3天。</li>
	<li>储存转化后的 农杆菌 将菌株以甘油菌种形式保存于 -80 °C，以备后续使用。</li>
</ol>
3. 农杆菌介导的水稻转化 Agrobacterium （耗时3个月）
注意：已有多种植物转化方法被报道用于将外源DNA序列递送并表达于植物细胞中25。考虑到单拷贝整合以及基因组中双链断裂（DSB）的发生频率较低，农杆菌介导的转化是将表达DNA片段整合到水稻染色体中的首选方法。
<ol>
	<li>执行 农杆菌介导的水稻转化，遵循以下方案中的步骤25生长旺盛的愈伤组织（淡黄色、相对较干、直径1-3 mm）是高效转化的关键。在用农杆菌侵染愈伤组织之前，应剔除已出现苗状结构或呈褐色的愈伤组织。 农杆菌.</li>
</ol>
4. 转基因植株的基因分型及种子收获（耗时8个月）
注意：需要种植两代水稻以获得纯合突变且无外源DNA的品系。
<ol>
	<li>取样幼苗组织：将转基因植株移栽至花盆中，在温室中培养1个月。为检测突变类型，从单株幼苗的每个分蘖采集2–3 mg新鲜叶片，并合并为一个样品。</li>
	<li>基因组DNA提取：按照已建立的植物基因组DNA提取方案进行26。</li>
	<li>设计突变引物（补充表1）：设计PCR引物以扩增SBEIIb基因中sgRNA靶位点周围的区域14，扩增片段长度为493 bp。</li>
	<li>突变基因分型：直接对PCR产物进行测序，或将其克隆至T-克隆载体后采用Sanger法测序，以鉴定突变类型14。</li>
	<li>种子收获：选择呈现纯合移码突变的E0株系，将其种植于温室中以收获种子。</li>
	<li>设计用于鉴定T-DNA的引物：针对载体中的潮霉素抗性基因盒（Hygromycin cassette）、UBI基因盒和Cas基因盒设计三种特异性引物，用于从突变株系中鉴定无外源DNA的植株（补充表1）。</li>
	<li>确认无外源T-DNA株系：采集2周龄幼苗的叶片，按照步骤4.2所述方法提取植物基因组DNA。进行基因组PCR扩增，程序如下：95 °C预变性3 min；随后进行35个循环：95 °C变性20 s、56 °C退火30 s、72 °C延伸60 s，最后72 °C延伸5 min。该程序可用于检测植物基因组中是否存在潮霉素抗性基因盒、UBI基因盒和Cas基因盒。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，选择无扩增条带的株系，表明其为无转基因成分的E1代植株。采集这些筛选出的株系的种子。</li>
</ol>
5. 抗性淀粉含量测定（耗时4天）
<ol>
	<li>收获突变体和X134植株的种子，并在室温下自然干燥，保持水分含量约为13%-15%。采用下述胰腺α-淀粉酶/淀粉葡萄糖苷酶（AMG）法测定抗性淀粉含量。</li>
	<li>启动脱壳机，将10 g稻谷加入进料口，有效去除颖壳，得到加工后的稻米种子。</li>
	<li>将脱壳后的稻米种子转移至精米机中，运行60秒以去除糊粉层，获得精米。</li>
	<li>将精米放入组织研磨仪中，调节研磨频率至60 Hz，运行15秒，重复2次，制备成米粉。</li>
	<li>将研磨后的米粉放入培养皿中，并置于预热的烘箱内。设定温度为37 °C，干燥12小时。</li>
	<li>精确称取100 mg ± 5 mg样品，直接倒入2.0 mL微量离心管中。轻弹管壁，确保样品沉降至管底。</li>
	<li>向管中加入180 µL纯化水，在水浴中煮沸20分钟。</li>
	<li>让样品冷却至室温，然后向每根试管中加入含胰腺α-淀粉酶（10 mg/mL）的AMG酶液4 mL（3 U/mL）。</li>
	<li>盖紧管盖，用涡旋振荡器混匀，于37 °C条件下持续振荡孵育16小时。</li>
	<li>加入4 mL乙醇，使用涡旋振荡器混匀，然后在1,500 x g条件下离心10分钟。</li>
	<li>倾去上清液，加入2 mL 50%乙醇，随后加入6 mL 50%工业甲基化酒精（IMS），涡旋混匀后离心。</li>
	<li>小心倒掉上清液，将离心管倒置以排尽残留液体。将试管置于冰浴中，向每管加入2 mL 2 M KOH，搅拌20分钟，使絮状物重悬并溶解抗性淀粉。</li>
	<li>向每个试管中加入8 mL 1.2 M乙酸钠缓冲液（pH 3.8），使用磁力搅拌器混匀。</li>
	<li>立即向每管加入0.1 mL AMG酶液（3300 U/mL），充分混匀后，在50 °C水浴中孵育30分钟，期间间歇性使用涡旋振荡器混匀。随后在1,500 x g条件下离心10分钟。</li>
	<li>取0.1 mL上清液转移至玻璃试管中，加入3 mL葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOPOD）试剂，在50 °C孵育20分钟。通过混合0.1 mL 100 mM乙酸钠缓冲液与3 mL GOPOD试剂制备试剂空白。通过混合0.1 mL D-葡萄糖与3 mL GOPOD试剂制备标准品。</li>
	<li>小心吸取每种空白溶液、待测溶液和标准溶液各200 µL，加入96孔板中。</li>
	<li>以空白溶液为对照，在510 nm处测定各样品的吸光度，并使用提供的公式计算抗性淀粉含量。 
	抗性淀粉含量（g/100 g）= ΔA × F/W ×9.27 
	其中，ΔA = 相对于试剂空白测得的吸光度；F = 吸光度转换为微克的换算系数（由GOPOD反应中100 µg D-葡萄糖所产生的吸光度确定）；W = 分析样品的干重。</li>
</ol>
6. 餐后血糖反应（持续时间5天）
<ol>
	<li>采用以下纳入标准招募参与者：年龄在18至60岁之间的健康中国汉族成年人，非吸烟者，体重指数（BMI）在18.5至25 kg/m2之间，血压正常（&#60; 140/90 mmHg）。采用以下排除标准：患有代谢性疾病（如糖尿病、高血压等）、胃肠道疾病、内分泌系统异常或精神类疾病。共筛选并招募10名参与者。</li>
	<li>测试流程（持续两个连续日）
	<ol>
		<li>第0天（准备日）：要求参与者在测试前3天保持规律的睡眠模式和正常饮食。测试前一晚（20:00后）避免摄入高纤维和高糖食物。第1天上午不建议进行剧烈运动。</li>
		<li>第1天（测试日）：将稻谷碾磨制成白米，然后将白米冲洗2次。在锅中加入1.5份水与1份白米。煮沸至水分完全吸收。关闭火源，盖上锅盖，静置10分钟。</li>
		<li>将10名参与者随机分为两组，每组人数相等：一组为试验组，食用抗性淀粉白米；另一组为对照组，食用X134白米。要求参与者在测试开始前休息10分钟。</li>
		<li>用75%医用酒精对指尖进行消毒。将采血针轻轻按压在指尖上，释放弹簧以刺破皮肤。轻柔挤压手指，产生一小滴血珠，并将该血滴接触血糖仪试纸的吸血端。血糖仪将自动吸入血液并启动检测过程。等待血糖读数显示。</li>
		<li>进食与采血：向每位参与者提供50 g已制备好的米饭及200 mL水，要求其在5至10分钟内以舒适的速度食用完毕。餐后，于进餐开始后的以下时间点采集静脉血样：15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟。按照步骤6.2.4进行血糖分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

