Name: 治疗剂与聚乙烯醇包衣医疗器械偶联的验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 了解蛋白质治疗剂与聚乙烯醇包衣医疗器械的偶联方法，用于实现局部药物递送并减少全身副作用。该技术可降低用药剂量和治疗成本，为生物医学工程领域提供新型治疗策略。

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本研究由 R. Keith White 医学博士通过外科系 John C. McDonald 讲席基金、W. Reid Grimes 医学博士通过外科系 Whitney Boggs 捐赠教授职位基金以及 LSU LIFT2 拨款 HSCS-2022-LIFT-002 资助。

注意：第1节和第2节需同时进行。对扩张套管和24孔板同时进行PVA包被及PVA膜交联，以确保二者同时准备就绪，从而利用24孔板建立标准曲线，通过吸光度计算每个套管中GLP-2的浓度。
1. 制备GLP-2包被的IES和VES装置
<ol>
	<li>将5 g PVA加入100 mL去离子水中配制5% PVA溶液。为促进溶解，可考虑在加热板上搅拌。然后，将1 mg GLP-2加入1 mL去离子水中配制1 mg/mL GLP-2溶液。</li>
	<li>预先将肠管扩张套管和阴道扩张套管套在玻璃移液管上，并用剪裁成合适尺寸的塑料移液管头紧固在玻璃移液管上，以稳定套管两端。</li>
	<li>使用小号画笔将预先配制的5% PVA溶液涂覆于预收缩的套管上。每涂覆一层PVA后，在室温（RT）下静置干燥10分钟，随后进行下一层涂覆，每根套管共涂覆5层PVA。</li>
	<li>5分钟后th 涂层干燥后，将预收缩的套管置于化学安全通风橱内的干燥器中，使其在室温下交联。通过在干燥器内两个独立的敞口烧杯中分别加入3 mL 25%戊二醛和3 mL 94%–98%硫酸，利用其挥发的蒸气引发交联反应，使PVA膜交联到套管表面。</li>
	<li>在腔室内交联袖套48小时后，将其从腔室中取出，并让戊二醛在15分钟内从袖套上挥发干净。</li>
	<li>然后，用移液器小心地将50 µL的1 mg/mL GLP-2溶液加到每个预收缩套管上。在室温下静置干燥30分钟，随后将预收缩套管从玻璃移液管上取下，并分别放入24孔板的对应孔中。</li>
</ol>
2. 制备GLP-2包被的24孔板
<ol>
	<li>为制备GLP-2与PVA结合的标准曲线，将50 µL的5% PVA溶液加入24孔板中预定使用的18个孔的底部。保留6个孔为空，用于放置IES和VES装置（每种装置各3个孔）。</li>
