Name: 在嵌合抗原受体 T 细胞中进行体外全基因组 CRISPR 敲除筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选的方法，用于研究CAR T细胞治疗耐药机制并提升疗效。该技术为免疫治疗研究提供重要工具。

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本研究部分由梅奥诊所个体化医学中心（SSK）和梅奥诊所综合癌症中心资助&#160;癌症中心（SSK）、梅奥诊所再生生物治疗中心（SSK）、美国国立卫生研究院K12CA090628（SSK）和R37CA266344-01（SSK）、美国国防部资助CA201127（SSK）、Predolin基金会（SSK）以及明尼苏达州生物技术与医学基因组学合作项目（SSK）。CMS由梅奥诊所生物医学科学研究生院支持。CRISPR筛选示意图（图1由 BioRender.com 制作（Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054）。&#160;

Genome-Wide CRISPR Screens in CART Cells to Investigate Therapy Resistance

<ol><li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-year+follow-up+supports+curative+potential+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">5-year follow-up supports curative potential of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1).</a> Blood. 141 (19), 2307-2315 (2023).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+ciloleucel+CAR+T-cell+therapy+in+refractory+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Locke, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+activity+of+axicabtagene+ciloleucel+in+refractory+large+B-cell+lymphoma+%28zuma-1%29%3A+A+single-arm%2C+multicentre%2C+phase+1-2+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (zuma-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial.</a> Lancet Oncol. 20 (1), 31-42 (2019).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+adult+relapsed+or+refractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 380 (1), 45-56 (2018).</li>
<li>Bai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+antigen-specific+landscape+of+CAR+T+infusion+product+identifies+determinants+of+CD19-positive+relapse+in+patients+with+all%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Single-cell antigen-specific landscape of CAR T infusion product identifies determinants of CD19-positive relapse in patients with all.</a> Sci Adv. 8 (23), eabj2820(2022).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Med. 24, 563-571 (2018).</li>
<li>Gennert, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulatory+landscape+of+human+CAR+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulatory landscape of human CAR T cell exhaustion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 118 (30), e2104758118(2021).</li>
<li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+anti-CD19+CAR+T+cell+infusion+products+associated+with+efficacy+and+toxicity+in+patients+with+large+B+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas.</a> Nat Med. 26 (12), 1878-1887 (2020).</li>
<li>Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+CRISPR%2FCAS9+to+knock+out+GM-CSF+in+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using CRISPR/CAS9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells.</a> J Vis Exp. (149), e59629(2019).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. 133 (7), 697-709 (2019).</li>
<li>Cox, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+disruption+in+CART+cells+modulates+T+cell+activation+and+enhances+CART+cell+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity.</a> Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).</li>
<li>Ottaviano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+trial+of+CRISPR-engineered+CAR19+universal+T+cells+for+treatment+of+children+with+refractory+B+cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia.</a> Sci Transl Med. 14 (668), eabq3010(2022).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12, 828-863 (2017).</li>
<li>Mccutcheon, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+regulators+of+human+CD8%2B+T+cell+function+identified+through+orthogonal+CRISPR+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens.</a> Nat Genet. 55, 2211-2223 (2023).</li>
<li>Zhu, W., Kelly, C., Dagur, P., Dunbar, C. E., Cordes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+activation+screen+to+optimize+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CRISPR activation screen to optimize chimeric antigen receptor (CAR) T cell immunophenotype.</a> Blood. 142 (Supplement 1), 4820-4820 (2023).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+of+CAR+T+cells+and+cancer+stem+cells+reveals+critical+dependencies+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.</a> Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).</li>
<li>Shifrut, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screens+in+primary+human+T+cells+reveal+key+regulators+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function.</a> Cell. 175 (7), 1958-1971.e15 (2018).</li>
<li>Belk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+crispr+screens+of+T+cell+exhaustion+identify+chromatin+remodeling+factors+that+limit+T+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide crispr screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence.</a> Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC-seq+maps+the+comprehensive+and+dynamic+chromatin+accessibility+landscape+of+CAR-T+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction.</a> Leukemia. 36 (11), 2656-2668 (2022).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Beider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+signatures+associated+with+CAR+T+cell+exhaustion+and+impaired+clinical+response+in+patients+with+B+cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional signatures associated with CAR T cell exhaustion and impaired clinical response in patients with B cell malignancies.</a> Cells. 11 (7), 1140(2022).</li>
<li>Wherry, E. J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12, 492-499 (2011).</li>
<li>Prinzing, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+DNMT3A+in+CAR+T+cells+prevents+exhaustion+and+enhances+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Deleting DNMT3A in CAR T cells prevents exhaustion and enhances antitumor activity.</a> Sci Transl Med. 13, eabh0272(2021).</li>
<li>Lynn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-jun+overexpression+in+CAR+T+cells+induces+exhaustion+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance.</a> Nature. 576, 293-300 (2019).</li>
<li>Tang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+inhibition+via+CRISPR+promotes+the+long-term+efficacy+of+CAR+T+cells+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TGF-beta inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors.</a> JCI Insight. 5 (4), e133977(2020).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-CAS9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-CAS9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control%2C+modeling%2C+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biol. 16, 281(2015).</li>
<li>Sakemura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+in+the+bone+marrow+prevents+resistance+to+CART-cell+therapy+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts in the bone marrow prevents resistance to CART-cell therapy in multiple myeloma.</a> Blood. 139 (26), 3708-3721 (2022).</li>
<li>Stewart, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+drives+exhaustion+of+CD8%2B+CART+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">IL-4 drives exhaustion of CD8+ CART cells.</a> Nat Commun. 15 (1), 7921(2024).</li>
<li>FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Babraham Bioinformatics. 
 <a target="_blank" href=" https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/"> https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bbmerge. , 
 <a target="_blank" href=" https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh"> https://github.com/BioInfoTools/BBMap/blob/master/sh/bbmerge.sh</a> (2019).</li>
<li>Pattanayak, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+profiling+of+off-target+DNA+cleavage+reveals+RNA-programmed+CAS9+nuclease+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed CAS9 nuclease specificity.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-CAS9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-CAS9-mediated gene inactivation.</a> Nat Biotechnol. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li>
<li>Dong, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immunotherapy+target+discovery+using+genome-scale+in+vivo+CRISPR+screens+in+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells.</a> Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CRISPR+screens+in+vivo+map+T+cell+fate+regulomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell CRISPR screens in vivo map T cell fate regulomes in cancer.</a> Nature. 624 (7990), 154-163 (2023).</li>
<li>Sutra Del Galy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+CRISPR+screens+identify+SOCS1+as+intrinsic+checkpoint+of+CD4%2B+TH1+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide CRISPR screens identify SOCS1 as intrinsic checkpoint of CD4+ TH1 cell response.</a> Sci Immunol. 6 (66), eabe8219(2021).</li>
<li>Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-intrinsic+determinants+of+CAR-T+response+revealed+by+iterative+in+vivo+genome-wide+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leukemia-intrinsic determinants of CAR-T response revealed by iterative in vivo genome-wide CRISPR screening.</a> Nat Commun. 14 (1), 8048(2023).</li>
</ol>