CRISPR-Based Efficient Genome Editing for Resistant Starch in Rice Breeding

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<li>Čermák, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multipurpose+toolkit+to+enable+advanced+genome+engineering+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants.</a> Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在构建基于CRISPR/Cas-SF01的敲低载体过程中，必须精细筛选单导向RNA（sgRNA），这是至关重要的步骤。需要选择那些具有高编辑效率且脱靶效应最小的序列。此外，在合成靶向引物时，需加入与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸，以确保无缝整合。值得注意的是，与以往需要依次进行酶切消化、凝胶纯化和连接的实验方法不同，本研究通过将酶切与连接步骤整合到一个一体化系统中，简化了操作流程。这一改进显著提高了操作效率，并缩短了实验周期。
与经典的Cas9核酸酶相比，Cas-SF01展现出明显的优势，凸显了其在分子植物育种中的应用潜力。这些优势共同确立了Cas-SF01作为农业生物技术中一种极具前景的工具的地位。首先，Cas-SF01较小的蛋白质尺寸可能提高其在植物体内的细胞递送效率。其次，其较短的crRNA序列有利于设计多重靶向策略，从而实现更复杂的遗传修饰28。第三，Cas-SF01通常诱导产生较大规模的突变，而Cas9通常仅引起1 bp的插入或缺失（indel），表明Cas-SF01在实现更显著的遗传改变方面具有更大潜力<sup clas...

