Name: CUT and RUN 测序数据的介绍性分析和验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: 学习CUT&RUN测序数据的入门分析与验证方法，使用公开分析流程处理组蛋白修饰数据。该计算流程帮助生物信息学初学者理解染色质调控机制并开发个性化分析方案。

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所有插图均使用 BioRender.com 制作。CAI 感谢卵巢癌研究联盟早期职业研究者奖、Forbeck 基金会加速器资助以及明尼苏达卵巢癌联盟国家早期检测研究奖提供的支持。

Beginner-Friendly Single-Language Pipeline for CUT&RUN Data Analysis

<ol><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Curr Protoc Mol Biol. 126 (1), e85(2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChiP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChiP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Xu, S., Grullon, S., Ge, K., Peng, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+S+%22Stem+cell+transcriptional+networks%3A+Methods+and+Protocols%22">Stem cell transcriptional networks: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York, NY. (2014).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+sparse+enrichment+analysis+for+cut%26run+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by sparse enrichment analysis for cut&run chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+ontology%3A+Tool+for+the+unification+of+biology.+The+gene+ontology+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene ontology: Tool for the unification of biology. The gene ontology consortium.</a> Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).</li>
<li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+ontology+%28GO%29+database+and+informatics+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The gene ontology (GO) database and informatics resource.</a> Nucleic Acids Res. 32 (Database issue), D258-D261 (2004).</li>
<li>The Gene Ontology Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+ontology+resource%3A+20+years+and+still+going+strong%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The gene ontology resource: 20 years and still going strong.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D330-D338 (2019).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast2go%3A+A+universal+tool+for+annotation%2C+visualization+and+analysis+in+functional+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Blast2go: A universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).</li>
<li>Carbon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AmiGO%3A+Online+access+to+ontology+and+annotation+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AmiGO: Online access to ontology and annotation data.</a> Bioinformatics. 25 (2), 288-289 (2009).</li>
<li>Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gorilla%3A+A+tool+for+discovery+and+visualization+of+enriched+go+terms+in+ranked+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Gorilla: A tool for discovery and visualization of enriched go terms in ranked gene lists.</a> BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).</li>
<li>Huang Da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+Paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: Paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Huang Da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+david+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using david bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Ge, S. X., Jung, D., Yao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShinyGO%3A+A+graphical+gene-set+enrichment+tool+for+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ShinyGO: A graphical gene-set enrichment tool for animals and plants.</a> Bioinformatics. 36 (8), 2628-2629 (2020).</li>
<li>Tang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRplot%3A+A+free+online+platform+for+data+visualization+and+graphing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SRplot: A free online platform for data visualization and graphing.</a> PLoS One. 18 (11), e0294236(2023).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deeptools2%3A+A+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deeptools2: A next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+genome+browser+at+ucsc%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The human genome browser at ucsc.</a> Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).</li>
<li>Yu, F., Sankaran, V. G., Yuan, G. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26RUNTools+2.0%3A+A+pipeline+for+single-cell+and+bulk-level+CUT%26RUN+and+CUT%26Tag+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CUT&RUNTools 2.0: A pipeline for single-cell and bulk-level CUT&RUN and CUT&Tag data analysis.</a> Bioinformatics. 38 (1), 252-254 (2021).</li>
<li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26RUNTools%3A+A+flexible+pipeline+for+CUT%26RUN+processing+and+footprint+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CUT&RUNTools: A flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biol. 20 (1), 192(2019).</li>
<li>Chris Cheshire, C. -W., et al. Nf-core/cutandrun: Nf-core/cutandrun v3.2.2 iridium ibis. , At
 <a target="_blank" href="https://github.com/nf-core/cutandrun/tree/3.2.2">https://github.com/nf-core/cutandrun/tree/3.2.2</a> (2024).</li>
<li>Kong, N. R., Chai, L., Tenen, D. G., Bassal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+CUT%26RUN+protocol+and+analysis+pipeline+to+identify+transcription+factor+binding+sites+in+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A modified CUT&RUN protocol and analysis pipeline to identify transcription factor binding sites in human cell lines.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100750(2021).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, e46314(2019).</li>
<li>Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encode+blacklist%3A+Identification+of+problematic+regions+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The encode blacklist: Identification of problematic regions of the genome.</a> Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).</li>
<li>Deberardine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRgenomics+for+analyzing+high-resolution+genomics+data+in+R%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BRgenomics for analyzing high-resolution genomics data in R.</a> Bioinformatics. 39 (6), btad331(2023).</li>
<li>Deberardine, M., Booth, G. T., Versluis, P. P., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nelf+pausing+checkpoint+mediates+the+functional+divergence+of+cdk9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The nelf pausing checkpoint mediates the functional divergence of cdk9.</a> Nat Commun. 14 (1), 2762(2023).</li>
<li>Andrews, S. Fastqc: A quality control tool for high throughput sequence data. , At
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Krueger, F., James, F. O., Ewels, P. A., Afyounian, E., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrueger%2C+F+%22FelixKrueger%2FTrimGalore%3A+v0.6.7+-+DOI+via+Zenodo%22">FelixKrueger/TrimGalore: v0.6.7 - DOI via Zenodo</a>. , (2021).</li>
<li>Mcgaughey, D. Easy bam downsampling. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://davemcg.github.io/post/easy-bam-downsampling/">https://davemcg.github.io/post/easy-bam-downsampling/</a> (2018).</li>
<li>Positionbaseddownsamplesam (picard). , GATK Team. At
 <a target="_blank" href="https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360041850311-PositionBasedDownsampleSam-Picard">https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360041850311-PositionBasedDownsampleSam-Picard</a> (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