	<li>将24孔板置于120 °C的烘箱中过夜，使PVA层完全干燥。</li>
	<li>将24孔板放入化学安全通风橱内的干燥器中，在室温下交联48小时。通过向两个独立的敞口烧杯中分别加入3 mL 25%戊二醛和3 mL 94%-98%硫酸，使产生的蒸气在密闭腔室内反应，从而促使PVA在24孔板表面发生交联。</li>
	<li>交联48小时后，将24孔板从干燥器中取出，静置15分钟，使戊二醛蒸气完全挥发。</li>
	<li>随后，通过向已标记的孔中分别加入250 µL、100 µL、50 µL、25 µL和0 µL的1 mg/mL GLP-2溶液，建立浓度梯度，形成每种GLP-2浓度（250 µg、100 µg、50 µg、25 µg和0 µg）各3个重复孔的24孔板，并为每种套管（IES和VES）各保留3个孔。</li>
</ol>
3. 标准曲线的制备及判断袖状 GLP-2 浓度
<ol>
	<li>在将相应的GLP-2稀释液加入孔中并将药物包被的套管放入孔中后，将板置于4 °C冰箱中过夜，以使药物与套管充分结合。</li>
	<li>次日，每孔加入2 mL去离子水中配制的1 mg/mL脱脂奶粉封闭液，封闭1 h。封闭后，用PBS洗涤每孔3次，每次5 min。</li>
	<li>将40 µL兔抗GLP-2抗体加入50 mL去离子水中，配制兔抗GLP-2抗体溶液。然后，向24孔板的每孔中加入2 mL该兔抗GLP-2抗体溶液，并在4 °C冰箱中过夜孵育。</li>
	<li>一次抗体孵育结束后，再次用PBS洗涤每孔3次，每次5 min。通过将20 mL二抗（山羊抗兔IgG碱性磷酸酶标记抗体）加入40 mL去离子水中，配制二抗溶液。然后向每孔加入2 mL二抗溶液，在室温下孵育2 h。</li>
	<li>吸去二抗溶液，并用PBS再洗涤每孔3次，每次5 min。随后，向每孔加入碱性磷酸酶蓝色微孔底物溶液。</li>
	<li>在室温下反应20 min，使与二抗偶联的碱性磷酸酶与底物发生反应。反应过程中，注意观察溶液颜色由黄色逐渐变为蓝色。</li>
	<li>用移液器从每孔中吸取200 µL反应液转移至与24孔板标记相同的96孔板中，以终止反应。一旦含有与碱性磷酸酶偶联的PVA膜的24孔板中的试剂被移除，反应即停止，颜色不再变化。</li>
	<li>使用酶标仪在620 nm波长下读取96孔板的吸光度值，绘制标准曲线，并计算PVA包被套管上GLP-2的浓度。</li>
</ol>