传统育种依赖于将性状导入作物或产生具有足够变异的植物群体，这需要长期的田间观察1,2。由于传统育种存在局限性，基因编辑技术得以发展，该技术可对作物基因组进行精确修饰，从而获得目标植物群体的理想性状3。目前在植物中应用最广泛的基因编辑系统是CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关Cas核酸酶），该系统依赖于一种可编程的RNA引导核酸酶，在DNA中产生特异性的双链断裂（DSBs）4,5。这些双链断裂随后由细胞自身的DNA修复机制进行修复6,7，通常导致目标遗传变异的引入。尽管该技术已在小麦8、玉米9、大豆10和水稻11等多种作物中得到应用，但其主要仍用于揭示生物学问题。与基因编辑技术在解析植物基因功能方面的广泛应用相比，将其应用于作物育种的研究仍相对较少12。
作物基因编辑的过程通常遵循一个明确定义的工作流程，该流程包括多个关键步骤13第一步是确定需要修饰以获得目标性状的特定基因或基因组区域。第二步是设计基因编辑策略，包括选择合适的基因编辑系统（例如 CRISPR-Cas9 或 CRISPR-Cas12）以及设计特异的向导 RNA，以引导内切核酸酶靶向目标位点。第三步是将基因编辑系统整合到递送载体中，用于将编辑工具导入植物细胞。这些载体可以是 DNA、RNA 或核糖核蛋白（RNP）复合物。随后，通过多种方法将基因编辑载体递送至植物细胞，包括 农杆菌介导的转化、基因枪轰击或电穿孔。转化后的植物细胞需立即在适当条件下进行培养，以获得基因编辑的愈伤组织或胚性组织。随后，通过组织培养技术将这些组织再生为完整植株。再生植株需经过严格的分子鉴定，以确认目标遗传修饰的存在。 
Tsakirpaloglou 等人先前发表的一篇文章14对基因编辑过程提供了全面概述，涵盖了从载体设计到获得编辑幼苗的各个环节，但并未深入探讨与靶向基因相关的特定性状的详细分析，也未对编辑作物的农艺表现或功能验证进行后续评估。我们的研究已超越了仅仅证明在水稻中实现基因编辑可行性的层面。本工作系统地评估了该基因编辑对水稻品系在生化、分子及农艺性状方面的影响，包括对淀粉组成成分的分析——这是影响稻米品质和营养价值的关键因素，而在以往的基因编辑研究中对此尚未进行充分探索。
大米淀粉通常由约20%的直链淀粉和约80%的支链淀粉组成15。SBEIIb 是支链淀粉合成所必需的一种酶，其在胚乳中表达16。通过发夹RNA（RNAi）和微小RNA表达对OsSBEIIb进行基因沉默，可提高抗性淀粉含量17,18。抗性淀粉是一种不能在小肠中被消化和吸收的底物淀粉，但可在肠道中被某些消化细菌分解为短链脂肪酸和气体。由于其不能被快速分解，与其他淀粉相比具有较低的血糖生成指数，在摄入后短时间内不会引起血糖迅速升高，因此在膳食中可在一定程度上缓解糖尿病19。此外，抗性淀粉还具有多种生理功能，例如降低胰岛素反应、调节肠道功能、防止脂肪积累、有助于体重控制以及促进矿物质离子的吸收。因此，抗性淀粉正被广泛开发为一种新型膳食纤维20。
为了克服这些挑战并成功利用基因编辑技术培育功能性水稻品种，我们对水稻中的操作流程进行了改进和优化。我们的工作重点在于细致分析目标基因位点的设计，谨慎选择最合适的基因编辑工具，并在整个育种过程中进行严格的表型分析。为证明这些技术的强大功能与高效性，我们展示了一个案例研究，介绍了一种富含高抗性淀粉的功能性水稻品种的快速培育过程。该实例凸显了基因编辑技术在加速功能性水稻育种方面的潜力，有助于弥补当前该领域研究的不足。