绘制蛋白质在染色质上占据情况的能力对于开展染色质生物学领域的机制研究至关重要。随着实验室采用新的湿实验技术对染色质进行分析，对这些湿实验产生的测序数据进行分析的能力已成为湿实验科研人员常见的瓶颈。因此，我们描述了一项入门级的分步操作方案，旨在帮助生物信息学初学者克服分析瓶颈，启动对其自身CUT&amp;RUN测序数据的分析及质量控制检查。
本CUT&amp;RUN分析方案描述了多个步骤的应用，以确保对真实信号进行定量。从原始测序数据中去除低质量读段和接头序列是质量控制的首要步骤之一，也是获得准确分析结果最关键的步骤之一。因此，本分析流程包含了使用Trim-galore程序进行简便的质量和接头序列修剪的步骤27。鉴于该步骤的重要性，本分析流程还包含了在修剪处理前（步骤4.3）和修剪处理后（步骤5.3）比较结果质量的步骤（步骤5.5）。除了质量与接头序列修剪外，本分析流程还去除了非典型染色体读段、TA重复区域以及黑名单区域，这些因素可能引入GC含量偏差或导致假阳性峰（称为峰）。这些过滤步骤为生物信息学初学者提供了一个合适的入门流程，有助于理解CUT&amp;RUN数据分析中的关键质量控制环节。
过滤步骤完成后，该 CUT&amp;RUN 分析流程提供两种标准化方法：“标准化分数读段数 (scaled fractional readcount, SFRC)22”和“基于内参对照每百万比对读段数的 spike-in 标准化方法 (Spike-in normalized Reads Per Million mapped reads in the negative Control, SRPMC)24,25”，用于生成下游峰识别和可视化所需的输入文件。如果 CUT&amp;RUN 数据集预期仅揭示局部差异，而样本间不存在全基因组范围的信号差异，则标准化分数读段数（即计数分数乘以参考基因组大小）可能已足以满足下游分析需求。然而，若 CUT&amp;RUN 样本之间可能存在全局性信号强度差异，用户可选择 SRPMC 方法，该方法综合考虑 spike-in 与样本（包括实验性 CUT&amp;RUN 样本和阴性对照样本）之间的读段比例，并结合阴性对照读段的每百万读段数 (RPM) 标准化，从而使不同样本间的阴性对照读段具有可比性。由于 SRPMC 提供的是相对于标准化后阴性对照读段的归一化读段数，该方法可最大限度地减少阴性对照信号的影响，实现不同批次和分组间数据集的比较。
CUT中的一个重要因素&amp;RUN 样本峰检测正在消除假阳性 CUT&amp;RUN 在期间达到峰值 计算机模拟 分析部分通过纳入IgG样本实现，具体而言，该分析流程为不同的峰值识别工具提供了峰值 calling 方法，以剔除假阳性的CUT&amp;RUN 峰检测。对于 MACS2/3 峰检测工具，我们的分析流程在峰检测过程中使用 IgG 模拟测序数据作为输入样本。对于 SEACR，本分析流程建议首先独立检测实验样本和阴性对照样本的峰，然后去除实验样本与阴性对照样本之间重叠的峰，因为在实验样本峰检测过程中同时提供阴性对照可能导致 SEACR 丢失大部分峰。经筛选后的峰在不同峰检测工具及重复样本之间表现出可比的相似性。图5）。综上所述，去除低质量、非经典染色体、黑名单区域和TA重复序列的reads，剪切接头序列， spike-in DNA标准化，以及在峰识别（peak calling）步骤中对阴性对照进行恰当处理，可为用户提供适用于下游分析的准确readcount文件。结合高质量的标准化测序文件和经过审慎识别的峰区域，用户可进一步比较重复样本间的相似性，并生成背景信号极干净的热图（heatmaps）和平均信号图（metaplots），以验证峰识别的有效性。