Localized Delivery of GLP-2 via PVA-Coated Medical Devices for Therapeutic Use

<ol><li>Conner, K. P., Devanaboyina, S. C., Thomas, V. A., Rock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biodistribution+of+therapeutic+proteins%3A+Mechanism%2C+implications+for+pharmacokinetics%2C+and+methods+of+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">The biodistribution of therapeutic proteins: Mechanism, implications for pharmacokinetics, and methods of evaluation.</a> Pharmacol Ther. 212, 107574(2020).</li>
<li>Ebrahimi, S. B., Samanta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-based+therapeutics+through+structural+and+chemical+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-based therapeutics through structural and chemical design.</a> Nat Commun. 14 (1), 2411(2023).</li>
<li>Senst, B., Goyal, A., Basit, H., Borger, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSenst%2C+B+%22Drug+Eluting+Stent+Compounds%22">Drug Eluting Stent Compounds</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2024).</li>
<li>Shan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+drug+delivery+via+biodegradable+ureteral+stent+for+the+treatment+of+upper+tract+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advances in drug delivery via biodegradable ureteral stent for the treatment of upper tract urothelial carcinoma.</a> Front Pharmacol. 11, 224(2020).</li>
<li>Zhu, C., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+overview+of+glucagon-like+peptide-2+analog+trophic+therapy+for+short+bowel+syndrome+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med+Res%22%5BJournal%5D)">An updated overview of glucagon-like peptide-2 analog trophic therapy for short bowel syndrome in adults.</a> J Int Med Res. 50 (3), 3000605221086145(2022).</li>
<li>Clayton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-expanding+intestinal+expansion+sleeves+%28IES%29+for+short+gut+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Self-expanding intestinal expansion sleeves (IES) for short gut syndrome.</a> Pediatr Surg Int. 38 (1), 75-81 (2022).</li>
<li>Rosete, B. E., Wendel, D., Horslen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teduglutide+for+pediatric+short+bowel+syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Teduglutide for pediatric short bowel syndrome patients.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (7), 727-733 (2021).</li>
<li>Novel Intestinal Expansion Sleeve (IES): promoting distraction enterogenesis in a live animal model. Colvin, J. C., et al. 39th Southern Biomedical Engineering Conference, , (2023).</li>
<li>Kim, K. J., Lee, S. B., Han, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+crosslinking+reaction+of+PVA+membrane+with+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Chem+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetics of crosslinking reaction of PVA membrane with glutaraldehyde.</a> Korean J Chem Eng. 11 (1), 41-47 (1994).</li>
<li>Hamidi, M., Azadi, A., Rafiei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+nanoparticles+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogel nanoparticles in drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 60 (15), 1638-1649 (2008).</li>
<li>Chong, S. F., Smith, A. A., Zelikin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured%2C+functional+PVA+hydrogels+through+bioconjugation+with+oligopeptides+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microstructured, functional PVA hydrogels through bioconjugation with oligopeptides under physiological conditions.</a> Small. 9 (6), 942-950 (2013).</li>
<li>Jensen, B. E., Dávila, I., Zelikin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28vinyl+alcohol%29+physical+hydrogels%3A+Matrix-mediated+drug+delivery+using+spontaneously+eroding+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Poly(vinyl alcohol) physical hydrogels: Matrix-mediated drug delivery using spontaneously eroding substrate.</a> J Phys Chem B. 120 (26), 5916-5926 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teduglutide+for+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+Prescr%22%5BJournal%5D)">Teduglutide for short bowel syndrome.</a> Aust Prescr. 43 (2), 72-73 (2020).</li>
</ol>