<table><tbody><tr><td>2 x Taq Plus Master Mix II</td><td>诺唯赞生物科技有限公司</td><td>P213</td><td>&amp;nbsp;检测基因的单核苷酸多态性（SNP）</td></tr><tr><td>2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液</td><td>植物技术</td><td>D309</td><td></td></tr><tr><td>AAM 培养基</td><td>山东拓普生物工程有限公司</td><td>M9051C</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R3535</td><td>编辑载体的 Bsa I 酶切消化</td></tr><tr><td>羧苄青霉素类抗生素</td><td>Applygen</td><td>APC8250-5</td><td>选择&amp;nbsp; 培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>水解酪蛋白䏡</td><td>BBI生命科学公司</td><td>A603060-0500</td><td>愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 化学感受态细胞</td><td>Weidi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DL1001</td><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;感受态细胞</td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>BBI生命科学公司</td><td>A610491-0500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，二钠盐，二水合物</td><td>钻石</td><td>A100105-0500</td><td>CTAB缓冲液</td></tr><tr><td>EHA105 感受态细胞</td><td>Weidi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>AC1010</td><td>&lt;em&gt;农杆菌 &lt;/em&gt;感受态细胞</td></tr><tr><td>FastPure 质粒小提试剂盒</td><td>诺唯赞生物科技有限公司</td><td>REC01-100</td><td>质粒提取</td></tr><tr><td>潮霉素类抗生素</td><td>Yeasen</td><td>60224ES</td><td>共培养培养基、筛选培养基、再生培养基和生根培养基</td></tr><tr><td>卡那霉素类抗生素</td><td>Yeasen</td><td>60206ES10</td><td>农杆菌筛选</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Macklin</td><td>P766798</td><td>CTAB缓冲液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>植物技术</td><td>G229</td><td>愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>植物技术</td><td>P698</td><td>愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>秀水134水稻干种子</td><td>-</td><td>-</td><td>用于培育抗性淀粉水稻的粳稻品种</td></tr><tr><td>碾米机</td><td>MARUMASU</td><td>MHR1500A</td><td>生产白米</td></tr><tr><td>穆拉希格-斯科格</td><td>植物技术</td><td>M519</td><td>生根培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>肌醇</td><td>植物技术</td><td>I703</td><td>再生培养基</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>对于&amp;nbsp; YEP 培养基</td></tr><tr><td>NB基础培养基</td><td>植物技术</td><td>N492</td><td>愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>蛋白胨&amp;nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>LA8800</td><td>对于&amp;nbsp; YEP 培养基</td></tr><tr><td>Phytogel</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>S24793</td><td></td></tr><tr><td>盆&amp;nbsp;</td><td>Midea group Co.</td><td>MB-5E86</td><td>煮饭方法</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>Haier</td><td>BCD-170</td><td>储存培养基</td></tr><tr><td>抗性淀粉检测试剂盒</td><td>Megazyme</td><td>K-RSTAR</td><td>抗性淀粉的测定与分析</td></tr><tr><td>利福平类抗生素</td><td>Sigma</td><td>R3501-250MG</td><td>农杆菌筛选</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>Macklin</td><td>S817439</td><td>用于种子灭菌</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>上海源叶生物科技有限公司</td><td>B21647</td><td>愈伤组织诱导培养基，共培养培养基，筛选培养基，再生培养基</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202</td><td>将sgRNA连接至CEISPRY/Cas-SF01载体</td></tr><tr><td>血糖监测仪</td><td>医疗设备 &amp;安普供应有限公司</td><td>Xuetang 582</td><td>检测血糖</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Macklin</td><td>T766494</td><td>CTAB缓冲液</td></tr><tr><td>酵母琼脂</td><td>Solarbio</td><td>LA1370</td><td>对于&amp;nbsp; YEP 培养基</td></tr><tr><td>YEP 培养基</td><td>-</td><td>-</td><td>农杆菌的培养</td></tr></tbody></table>

利用基因组编辑技术设计培育功能性水稻

Breeding by Design for Functional Rice with Genome Editing Technologies

传统的作物育种方法主要依赖于传统杂交和诱变育种等耗时且劳动密集型的技术，在高效引入目标性状和创制多样化植物群体方面面临挑战。相比之下，基因组编辑技术的出现带来了一场范式变革，使得能够精确且快速地操控植物基因组，从而有目的地引入期望的性状。其中应用最广泛的编辑工具之一是CRISPR/Cas系统，研究人员已利用该系统研究诸多重要的生物学问题。然而，基因组编辑在作物育种中的精确且高效的操作流程尚未得到充分明确。本研究展示了培育富含高抗性淀粉（resistant starch, RS）水稻品种的完整过程，抗性淀粉是一种在预防糖尿病和肥胖等疾病中发挥关键作用的功能性状。该操作流程包括多个关键步骤：功能SBEIIb基因的筛选、单导向RNA（sgRNA）的设计、合适的基因组编辑载体的选择、载体递送方法的确定、植物组织培养、突变基因分型以及表型分析。此外，本研究还清晰地展示了每个阶段所需的时间周期。该技术方案不仅简化了育种流程，而且提高了性状引入的准确性和效率，从而加速了功能性水稻品种的开发。