使用高质量的测序数据进行峰区识别，标志着从CUT&amp;RUN数据中开展生物学解释的起点。本方案描述了如何将信号最强或统计学显著性最高的位置指定为峰区中心，从而在热图和元图中获得聚焦清晰的峰信号。某些峰区识别方法并未将其峰中心定位在信号最强或统计学显著性最高的位置。因此，将每个峰区的中心重新定义为信号最强或统计学显著性最高的位置，是生成中心信号高度集中的可视化数据结果的重要步骤。原始峰区调用生成的bed文件将予以保留，用于后续的峰区注释及功能相关性分析，这些分析将在本方案所述步骤完成后进行。
尽管本 CUT&amp;RUN 分析流程包含了所需程序安装步骤的说明，但生物信息学初学者在安装分析工具时仍可能遇到困难。因此，已建立一个相关的 Github 问题页面，以提供更详细的程序安装分步说明，并促进用户在自身系统中安装程序时的技术支持与交流。在本文所述方案基础上，CUT&amp;RUN 分析流程的后续步骤还包括峰注释、识别不同类型识别峰之间的重叠区域，以及对识别峰进行功能注释。完成本方案中描述的质量控制和峰识别步骤，并结合下游的峰注释分析，将使用户能够从其 CUT&amp;RUN 数据中获得生物学意义。
本 CUT&amp;RUN 分析流程旨在为批量 CUT&amp;RUN 分析提供通用的入门级分步指南。该流程存在一些局限性。首先，尽管本分析流程尝试通过过滤黑名单区域（包括“高信号伪影区域”、“伪影重复区域”和 TA 重复区域）上的读段来处理由 GC 含量差异引起的影响，但这种方法可能不足以应对某些基因组中具有独特 GC 含量的生物。因此，如果用户关注任何由 GC 含量引起的偏差，可考虑增加一步对已比对读段进行校正。对于生物信息学初学者，Deeptools 中的 'computeGCBias' 和 'correctGCBias' 可作为实现此目标的选项。其次，本分析流程在同一文件中同时处理常规插入片段大小（100 bp–1 kb）和小插入片段大小的读段（&lt; 100 bp），后者可能是某些染色质相关蛋白的真实读段。由于本分析流程采用 shell 脚本编写，用户可在生成比对读段的 bed 文件步骤中修改“Script_08_bam-to-BEDPE-BED-bedGraph.sh”，以将短插入片段大小的读段与常规片段大小的读段分别提取出来。随后，短插入片段大小的读段 bed 文件可独立于常规插入片段大小的比对读段进行标准化，以最小化其对整体信号的压缩效应。第三，为了降低分析流程的复杂性，Easy Shells CUTnRUN 未包含对 CUT&amp;RUN 样本测序深度进行均一化的下采样步骤。然而，用户可在使用 samtools view28 或 PositionBasedDownsampleSam（Picard）29 过滤 bam 文件后，自行添加下采样步骤。
本方案中的所有分析步骤均以 shell 脚本编写，旨在帮助生物信息学初学者通过查阅脚本学习 CUT&amp;RUN 分析的基础知识。我们期望用户能够在终端中依次运行每个 shell 脚本，逐步实践生物信息学分析。此外，本 CUT&amp;RUN 分析流程所提供的 shell 脚本简洁明了，便于用户修改和定制，从而将该分析流程应用于自身的 CUT&amp;RUN 数据。最终，我们希望该 CUT&amp;RUN 分析流程能够减少 CUT&amp;RUN 数据分析过程中的常见瓶颈，助力湿实验研究人员和生物信息学初学者从自身的 CUT&amp;RUN 测序数据中得出生物学结论。