Jonathan Steven Alexander 和 Christen J. Boyer 持有专利 US10537659B2（2017 年），即聚乙烯醇三维打印医疗器械及其活化方法。其余作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种将基于蛋白质的治疗剂（如GLP-2）结合到聚乙烯醇（PVA）包被并交联的医疗器械上的方法。通过在PVA包被的24孔板上加入兔抗GLP-2抗体、山羊抗兔IgG碱性磷酸酶以及碱性磷酸酶蓝色微孔底物，建立标准GLP-2浓度曲线，从而测定结合的GLP-2浓度。与碱性磷酸酶酶偶联的二抗可催化添加的碱性磷酸酶蓝色微孔底物发生反应，该底物初始呈黄色，当与抗体结合的碱性磷酸酶发生反应后转变为蓝色。该颜色变化在620 nm波长处测定吸光度，用于生成图2中的标准曲线，并根据样品的吸光度计算结合了GLP-2的IES和VES器械的浓度。在向这些PVA包被的器械中加入50 µg GLP-2后，有45%的给药量被成功结合到器械上。
在本方案中，关键步骤是交联步骤。经聚乙烯醇（PVA）包被的医疗器械需在密闭容器中放置超过48小时，以使25%戊二醛和94%–98%硫酸蒸气将PVA交联固定于器械表面。该交联过程可使带有反应性基团的PVA膜形成稳定的生物活性表面，从而结合基于蛋白质的治疗剂，实现靶向药物递送。涂层次数选择5次是基于经验确定的，因为1–2次涂层后器械在1小时内即重新膨胀，3次涂层后在24小时内重新膨胀，而我们希望器械能在数天内逐步重新膨胀，以提供持续的牵张力，用于肠道和阴道扩张。IES和VES器械的表面积为9.425 cm2，与其微小尺寸相比，具有结合大量治疗剂的潜力。如果交联步骤失败，PVA膜的稳定性将下降，保留生物共轭治疗剂的能力也会降低，如图3中IES 2所示。
将基于蛋白质的治疗剂共价结合到PVA涂层的医疗器械上，可实现这些药物在目标部位的局部化和高浓度递送，同时避免全身给药及其相关的成本和脱靶效应。目前，所有患者的特立帕肽常规剂量为每日50 µg/kg13。由于每根套管携带22 µg/cm2，单个装置所含药物剂量约为全身剂量的44%。考虑到其外表面积为9.425 cm2，这些套管能够实现213.85 µg GLP-2的局部递送，剂量是全身给药的4.3倍，并集中于目标区域。靶向递送可通过绕过全身给药需求而减少药物使用量。目前，按每日50 µg/kg剂量计算，特立帕肽的年治疗费用为295,000美元5。通过将特立帕肽偶联至套管，所需药物剂量应可降低，同时最小化全身性副作用。特立帕肽常见的副作用包括腹痛（28%）、注射部位反应（26%）、恶心（26%）、腹部胀气（17%）、头痛（16%）和呕吐（14%）13。
本研究的一个局限性在于GLP-2从生物偶联的PVA涂层医疗器械中缓释的药效学和药代动力学特性。目前的试验已证实GLP-2可以结合到交联PVA装置上，但我们尚不清楚药物在从PVA膜释放前能保持结合状态的时间长短，以及从植入部位释放的GLP-2总量的程度。已知经过多次洗涤步骤后，GLP-2仍能附着在装置上，但其与装置结合的程度以及这种结合对释放行为的影响仍不明确。在后续研究中，可通过检测储存于生物流体中的IES和VES上清液中的释放量来模拟体内释放情况，或在体内植入后不同时间点回收这些装置，以测定残留的GLP-2含量。此外，我们计划评估pH值、温度和湿度等因素是否会影响药物从装置中的稳定性和释放速率。未来的实验可通过植入生物偶联PVA套管，并在不同时间点及不同设定条件下测量套管周围药物浓度来确定这些影响。由于尚未明确PVA涂层套管的药效学特性，我们无法判断局部GLP-2给药与常规全身给药相比的效果差异。同时，PVA涂层套管的最大结合容量仍不清楚。在加入50 µg药物后，发现有45%的添加药物仍结合在套管上，这可能意味着我们已经超过了其最大结合容量。因此，有必要在后续研究中向每个套管添加不同浓度的GLP-2，以确定这些装置的真实最大结合容量以及不同剂量下的释放速率。
在此，我们验证了将治疗性分子偶联到聚乙烯醇（PVA）涂层医疗器械上的能力。结果显示，所添加的GLP-2中有44%共价结合到了IES和VES装置上，从而实现了以高浓度对GLP-2等基于蛋白质的治疗剂进行局部递送。局部药物递送有望降低治疗成本、提高可及性并减少副作用。该方法可应用于目前数百种基于蛋白质的治疗剂，以增强局部药物递送效果，改善治疗结局。

