在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

CAR T细胞疗法是一种创新的癌症免疫疗法，已实现持续超过十年的缓解。然而，持久应答的比率仍然有限。通过本方案，我们旨在加深对耐药机制的理解，并开发出提高CAR T细胞疗法应答率的工具。

目前，人们正在采用多种方法来改进CAR T细胞治疗，包括联合疗法和优化CAR设计。然而，由于越来越多的证据表明，输注前CAR T细胞产品的表观遗传特征是决定治疗反应的重要因素，因此基因编辑技术已成为常用工具。

CAR T细胞的基因组编辑在临床前和临床研究中已显示出预防毒性并增强CAR T细胞扩增和持久性的效果。我们提供的全基因组CRISPR敲除筛选方案，为确定最优的基因编辑策略以改善CAR T细胞功能提供了一种高效且无偏倚的方法。

全基因组范围的基因扰动需要大规模且充分的选择条件才能有效。为了研究CAR T细胞耗竭的发生过程，我们了解到必须刺激超过8000万个CAR T细胞持续两周，以筛选出最佳的基因编辑。

尽管本实验方案旨在评估耗竭现象的发展过程，但该方案也可调整用于评估其他耐药机制的形成。通过在不同条件下开展全基因组筛选，我们最终有望确定最佳的基因编辑策略，以增强对CAR T细胞治疗的整体应答效果。

[旁白] 将CAR T细胞用CRISPR文库转导后，在4摄氏度下以300g离心5分钟，洗涤细胞。吸除上清液，并将细胞重悬于20毫升T细胞培养基中。为保存样本用于下一代测序，将足量的CAR T细胞分装至一个50毫升锥形管中，以维持每条向导RNA对应500个细胞的向导RNA代表性。在4摄氏度下以300g离心5分钟。然后将细胞沉淀重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并转移至一个2毫升微量离心管中。用1毫升PBS洗涤50毫升锥形管，并将洗涤液转移至同一微量离心管中。随后在4摄氏度下以500g离心5分钟。去除上清液，并将细胞沉淀在-20摄氏度下保存。开始共培养时，按1:1的比例将CAR T细胞加入CD19阳性的JeKo-1细胞中。用T细胞培养基将共培养体系总体积补至160毫升，并将样本置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中培养。为重新刺激CAR T细胞，将共培养物收集至50毫升锥形管中，在4摄氏度下以300g离心5分钟。将每份样本重悬于80毫升T细胞培养基中，并加入80 × 10⁶个JeKo-1细胞（溶于80毫升T细胞培养基中）。将样本置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中培养。第15天，为从共培养体系中分离CAR T细胞，首先对细胞进行计数。联合使用CD4阳性T细胞阳性分选试剂盒和CD8阳性T细胞阳性分选试剂盒，从CAR T细胞与JeKo-1细胞的共培养物中分离T细胞。然后对分离得到的T细胞进行计数。为保存样本用于下一代测序，将33 × 10⁶个CAR T细胞分装至一个50毫升锥形管中，在4摄氏度下以300g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于1毫升PBS中，并转移至一个2毫升微量离心管中。随后用1毫升PBS洗涤50毫升锥形管，并将洗涤液转移至同一微量离心管中。离心后去除上清液，将细胞沉淀在-20摄氏度下保存。首先，使用基因组DNA提取试剂盒从冷冻保存的CAR T细胞沉淀中提取基因组DNA。通过乙醇沉淀法纯化提取的基因组DNA：先将100%乙醇预冷至-20摄氏度。将洗脱的DNA等量分装至多个微量离心管中，确保每份体积为200至250微升。加入两倍体积的预冷100%乙醇、0.1倍体积的3摩尔醋酸钠溶液以及1微升浓度为20毫克/毫升的糖原。将样本在-20摄氏度下孵育过夜。第二天，在13,000g下离心20分钟，使沉淀的DNA形成沉淀。吸除上清液，用1毫升70%乙醇在7,500g下离心10分钟洗涤沉淀。将沉淀完全干燥后，将其重悬于50微升无菌水中。为准备用于下一代测序的基因组DNA，按照所示的特定反应体系配制PCR反应。然后按照以下循环条件进行PCR扩增。收集每份样本的PCR反应产物，并根据制造商说明书使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。将每份样本的3微克PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。根据制造商说明书，使用凝胶回收试剂盒切胶并提取目标PCR产物。将提取后的样本在-20摄氏度下保存。