SSK 是嵌合抗原受体（CAR）免疫疗法领域多项专利的发明人，这些专利已授权给诺华公司（通过梅奥诊所、宾夕法尼亚大学与诺华之间的协议）、Humanigen（通过梅奥诊所）、Mettaforge（通过梅奥诊所）、MustangBio（通过梅奥诊所）以及 Chymal Therapeutics（通过梅奥诊所）。CS、CMR 和 SSK 是已授权给 Immix Biopharma 公司的专利的发明人。SSK 收到来自 Kite、Gilead、Juno、BMS、诺华、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis/Viracta、LifEngine Animal Health Laboratories Inc. 和 Lentigen 的研究资助。SSK 参与了与 Kite/Gilead、Calibr、Luminary Therapeutics、Humanigen、Juno/BMS、Capstan Bio 和诺华的顾问会议。SSK 曾在 Humanigen 和 Carisma 的数据安全与监查委员会任职。SSK 曾担任 Torque、Calibr、诺华、Capstan Bio、BMS、Carisma 和 Humanigen 的顾问。CMS 和 SSK 是本方案所产生的知识产权的发明人。

基因编辑已成为研究治疗耐药机制以及设计新型CAR-T细胞疗法以提高CAR-T细胞持久性和活性的强大工具16,17,26尽管一些基因编辑策略已在临床前模型和临床试验中显示出对CAR-T细胞活性的改善作用，但仍需进一步优化基因编辑策略。为满足这一需求，研究人员已开始在CAR-T细胞中开展靶向CRISPR筛选15,16然而，这种方法会因依赖先前已发表的策略而引入偏差。在此，我们描述了一种用于完成 体外 在CAR-T细胞中进行全基因组CRISPR敲除筛选。该方法可无偏倚地鉴定出可通过编辑以增强CAR-T细胞活性的基因和信号通路。尽管全基因组CRISPR筛选是一项极具前景的技术工具，但在原代细胞中开展此类筛选仍面临多项挑战。
例如，为了有效构建一个全基因组范围的CRISPR...