基于蛋白质的治疗剂，如酶、抗体、细胞因子、激素和生长因子，已被证明在治疗多种疾病方面具有高度有效性1。如果我们能够加深对如何递送这些治疗剂的理解，就有可能显著推动将这些物质作为药物或医学治疗手段的生物技术发展1。蛋白质治疗剂的疗效受限于其体内分布、成本以及脱靶效应。已有多种方法被尝试用于改善蛋白质治疗剂的药代动力学和药效学特性，包括聚乙二醇化（PEGylation）、糖基化、脂质化以及与其他蛋白质融合2。另一个关注点是“靶向性”，因为目前大多数蛋白质治疗剂具有多个作用位点，从而导致脱靶效应。具体而言，将这些药物靶向递送至预期作用部位，可能降低所需的治疗剂量并减少副作用2。如果能够将药物递送限制在预期的作用部位，或许可以显著提高治疗效果，同时限制这些药物不必要的“脱靶”副作用。
目前已有多种含有治疗药物的医疗器械投入使用，例如带有抗增殖药物涂层的药物洗脱支架，其涂层包含氯吡格雷（clopidogrel）、长春新碱（vincristine）和长春碱（vinblastine），有助于预防心脏导管插入术后发生再狭窄以及重复血运重建的需求3。此外，已研发出携带紫杉醇（paclitaxel）、多柔比星（doxorubicin）、吉西他滨（gemcitabine）及其他抗增殖剂的可生物降解药物洗脱输尿管支架，用于治疗上尿路尿路上皮癌4。随着这类支架的降解，抗肿瘤药物以受控方式在局部释放，可在无需额外给药的情况下延长药物递送时间4。该方法可使抗肿瘤药物在靶向作用部位持续发挥长期效应，同时避免全身暴露，限制药物对非肿瘤细胞的作用，并降低药物毒性。此外，支架的可生物降解特性还可避免后续取出支架的手术操作4。
短肠综合征（SBS）是另一种使用基于蛋白质的治疗手段已显示出对患者显著改善的疾病5。SBS 可由多种机制引起，但最终导致肠道长度不足，从而引发吸收不良和营养不良。在考虑手术治疗该疾病之前，可使用如胰高血糖素样肽-2（GLP-2）类似物等疗法5。人源 GLP-2 是一种全身性营养肽类激素，由远端小肠和结肠的 L 型内分泌细胞产生。GLP-2 可促进肠隐窝细胞增殖，推动受损黏膜修复，抑制肠上皮细胞凋亡，并改善肠道血液供应5。GLP-2 类似物（如替度鲁肽）已被批准用于1岁及以上 SBS 患者的治疗，以促进肠道自然适应过程6。在自然情况下，肠道适应可能需要数年时间，表现为胃排空延迟以延长吸收时间，以及肠道扩张导致管腔直径增加，从而增大吸收表面积7。GLP-2 类似物具有与天然 GLP-2 相同的药理活性，同时结构更稳定，因而半衰期更长，对靶点的亲和力更强5。目前，替度鲁肽的年治疗费用为29.5万美元，患者每日剂量为0.05 mg/kg5。替度鲁肽的不良反应包括恶心、呕吐、腹泻、腹痛、体重减轻、胃肠道息肉以及现有肿瘤的生长加快5。
此前，我们的实验室已证明，使用肠道扩张套管（intestinal expansion sleeve, IES）（图1) 能够使小肠立即延长 36.2% 离体 小肠在一个月的置入后延长了30.2% 体内6,8该装置有望成为短肠综合征（SBS）患者的一种治疗手段，可缩短其对肠外营养的依赖时间。通过将治疗性药物与IES装置进行生物偶联，可进一步提升牵张诱导小肠再生的能力，例如将肠道黏膜生长激动剂GLP-2添加至该装置中。聚乙烯醇（PVA）膜是一类亲水性聚合物，可通过将PVA溶解于水中，浇铸于结构支撑材料上，再以硫酸为催化剂，用戊二醛交联而制备。9这些水凝胶纳米颗粒已显示出作为药物递送系统的潜力，其机制包括药物扩散、水凝胶基质溶胀以及药物/基质的化学反应性。10聚乙烯醇（PVA）因其优异的生物相容性和安全性，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人体临床应用。11PVA 聚合反应产生可实现生物偶联的端基12.
IES/VES 装置的长度为 3 cm，外表面积为 9.425 cm2，可包覆 PVA 膜。这些 PVA 膜可与 GLP-2 进行生物偶联，从而实现治疗剂的局部化和高浓度递送。通过降低药物所需剂量并避免全身给药，可规避治疗带来的不良靶外效应。这种方法可通过减少用药剂量来降低昂贵药物的成本，同时药物的缓释特性还可减少给药频率，进一步节约费用。在 IES 装置表面包覆 GLP-2 可降低所需剂量、减轻患者经济负担、避免全身给药、防止治疗的不良反应，并持续向靶部位递送药物。本报告评估了像 GLP-2 这类治疗性蛋白能否以具有生理学意义的数量共价结合到 IES/VES 等医疗器械上，从而在避免脱靶效应的同时，实现药物的局部治疗优势。