测量蛋白质与基因组DNA之间相互作用的能力，对于理解染色质调控的生物学机制至关重要。能够有效检测特定蛋白质在染色质上占据情况的实验方法，至少可提供两方面的关键信息：i）基因组定位位置；ii）特定基因组区域中该蛋白质的丰度。追踪目标蛋白质在染色质上的招募过程及其定位变化，有助于揭示该蛋白质的直接靶位点，并阐明其在基于染色质的生物学过程中（如转录调控、DNA修复或DNA复制）所发挥的分子机制作用。目前可用的蛋白质-DNA相互作用分析技术，使研究人员能够以前所未有的分辨率探索基因调控机制。这些技术进步得益于新型染色质分析技术的出现，其中包括Henikoff实验室开发的“靶位切割与核酸酶释放技术”（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease, CUT&RUN）。与传统的染色质免疫沉淀（ChIP）技术相比，CUT&RUN具有多项技术优势，包括更低的细胞用量需求、更低的测序深度要求，以及更高的灵敏度和更低的背景信号——这主要归因于该方法无需使用交联剂，从而避免了交联剂对抗体表位的遮蔽效应。采用该技术研究染色质调控，需要深入理解其技术原理，并掌握CUT&RUN数据的分析、验证与解读方法。
CUT&amp;#38;RUN 实验流程首先将细胞与刀豆球蛋白A（Concanavalin A）偶联的磁珠结合，从而在整个实验过程中实现对少量细胞的操作。分离的细胞通过温和去污剂进行通透化处理，以促进靶向目标蛋白的抗体进入。随后，利用与微球菌核酸酶（MNase）相连的Protein A或Protein A/G标签，将MNase招募至已结合的抗体处。加入钙离子以启动酶活性。MNase消化产生单核小体DNA-蛋白复合物。接着通过螯合钙离子终止消化反应，从细胞核中释放出MNase消化产生的短DNA片段，随后进行DNA纯化、文库构建以及高通量测序1（图1）。
计算机模拟 用于绘制和量化全基因组范围内蛋白质占据情况的方法，随着用于富集DNA-蛋白相互作用的湿实验技术的发展而并行进步。识别信号富集区域（峰）是生物信息学分析中最关键的步骤之一。早期的ChIP-seq分析方法采用了MACS等算法2 和 SICER3，采用统计模型来区分 真正有效的 从背景噪声中分辨出蛋白质-DNA结合位点。然而，CUT的背景噪声更低且分辨率更高&amp;#38;RUN 数据使得某些在 ChIP-seq 分析中使用的峰识别程序不适用于 CUT&amp;#38;RUN 分析4这一挑战凸显了开发更适用于CUT分析的新工具的必要性&amp;#38;RUN 数据。SEACR4 代表一种近期开发的工具，可用于从CUT中进行峰呼叫&amp;#38;RUN 数据，同时克服通常用于 ChIP-seq 分析工具的局限性。
对 CUT&amp;#38;RUN 测序数据的生物学解释来源于分析流程中峰识别（peak calling）下游的输出结果。可采用多种功能注释程序，以预测 CUT&amp;#38;RUN 数据中识别出的峰所对应的潜在生物学意义。例如，基因本体（Gene Ontology, GO）项目为感兴趣的基因提供了公认的功能注释5,6,7。目前已有多种软件工具和资源可支持 GO 分析，用于揭示在 CUT&amp;#38;RUN 峰区域中富集的基因及基因集合8,9,10,11,12,13,14。此外，Deeptools15、整合基因组学浏览器（Integrative Genomics Viewer, IGV）16 和 UCSC 基因组浏览器（UCSC Genome Browser）17 等可视化软件可用于在全基因组范围内对目标区域的信号分布和模式进行可视化展示。
从 CUT&amp;#38;RUN 数据中得出生物学结论的能力在很大程度上依赖于对数据质量的验证。需要验证的关键环节包括：i) CUT&amp;#38;RUN 文库测序质量的评估，ii) 重复样本之间的一致性，以及 iii) 峰中心处信号分布情况。完成上述三个方面的验证对于确保 CUT&amp;#38;RUN 文库样本的可靠性及后续分析结果的准确性至关重要。因此，建立入门级的 CUT&amp;#38;RUN 分析指南，使生物信息学初学者和湿实验研究人员能够在标准的 CUT&amp;#38;RUN 分析流程中执行这些验证步骤，具有重要意义。
随着湿实验CUT&amp;#38;RUN技术的发展，已开发出多种计算机模拟的CUT&amp;#38;RUN分析流程，例如CUT&amp;#38;RUNTools 2.018,19、nf-core/cutandrun20和CnRAP21，以支持CUT&amp;#38;RUN数据的分析。这些工具为分析单细胞和批量CUT&amp;#38;RUN及CUT&amp;#38;Tag数据集提供了强大的方法。然而，这些分析流程通常具有相对复杂的模块化程序结构，且需要掌握多种编程语言，这可能会阻碍生物信息学初学者对CUT&amp;#38;RUN分析步骤的深入理解以及自定义分析流程的需求。克服这一障碍需要一种全新的入门级CUT&amp;#38;RUN分析流程，该流程应以简单单一的编程语言编写成逐步脚本，便于初学者使用。
本文介绍了一种简单且基于单一语言的 CUT&amp;RUN 分析流程方案，提供了配有详细说明的逐步操作脚本，帮助新用户和初学者开展 CUT&amp;RUN 测序分析。该流程中所使用的程序均由原始开发团队公开提供。本方案涵盖的主要步骤包括：序列比对、峰识别、功能分析，以及最关键的验证步骤——用于评估样本质量，以确定数据是否适用于生物学解释及其可靠程度（图2）。此外，该流程还为用户提供机会，将其分析结果与公开可用的 CUT&amp;RUN 数据集进行交叉比对。最终，该 CUT&amp;RUN 分析流程方案可作为生物信息学分析初学者及湿实验研究人员的入门指南和参考依据。