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法在治疗B细胞恶性肿瘤方面已显示出显著疗效；然而，持久应答率仅限于30-40%1,2,3,4,5。尽管研究人员已开发并测试了多种策略以应对CART细胞疗法的耐药机制，包括优化CAR结构设计、基因编辑以及联合治疗方案，但耐药性的发生机制仍 largely 未知。近期越来越多的证据表明，输注前CART细胞产品的基线基因表达谱是决定CART疗法毒性和疗效的重要因素6,7,8,9。因此，在CART细胞制备过程中进行基因编辑已成为提高CART细胞治疗成功率的常用策略。
例如，我们实验室先前的研究表明，利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）Cas9 技术敲除粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，可增强 CART 细胞活性，并减轻 CART 相关毒性的症状10,11,12。此外，基于 CRISPR 技术改造的细胞疗法已在临床试验中得到验证，展现出良好的有效性和安全性13。综上表明，CRISPR 基因编辑技术不仅有助于深入理解 CART 细胞的生物学特性，还可推动具有临床转化潜力的 CART 细胞产品的开发。
全基因组范围的CRISPR敲除筛选已成为癌症生物学研究中日益流行的工具，用于解析治疗耐药性的机制。在该技术中，将数以万计的向导RNA（gRNA）递送至细胞池中，使每个细胞通常仅携带一种gRNA14。随后，细胞经历施加选择压力的条件，其中携带靶向必需基因gRNA的细胞死亡，而携带靶向抑制性基因gRNA的细胞则存活并增殖。通过使用高通量测序技术，我们可以确定在整个CRISPR筛选过程中gRNA丰度的变化情况14。
然而，在原代细胞（如 CART 细胞）中实现全基因组范围的基因扰动，其所需规模和筛选时间可能难以完成。因此，研究团队已采用靶向 CRISPR 筛选策略，以进一步解析治疗耐药的机制15,16靶向筛选在原代细胞中通常更容易完成，因为其文库较小，达到足够文库代表性的细胞数量需求较少。尽管这些研究加深了我们对CAR-T细胞治疗耐药机制的理解，但靶向筛选由于基因靶点的人工选择而引入了偏差。本文旨在描述一种完成全基因组筛选的方法 体外 健康供体来源的CAR-T细胞全基因组CRISPR敲除筛选。该高通量方法可高效、无偏倚地鉴定出可编辑的关键通路和基因，从而改善治疗应答17,18,19.
特别是，本文所述方案旨在通过完成全基因组范围的CRISPR敲除筛选，以增进领域内对CART细胞耗竭机制的理解 体外 耗竭模型。耗竭是一种功能失调的CART细胞命运，已被证实与CART细胞治疗无应答相关20,21,22这种细胞命运已知受表观遗传调控，其特征表现为CART细胞增殖能力下降、效应细胞因子产生减少以及抑制性受体表达增加。23在以往的研究中，通过上调或下调关键基因，基因编辑已能够阻止耗竭状态的发展。24,25,26鉴于CART细胞在耗竭过程中增殖能力下降，且已有证据表明基因编辑可预防其发生，我们据此建立了模型 体外 全基因组CRISPR敲除筛选该细胞命运。然而，未来可对该方案进行修改，以探索对CART细胞治疗耐药的其他机制。