<table><tbody><tr><td>抗兔IgG（完整分子）&amp;ndash;山羊来源的过氧化物酶标记抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545-1ML</td><td></td></tr><tr><td>BluePhos 微孔板底物试剂盒</td><td>Sera Care</td><td>5120-0059</td><td></td></tr><tr><td>GenClone 25-107，24孔细胞培养板，平底孔，TC处理，每单位100块</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>GLP-2 重组兔单克隆抗体 (3K3P5)</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>MA5-42869</td><td></td></tr><tr><td>胰高血糖素样肽-2 (GLP-2) (1-33)，大鼠来源</td><td>Echelon Biosciences</td><td>195262-56-7</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛，25% 水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 聚丙烯干燥器，带活塞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>硫酸（痕量金属级），Fisher Chemical</td><td>Fischer Scientific</td><td>A510-P212</td><td></td></tr></tbody></table>

聚乙烯醇涂层医疗器械上治疗剂偶联的验证

Validation of Therapeutic Agent Conjugation to Polyvinyl Alcohol-Coated Medical Devices

基于蛋白质的治疗药物通常受限于其给药途径，且难以将其限制在作用部位。我们开发的一种创新方法是将蛋白质治疗药物共价结合到医疗器械上，从而实现这些药物在目标作用部位的局部化和高浓度递送。本研究旨在评估胰高血糖素样肽-2（GLP-2）是否能够以具有临床相关性和可测量的数量，共价结合到阴道扩张套管（VES）和肠道扩张套管（IES）装置上。
采用聚乙烯醇（PVA）对扩张套管进行包被，并用戊二醛/硫酸蒸气交联，以形成可化学结合含胺类治疗药物（如GLP-2）的活性表面。通过将250 µg、100 µg、50 µg、25 µg和0 µg的GLP-2分别结合至24孔板中PVA包被的孔内，建立标准曲线。ELISA标准曲线的建立采用兔抗GLP-2抗体作为一抗，随后使用碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG二抗及碱性磷酸酶蓝色微孔底物进行显色。比色法检测（在620 nm处由黄色变为蓝色）的吸光度与结合的GLP-2抗体浓度成正比，从而可计算出PVA包被套管上结合的GLP-2浓度。向IES/VES装置中加入50 µg GLP-2后，其在外部IES/VES表面积（9.425 cm2）上平均结合量为22.69 ± 9.32 µg/cm2，表明所添加GLP-2中有44%被固定于PVA包被的IES/VES套管表面。
目前人源GLP-2的给药剂量为50 µg/Kg。由于每根套管含有22 µg，这相当于单个装置中约44%的全身剂量。该方法使得仅需添加显著更低剂量的治疗剂即可达到与GLP-2药物全身给药相同的效果，同时避免了全身性作用。

本方案描述了使用聚乙烯醇（PVA）对 IES 和 VES 装置进行包被和交联，以实现 GLP-2 的偶联。图2展示了用于确定每个装置上 GLP-2 浓度的标准曲线。图3展示了每个 IES 和 VES 装置的 GLP-2 浓度，以及用于标准曲线的各孔中的浓度。套管的平均 GLP-2 浓度为 22.69 ± 9.32 µg/cm2,，与 24 孔板中 50 µg 孔的浓度相对应，该孔的 GLP-2 浓度为 23.7 µg/cm2。这表明加入 50 µg 的 GLP-2 后，有 45% 的药物仍结合在 PVA 包被的医疗器械上。
<img alt="大鼠小肠再生示意图；IES法用于肠道延长的手术过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67358/67358fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：IES的植入示意图。该图展示了在大鼠模型中肠道扩张套管的体内植入过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67358/67358fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GLP-2浓度与吸光度的标准曲线图，显示稀释度和线性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67358/67358fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：标准曲线。 本图显示使用折线图生成的标准曲线，其方程为：Y = mx + b，其中Y表示在620 nm处的吸光度，x表示浓度，m = 0.0118，B = 0.0734，R2 = 0.966。24孔板的表面积为1.93 cm2,，因此250 µg、100 µg、50 µg、25 µg和0 µg孔中的GLP-2浓度分别为125.95 µg/cm2、66.38 µg/cm2、23.77 µg/cm2、14.58 µg/cm2和0.00 µg/cm2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67358/67358fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GLP-2 浓度柱状图；数据比较；μg/cm² 单位；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67358/67358fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：各装置及其对应孔中的 GLP-2 浓度。 本图展示了为每个 IES 和 VES 装置以及用于绘制标准曲线的 24 孔板各孔所测定的浓度。在向每个套管（外表面积为 9.425 cm2）中加入 50 µg GLP-2 后，结合到装置上的 GLP-2 量为 22.69 ± 9.32 µg/cm2，相当于标准曲线中 50 µg 孔对应的 23.7 µg/cm2。向这些套管中加入 50 µg GLP-2 后，经多次洗涤，仍有 45% 的给药量结合在装置上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67358/67358fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种通过将蛋白质治疗剂偶联到涂覆在医疗器械上的聚乙烯醇膜上，从而对医疗器械进行蛋白质治疗剂衍生化的实验方案。将基于蛋白质的治疗剂进行偶联可实现局部化和高浓度递送，是一种经济高效的方法，仅需极低剂量的药物即可完成给药，同时最大限度地减少脱靶效应。