<table><tbody><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>ENCODE</td><td>https://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td><td>将读取计数 bedGraph 压缩并转换为 bigWig 的软件</td></tr><tr><td>bedtools-2.31.1</td><td>犹他大学 Quinlan 实验室</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>用于处理 bam/bed/bedGraph 文件的软件</td></tr><tr><td>bowtie2 2.5.4</td><td>约翰斯·霍普金斯大学</td><td>https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td>用于构建bowtie索引并执行比对的软件</td></tr><tr><td>CollectInsertSizeMetrics（Picard）</td><td>布罗德研究所</td><td>https://github.com/broadinstitute/picard</td><td>用于插入片段大小分布分析的软件</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>NBIS</td><td>https://cutadapt.readthedocs.io/zh/stable/index.html</td><td>用于执行接头序列修剪的软件</td></tr><tr><td>Deeptoolsv3.5.1</td><td>马克斯·普朗克研究所</td><td>https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/index.html</td><td>用于执行皮尔逊相关系数分析、主成分分析以及热图/平均值图分析的软件</td></tr><tr><td>FastQC 版本 0.12.0</td><td>巴布拉汉生物信息学</td><td>https://github.com/s-andrews/FastQC</td><td>检查 fastq 文件质量的软件</td></tr><tr><td>Intervene v0.6.1</td><td>计算生物学 &amp;基因调控 - Mathelier 小组</td><td>https://intervene.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>用于使用峰文件进行维恩图分析的软件</td></tr><tr><td>MACSv2.2.9.1</td><td>陈-扎克伯格倡议</td><td>https://github.com/macs3-project/MACS/tree/macs_v2</td><td>用于识别峰的软件</td></tr><tr><td>MACSv3.0.2</td><td>陈-扎克伯格倡议</td><td>https://github.com/macs3-project/MACS/tree/master</td><td>用于识别峰的软件</td></tr><tr><td>Samtools-1.21</td><td>威康桑格研究所</td><td>https://github.com/samtools/samtools</td><td>处理 sam/bam 文件的软件</td></tr><tr><td>SEACRv1.3</td><td>霍华德·休斯医学研究所</td><td>https://github.com/FredHutch/SEACR</td><td>用于识别峰的软件</td></tr><tr><td>SRA Toolkit 版本 3.1.1</td><td>NCBI</td><td>https://github.com/ncbi/sra-tools</td><td>从 GEO 下载 SRR 的软件</td></tr><tr><td>Trim_Galore v0.6.10</td><td>巴布拉汉生物信息学</td><td>https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore</td><td>用于执行质量控制和接头序列修剪的软件</td></tr></tbody></table>