<table><tbody><tr><td>293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>用于慢病毒生产的细胞</td></tr><tr><td>生物素化 ProteinL 抗体</td><td>GenScript</td><td>M00097</td><td>用于 CAR 检测的抗 kappa 链抗体</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>羧苄西林二钠盐</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1389-1G</td><td>羧苄西林抗生素</td></tr><tr><td>CD4 分离磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD8 分离磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td>NC2279958</td><td></td></tr><tr><td>无 DNase 水</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 T 细胞分离试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951RF</td><td>阴性分离试剂盒</td></tr><tr><td>Endura 电转感受态细胞&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60242-1</td><td>含复苏培养基的电转感受态细胞</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>GeCKO v2 CRISPR 敲除混合文库 A</td><td>AddGene</td><td>1000000048</td><td>CRISPR 文库质粒</td></tr><tr><td>Gene Pulser II&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105</td><td>电穿孔仪</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Millipore Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>CD19&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 靶细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 转染试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000075</td><td>包含转染试剂（Lipofectamine 3000 试剂）和中性共脂质试剂（p3000）的转染试剂盒</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7851</td><td>密度梯度介质</td></tr><tr><td>Macherey-Nagel NucleoBond Xtra Maxi 试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12748412</td><td>大提试剂盒</td></tr><tr><td>NEBNext 高保真 2X PCR 预混液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541S</td><td>高保真 PCR 预混液</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td>AddGene</td><td>22036</td><td>慢病毒包装质粒</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X）</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>AddGene</td><td>12259</td><td>表达 VSV-G 包膜的质粒</td></tr><tr><td>混合人 AB 血清&amp;nbsp;</td><td>Innovative Research</td><td>ISERABHI</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>凝胶回收试剂盒</td></tr><tr><td>Quick-DNA Midiprep Plus 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4075</td><td>用于分离基因组 DNA 的试剂盒</td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>自动化细胞分离仪</td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所 1640 培养基（RPMI）</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td>密度梯度分离管</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>71448-16</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素抗体（PE）</td><td>BioLegend</td><td>405203</td><td>用于 CAR 检测的二抗</td></tr><tr><td>T100 梯度 PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机（Optima XPN-80）</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>真空滤器系统，0.22 &amp;micro;m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>567-0020</td><td></td></tr><tr><td>真空滤器系统，0.45 &amp;micro;m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165-0045</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>造血细胞培养基</td></tr></tbody></table>

在嵌合抗原受体t细胞中进行体外全基因组crispr敲除筛选

Performing an In Vitro Genome-Wide CRISPR Knockout Screen in Chimeric Antigen Receptor T Cells

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法是一种创新的靶向免疫治疗形式，已彻底改变了癌症的治疗方式。然而，持久的治疗反应仍然有限。最近的研究表明，输注前CART细胞产品的表观遗传景观可能影响对治疗的反应，因此有人提出基因编辑可作为解决方案。但要确定最佳的基因编辑策略，仍需开展更多工作。全基因组CRISPR筛选已成为研究耐药机制和优化基因编辑策略的常用工具。然而，将其应用于原代细胞仍面临诸多挑战。本文介绍了一种利用健康供体来源的CART细胞进行全基因组CRISPR基因敲除筛选的方法。作为概念验证模型，我们设计该方法用于研究靶向CD19抗原的CART细胞耗竭的形成过程。但我们认为，该方法也可用于探究不同CAR结构和肿瘤模型中多种治疗耐药机制。

为了以无偏倚的方式探究可被编辑以增强CAR-T细胞活性的基因和通路，我们设计了一项 体外 全基因组CRISPR敲除筛选图1）。该筛选包含两个阶段：CART 细胞生成阶段和选择性压力阶段。在 CART 细胞生成阶段，至少需要 110 × 106 首先从健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离T细胞，并使用CD3激活+/CD28+ 珠粒。次日，于 第1天，以 MOI 为 3.0 加入 CAR 慢病毒，以生成靶向 CD19 抗原的 CAR T 细胞（CART19 细胞）。在 第2天，将CRISPR文库慢病毒以0.3的感染复数（MOI）加入CART细胞中。从 第3天-8，CAR-T 细胞维持在 1 × 10 的浓度6 每毫升 TCM 中加入浓度为 1 µg/mL 用于筛选成功转导CRISPR文库慢病毒的细胞。...