基于蛋白质的治疗药物通常受限于其给药途径，且难以将其限制在作用部位。一种创新的……

我们的研究主要围绕肠道扩张套管和阴道扩张套管展开，这两种装置均可提供牵张力，已被证明可显著延长肠道和阴道腔道。我们希望通过在装置上添加基于蛋白质的治疗剂，进一步优化其性能，以减轻装置植入后局部的炎症反应和纤维化。通过将这些治疗剂直接结合到装置表面，我们能够避免全身给药，实现对目标区域的局部精准给药。这种定位给药方式将实现更低的药物剂量，降低全身性副作用的风险，同时降低治疗成本。未来，我们希望确定这些与PVA包被装置结合的基于蛋白质的治疗药物的释放速率，这对于确定不同类型治疗的药物剂量至关重要。首先，通过将五克聚乙烯醇（PVA）加入100毫升去离子水中，制备5%的聚乙烯醇（PVA）溶液。将混合物置于加热板上搅拌，以促进溶解。接着，通过将一毫克GLP-2加入一毫升去离子水中，配制浓度为一毫克每毫升的胰高血糖素样肽2（GLP-2）溶液。将肠扩张套管和阴道扩张套管预先收缩并套在玻璃移液管上，用剪裁过的塑料移液管紧密包裹在玻璃移液管及套管末端，以固定两端。使用小号画笔将5% PVA溶液涂在预收缩的套管上。每涂一层后，让套管在室温下干燥10分钟。第五层涂覆完成后，将预收缩的套管置于化学安全通风橱内的干燥器中。在干燥器中，将3毫升25%戊二醛和3毫升94%至98%硫酸分别加入两个敞口烧杯内，使蒸气反应，从而将PVA膜交联到套管上。交联48小时后，从干燥器中取出套管，并静置15分钟，使戊二醛挥发。随后，用移液器将50微升GLP-2溶液滴加至每个交联后的套管上，以备后续使用。为制备GLP-2与PVA结合的标准曲线，将50微升5% PVA移液至24孔板的18个孔底部。留出6个孔不加PVA，用于放置肠道扩张套管和阴道扩张套管，每种装置各用3个孔。将PVA层置于120摄氏度烘箱中过夜干燥。第二天，将24孔板放入化学安全通风橱内的干燥器中。在干燥器内的两个敞口烧杯中分别加入3毫升25%戊二醛和3毫升94%至98%的硫酸，使蒸气发生反应，从而将PVA膜交联到24孔板上。交联48小时后，从干燥器中取出24孔板，静置15分钟，使戊二醛完全挥发。接下来，通过将 250、150、25 和 0 微升的 1 毫克/毫升 GLP-2 溶液分别加入相应标记的孔中，建立浓度梯度。然后，将药物涂层的肠道和阴道扩张套管分别放入对应的孔中。在向各孔中加入相应浓度的 GLP-2 溶液以及药物涂层的肠道扩张套管和阴道扩张套管后，将 24 孔板置于 4 摄氏度冰箱中过夜，以使药物充分结合。第二天，向每个孔中加入2毫升浓度为1毫克/毫升的脱脂奶粉脱离子水封闭液，封闭1小时。封闭后，用PBS洗涤每个孔3次，每次5分钟。通过将40微升兔抗GLP-2抗体加入50毫升脱离子水中，配制兔抗GLP-2抗体溶液。然后，向每孔中加入两毫升抗体溶液。将板在4 °C下冷藏过夜。次日，用PBS洗涤每孔三次，每次洗涤五分钟。将20毫升抗兔IgG碱性磷酸酶二抗加入40毫升去离子水中，配制二抗溶液。每孔加入2毫升二抗溶液，室温孵育2小时。用PBS洗涤孔板后，每孔加入2毫升碱性磷酸酶蓝色微孔底物溶液，孵育20分钟。孵育过程中，观察反应体系颜色由黄色变为蓝色。通过移液枪从每个孔中吸取200 µL溶液至已标记的96孔板中，以终止反应。使用吸光度酶标仪在620 nm波长下读取96孔板。生成标准曲线并计算PVA涂层套管上GLP-2的浓度。肠道扩张套管和阴道扩张装置的GLP-2浓度平均为22.69微克/平方厘米，与24孔板中50微克孔的浓度（23.7微克/平方厘米）相近。

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