cut&run测序数据的初步分析与验证

Introductory Analysis and Validation of CUT&#38;RUN Sequencing Data

CUT&amp;RUN 技术有助于检测全基因组范围内的蛋白质-DNA 相互作用。CUT 的典型应用&amp;RUN 包括组蛋白尾部修饰变化的分析或转录因子染色质占位的定位。CUT 的广泛应用&amp;RUN 的应用在一定程度上得益于其相较于传统 ChIP-seq 的技术优势，包括更低的细胞起始量需求、更低的测序深度要求，以及由于无需使用交联剂（此类试剂可能遮蔽抗体表位）而带来的背景信号降低和灵敏度提升。CUT 的广泛应用&amp;RUN 还得益于 Henikoff 实验室慷慨分享试剂，以及商业试剂盒的开发，从而加快了初学者对该技术的采用。随着 CUT&amp;RUN 增加，CUT&amp;RUN测序分析与验证已成为主要瓶颈，必须克服这些障碍才能实现以湿实验为主的团队对CUT的全面采用&amp;RUN分析通常从对原始测序读长进行质量控制检查开始，以评估测序深度、读长质量及潜在的偏差。随后将读长比对至参考基因组序列组装，再利用多种生物信息学工具对蛋白质富集的基因组区域进行注释，确认数据的可解释性，并得出生物学结论。尽管存在多种 计算机模拟 分析流程已开发用于支持 CUT&amp;RUN 数据分析中，由于其复杂的多模块结构以及使用多种编程语言，这些平台对于缺乏多种编程语言背景但希望理解 CUT 的生物信息学初学者而言较为困难&amp;RUN 分析流程并自定义其分析流程。在此，我们提供一种单语言逐步的 CUT&amp;适用于各种生物信息学经验水平用户的RUN分析流程方案。本方案包括完成关键的质量控制检查，以验证测序数据是否适合进行生物学解释。我们预期，结合本文提供的入门级方案及后续的峰注释分析，用户能够从自身的CUT&amp;RUN 数据集