本文描述了一种应用于 体外 健康供体嵌合抗原受体T细胞中用于耗竭模型的全基因组CRISPR敲除筛选

在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

嵌合抗原受体T（CART）细胞疗法是一种创新的靶向免疫治疗形式，已彻底改变了癌症的治疗方式。然而，……

CAR T细胞疗法是一种创新的癌症免疫疗法，已实现持续超过十年的缓解。然而，持久应答的比率仍然有限。通过本方案，我们旨在加深对耐药机制的理解，并开发出提高CAR T细胞疗法应答率的工具。目前，人们正在采用多种方法来改进CAR T细胞治疗，包括联合疗法和优化CAR设计。然而，由于越来越多的证据表明，输注前CAR T细胞产品的表观遗传特征是决定治疗反应的重要因素，因此基因编辑技术已成为常用工具。CAR T细胞的基因组编辑在临床前和临床研究中已显示出预防毒性并增强CAR T细胞扩增和持久性的效果。我们提供的全基因组CRISPR敲除筛选方案，为确定最优的基因编辑策略以改善CAR T细胞功能提供了一种高效且无偏倚的方法。全基因组范围的基因扰动需要大规模且充分的选择条件才能有效。为了研究CAR T细胞耗竭的发生过程，我们了解到必须刺激超过8000万个CAR T细胞持续两周，以筛选出最佳的基因编辑。 尽管本实验方案旨在评估耗竭现象的发展过程，但该方案也可调整用于评估其他耐药机制的形成。通过在不同条件下开展全基因组筛选，我们最终有望确定最佳的基因编辑策略，以增强对CAR T细胞治疗的整体应答效果。[旁白] 将CAR T细胞用CRISPR文库转导后，在4摄氏度下以300g离心5分钟，洗涤细胞。吸除上清液，并将细胞重悬于20毫升T细胞培养基中。为保存样本用于下一代测序，将足量的CAR T细胞分装至一个50毫升锥形管中，以维持每条向导RNA对应500个细胞的向导RNA代表性。在4摄氏度下以300g离心5分钟。然后将细胞沉淀重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并转移至一个2毫升微量离心管中。用1毫升PBS洗涤50毫升锥形管，并将洗涤液转移至同一微量离心管中。随后在4摄氏度下以500g离心5分钟。去除上清液，并将细胞沉淀在-20摄氏度下保存。开始共培养时，按1:1的比例将CAR T细胞加入CD19阳性的JeKo-1细胞中。用T细胞培养基将共培养体系总体积补至160毫升，并将样本置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中培养。为重新刺激CAR T细胞，将共培养物收集至50毫升锥形管中，在4摄氏度下以300g离心5分钟。将每份样本重悬于80毫升T细胞培养基中，并加入80 × 10⁶个JeKo-1细胞（溶于80毫升T细胞培养基中）。将样本置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中培养。第15天，为从共培养体系中分离CAR T细胞，首先对细胞进行计数。联合使用CD4阳性T细胞阳性分选试剂盒和CD8阳性T细胞阳性分选试剂盒，从CAR T细胞与JeKo-1细胞的共培养物中分离T细胞。然后对分离得到的T细胞进行计数。为保存样本用于下一代测序，将33 × 10⁶个CAR T细胞分装至一个50毫升锥形管中，在4摄氏度下以300g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于1毫升PBS中，并转移至一个2毫升微量离心管中。随后用1毫升PBS洗涤50毫升锥形管，并将洗涤液转移至同一微量离心管中。离心后去除上清液，将细胞沉淀在-20摄氏度下保存。首先，使用基因组DNA提取试剂盒从冷冻保存的CAR T细胞沉淀中提取基因组DNA。通过乙醇沉淀法纯化提取的基因组DNA：先将100%乙醇预冷至-20摄氏度。将洗脱的DNA等量分装至多个微量离心管中，确保每份体积为200至250微升。加入两倍体积的预冷100%乙醇、0.1倍体积的3摩尔醋酸钠溶液以及1微升浓度为20毫克/毫升的糖原。将样本在-20摄氏度下孵育过夜。第二天，在13,000g下离心20分钟，使沉淀的DNA形成沉淀。吸除上清液，用1毫升70%乙醇在7,500g下离心10分钟洗涤沉淀。将沉淀完全干燥后，将其重悬于50微升无菌水中。为准备用于下一代测序的基因组DNA，按照所示的特定反应体系配制PCR反应。然后按照以下循环条件进行PCR扩增。收集每份样本的PCR反应产物，并根据制造商说明书使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。将每份样本的3微克PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。根据制造商说明书，使用凝胶回收试剂盒切胶并提取目标PCR产物。将提取后的样本在-20摄氏度下保存。

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基于液滴的单细胞水平评估嵌合抗原受体T细胞毒性的检测方法

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