在本研究中，通过基因组编辑技术展示了培育功能性水稻的完整流程，以获得稳定的抗性淀粉水稻品种。我们整合了靶向 SBEIIb 进入 CRISPR/Cas-SF01（补充图1），用渗透法处理水稻 农杆菌 转化后，经过筛选和生根阶段获得T0代植株。筛选出基因功能缺失的植株，在收获种子后测定其抗性淀粉含量（图1）。通过Sanger测序在E0植株中检测到纯合突变（20.8%）， sbeIIb-1（-2bp，CC）， sbeIIb-2 （-4bp，AGCC），以及 sbeIIb -3（-4bp，GTGC）在目标序列中导致编码区发生移码突变，从而产生无功能的蛋白质（图2, 补充图2和补充图3).
经过细致的筛选过程，以鉴定出携带 E1 植株 sbeIIb-1, sbeIIb-2 和 sbeIIb-3...

本方案介绍了一种利用基因组编辑技术，以精确、高效且技术简便的方式设计培育抗性淀粉水稻品种的方法。

传统的作物育种方法主要依赖于耗时且劳动密集型的技术，例如传统杂交以及……

我们正在利用基因组编辑技术培育具有特定功能的水稻。我们的研究不仅仅局限于应用基因编辑工具，而是聚焦于从基因筛选、编辑工具优化，到表型及农艺性状分析等多个环节的系统整合。我们已超越了仅仅验证在水稻中编辑 SBE2b 基因可行性的阶段。我们的研究将全面评估该编辑工具对编辑后水稻植株化学成分和农艺性状的影响。未来，本实验室将聚焦若干关键科学问题，致力于突破基因编辑技术与作物育种的现有局限。具体而言，我们致力于培育一系列功能型品种，这些品种不仅具有高产和优异品质，还表现出强大的抗逆性。首先，访问 NCBI 网站以获取粳稻品种所需的基因。在 SnapGene 软件中下载并打开参考基因组。分析 X134 品种中 OSSBE2b 基因外显子序列内的插入或缺失以及单核苷酸多态性，并将其与参考基因组进行比对。使用 NCBI Primer-BLAST 工具设计跨越外显子区域的引物。为通过 Sanger 测序验证 X134 中 OSSBE2b 基因的外显子序列，需配制反应体系，并在适当条件下运行 PCR 程序。根据 Sacher-Paluglu 方案，在 X134 的 OSSBE2b 外显子序列上设计单导向 RNA（sgRNA），并确保原间隔序列邻近基序（PAM）序列为 TTN。在正向引物的5'端添加ACAC寡核苷酸，在反向引物的5'端添加GGCC寡核苷酸。溶解引物后，取每种引物各1微升与8微升退火缓冲液混合。将混合物放入PCR仪中，运行退火程序。将sgRNA组装到基因组编辑载体中，并运行PCR组装程序。将所得载体转化至大肠杆菌细胞中，并对单个菌落进行PCR扩增，以筛选成功插入的克隆，并通过Sanger测序确认克隆成功。首先，获取sgRNA，并将质粒DNA转化至农杆菌中。将转基因植株移栽至花盆中，在温室中培养一个月。为检测突变类型，根据既定方案，从单株幼苗的每个分蘖采集2至3毫克新鲜叶片，作为一个单独样品。从采集的叶片样品中提取基因组DNA。设计PCR引物以扩增单导向RNA靶位点周围的SBE2b基因区域，获得长度为493个碱基对的扩增片段。使用Sanger测序法直接对PCR片段进行测序，以鉴定突变。筛选出表现出纯合移码突变的E0株系，并将其种植于温室中以收获种子。然后，从两周大的幼苗中采集叶片并提取植物基因组DNA。使用适当的程序进行基因组PCR，以检测植物基因组中是否存在潮霉素抗性基因、UBI启动子和Cas表达盒。通过凝胶电泳分析PCR产物，筛选无扩增条带的植株，表明其为不含外源转基因的E1代植株。从这些选育品系中收获种子。突变植株的籽粒呈现出完全不透明的蜡质外观，与野生型籽粒的半透明外观不同。在结实率、每穗粒数和单株产量方面，SBE2B突变体与野生型植株之间未观察到显著差异。首先，收获突变体和X134植株的种子，并在室温下自然干燥，直至水分含量降至约13%至15%。启动脱壳机后，将10克稻谷加入进料口，以高效去除稃壳。将脱壳后的稻米转入精米机中，运行机器60秒，以去除糊粉层，获得精米。随后，将精米放入组织研磨器中。将研磨频率调整为60赫兹，以两个循环每次运行15秒，制备米粉。将研磨后的米粉放入培养皿中，并置于预热至37摄氏度的烘箱内12小时。然后，取100毫克米粉加入2毫升微量离心管中，轻轻敲击管壁。向试管中加入 180 微升纯化水，在水浴中煮沸样品 20 分钟。待样品冷却后，向试管中加入 4 毫升含有胰腺α-淀粉酶的 AMG。接着，在涡旋振荡器上混合管内物质，并在 37 摄氏度下孵育 16 小时，持续振荡。现在，加入 4 mL 乙醇，并使用涡旋振荡器混匀样品。然后，以 1,500 ×g 离心 10 分钟。倒去上清液后，向离心管中加入 2 mL 50% 乙醇，再加入 6 mL 50% 工业甲基化酒精（IMS），并混匀。离心管子后，小心倒出上清液，并将管子倒置以沥去多余液体。将管子置于冰浴中，加入 2 毫升 2 摩尔/升的氢氧化钾溶液，并搅拌样品 20 分钟，以重新悬浮絮状物并溶解抗性淀粉。向管中加入 8 毫升 pH 3.8 的 1.2 摩尔/升乙酸钠缓冲液，并使用磁力搅拌器混合。然后，立即向混合物中加入0.1毫升AMG，并充分混匀。将样品置于水浴中，在50摄氏度下孵育30分钟，期间使用涡旋振荡器间歇混匀。孵育结束后，以1,500 × g离心10分钟。现在，将0.1毫升上清液转移至新的玻璃试管中。加入3毫升葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂，将样品在50摄氏度下孵育20分钟。小心吸取每种空白样品溶液和标准溶液各200微升，加入96孔板中。以空白溶液为对照，在510纳米处测定每个样品的吸光度，并使用公式计算抗性淀粉含量。最后，为受试者提供50克煮熟的米饭和200毫升水。餐后，在不同时间点采集静脉血样，进行血糖分析。与野生型相比，SBE2B突变体的抗性淀粉含量显著更高，达到5.2%。食用制备的米饭后，在15分钟和30分钟时葡萄糖反应更缓慢且降低，分别减少了9.7%和3.7%。

