利用基因组编辑技术设计培育功能性水稻

我们正在利用基因组编辑技术培育具有特定功能的水稻。我们的研究不仅仅局限于应用基因编辑工具，而是聚焦于从基因筛选、编辑工具优化，到表型及农艺性状分析等多个环节的系统整合。我们已超越了仅仅验证在水稻中编辑 SBE2b 基因可行性的阶段。

我们的研究将全面评估该编辑工具对编辑后水稻植株化学成分和农艺性状的影响。未来，本实验室将聚焦若干关键科学问题，致力于突破基因编辑技术与作物育种的现有局限。具体而言，我们致力于培育一系列功能型品种，这些品种不仅具有高产和优异品质，还表现出强大的抗逆性。

首先，访问 NCBI 网站以获取粳稻品种所需的基因。在 SnapGene 软件中下载并打开参考基因组。分析 X134 品种中 OSSBE2b 基因外显子序列内的插入或缺失以及单核苷酸多态性，并将其与参考基因组进行比对。

使用 NCBI Primer-BLAST 工具设计跨越外显子区域的引物。为通过 Sanger 测序验证 X134 中 OSSBE2b 基因的外显子序列，需配制反应体系，并在适当条件下运行 PCR 程序。根据 Sacher-Paluglu 方案，在 X134 的 OSSBE2b 外显子序列上设计单导向 RNA（sgRNA），并确保原间隔序列邻近基序（PAM）序列为 TTN。

在正向引物的5'端添加ACAC寡核苷酸，在反向引物的5'端添加GGCC寡核苷酸。溶解引物后，取每种引物各1微升与8微升退火缓冲液混合。将混合物放入PCR仪中，运行退火程序。

将sgRNA组装到基因组编辑载体中，并运行PCR组装程序。将所得载体转化至大肠杆菌细胞中，并对单个菌落进行PCR扩增，以筛选成功插入的克隆，并通过Sanger测序确认克隆成功。首先，获取sgRNA，并将质粒DNA转化至农杆菌中。

将转基因植株移栽至花盆中，在温室中培养一个月。为检测突变类型，根据既定方案，从单株幼苗的每个分蘖采集2至3毫克新鲜叶片，作为一个单独样品。从采集的叶片样品中提取基因组DNA。

设计PCR引物以扩增单导向RNA靶位点周围的SBE2b基因区域，获得长度为493个碱基对的扩增片段。使用Sanger测序法直接对PCR片段进行测序，以鉴定突变。筛选出表现出纯合移码突变的E0株系，并将其种植于温室中以收获种子。

然后，从两周大的幼苗中采集叶片并提取植物基因组DNA。使用适当的程序进行基因组PCR，以检测植物基因组中是否存在潮霉素抗性基因、UBI启动子和Cas表达盒。通过凝胶电泳分析PCR产物，筛选无扩增条带的植株，表明其为不含外源转基因的E1代植株。

从这些选育品系中收获种子。突变植株的籽粒呈现出完全不透明的蜡质外观，与野生型籽粒的半透明外观不同。在结实率、每穗粒数和单株产量方面，SBE2B突变体与野生型植株之间未观察到显著差异。

首先，收获突变体和X134植株的种子，并在室温下自然干燥，直至水分含量降至约13%至15%。启动脱壳机后，将10克稻谷加入进料口，以高效去除稃壳。将脱壳后的稻米转入精米机中，运行机器60秒，以去除糊粉层，获得精米。随后，将精米放入组织研磨器中。

将研磨频率调整为60赫兹，以两个循环每次运行15秒，制备米粉。将研磨后的米粉放入培养皿中，并置于预热至37摄氏度的烘箱内12小时。然后，取100毫克米粉加入2毫升微量离心管中，轻轻敲击管壁。

向试管中加入 180 微升纯化水，在水浴中煮沸样品 20 分钟。待样品冷却后，向试管中加入 4 毫升含有胰腺α-淀粉酶的 AMG。接着，在涡旋振荡器上混合管内物质，并在 37 摄氏度下孵育 16 小时，持续振荡。

现在，加入 4 mL 乙醇，并使用涡旋振荡器混匀样品。然后，以 1,500 ×g 离心 10 分钟。倒去上清液后，向离心管中加入 2 mL 50% 乙醇，再加入 6 mL 50% 工业甲基化酒精（IMS），并混匀。

离心管子后，小心倒出上清液，并将管子倒置以沥去多余液体。将管子置于冰浴中，加入 2 毫升 2 摩尔/升的氢氧化钾溶液，并搅拌样品 20 分钟，以重新悬浮絮状物并溶解抗性淀粉。向管中加入 8 毫升 pH 3.8 的 1.2 摩尔/升乙酸钠缓冲液，并使用磁力搅拌器混合。

然后，立即向混合物中加入0.1毫升AMG，并充分混匀。将样品置于水浴中，在50摄氏度下孵育30分钟，期间使用涡旋振荡器间歇混匀。孵育结束后，以1,500 × g离心10分钟。

现在，将0.1毫升上清液转移至新的玻璃试管中。加入3毫升葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂，将样品在50摄氏度下孵育20分钟。小心吸取每种空白样品溶液和标准溶液各200微升，加入96孔板中。

以空白溶液为对照，在510纳米处测定每个样品的吸光度，并使用公式计算抗性淀粉含量。最后，为受试者提供50克煮熟的米饭和200毫升水。餐后，在不同时间点采集静脉血样，进行血糖分析。

与野生型相比，SBE2B突变体的抗性淀粉含量显著更高，达到5.2%。食用制备的米饭后，在15分钟和30分钟时葡萄糖反应更缓慢且降低，分别减少了9.7%和3.7%。