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利用基因组编辑技术为功能性水稻设计育种

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农杆菌介导的遗传转化：通过基因工程改造的根癌农杆菌对水稻基因组进行遗传转化的方法

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

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通过甲基磺酸乙酯诱变法创制小粒谷类作物基因组定点诱导局部突变（TILLING）群体

本文介绍了基于高分辨率熔解分析（HRM）的靶向诱导基因组局部突变（TILLING）技术方案。该方法利用DNA双链熔解过程中荧光信号的变化，适用于对插入/缺失（Indel）和单碱基替换（SBS）进行高通量筛选。...

通过高分辨率熔解分析在水稻TILLING群体中鉴定突变位点

本文介绍了一种用于谷类作物转录组分析的方法。基于微阵列的基因表达谱分析首先从谷物籽粒中分离高质量的总RNA，随后进行cDNA的合成。在完成cRNA标记和微阵列杂交后，本文提供了有关信号检测和质量控制的建议。...

通过改良的基因表达谱分析方法从谷物种子中获取高质量转录组数据

本研究描述了利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术敲除内源性基因的方法 OsABCG15 随后进行改良的...

农杆菌介导的遗传转化、转基因植株创制及其在水稻雄性生殖发育研究中的应用

在本研究中，一种新型 在植株中 由基因表达和基因编辑方法介导的 农杆菌...

在植株中毛竹叶片的基因表达与基因编辑

在许多生物学和临床情境中，研究细胞过程在其天然微环境中的动态演变具有显著优势。本文介绍了低成本光纤显微镜的组装及其应用，该显微镜可实现实时成像，适用于细胞培养、动物实验以及临床患者研究。...

高分辨率光纤微内窥镜技术用于 原位 细胞成像

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利用基因组编辑技术设计培育功能性水稻

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