本实验方案为生物信息学初学者提供了一个入门级的CUT&amp;RUN分析流程，帮助用户完成CUT&amp;RUN测序数据的初步分析与验证。完成此处描述的分析步骤，并结合后续的峰注释分析，用户可深入理解染色质调控的分子机制。

CUT&RUN测序数据的初步分析与验证

CUT&amp;RUN 技术可实现全基因组范围内蛋白质-DNA 相互作用的检测。CUT&amp;RUN 的典型应用包括染色质蛋白定位分析……

我们的研究探讨了重复DNA元件在癌症发生和进展中的作用。我们试图探究这些元件是否直接参与癌症发生的机制，如果确实如此，我们能否利用这些信息来改善患者的预后？目前已有多种下一代测序技术及分析流程被开发出来，用于捕捉表观遗传因子的特征与变化，例如转录水平的变化、染色质的翻译后修饰、特定染色质区域上的蛋白结合情况，以及通过传感器蛋白在群体细胞和单细胞分辨率下捕获的DNA或RNA测序数据。推动本领域研究进展的技术包括能够绘制染色质上组蛋白修饰或转录因子基因组定位的技术。就我们的目的而言，这类技术中最相关的一种称为 CUT&RUN。目前许多公开可用的 CUT&RUN 分析流程对于希望理解分析流程并为自己的项目开发独立分析流程的生物信息学初学者来说，相对较为复杂。但我们的 CUT&RUN 分析流程是以单一编程语言逐步开发的，这种方式更容易理解流程，也更容易修改，从而获得适合发表的高质量数据，并积累生物信息学方面的经验。我们持续致力于探究慢性双链 RNA 表达如何影响拟态逃逸及免疫治疗耐药性癌症的发展，以及 TP53 蛋白如何调控慢性双链 RNA 表达和拟态逃逸过程。最终，我们希望通过对慢性双链 RNA 表达和拟态逃逸机制的理解与靶向干预，找到治愈免疫治疗耐药性癌症的方法。首先，在终端中输入命令，从 GitHub 下载压缩的分析流程。下载完成后，输入命令解压缩 zip 文件。解压缩完成后，删除 zip 文件并重命名解压后的文件夹。然后，为工作目录中的所有 shell 脚本设置可执行权限。在可用选项中，找到相应的安装 shell 脚本。查找名为 Script_01_installation.sh 的脚本。打开终端，输入 echo shell 以检查当前终端使用的默认 shell。如果默认 shell 不是 bash，请在终端中输入 chsh s 将其设置为 bash。在终端中键入 fastq 下载脚本，或将脚本文件拖入终端后按 Enter 键。运行脚本后，检查日志文件中的错误信息。现在，在终端中输入剪切脚本并执行。接下来，在终端中输入 bowtie-2-index 脚本并执行。最后，运行 bowtie-2-mapping 脚本并按 Enter 键。在终端中输入 bam 过滤和排序脚本并执行。接下来，在终端中输入相应命令并按 Enter 键，将 bam 文件转换为 BEDPE-BED 和 bedGraph 格式。使用 SRPMC 方法进行标准化处理。然后运行插入片段大小分析脚本。在终端中使用 MACS 命令进行峰检测。随后，在终端中输入使用 SEACR 进行峰识别的命令并按 Enter 键。通过在终端中使用适当的命令创建 peak-bed 文件，然后对峰进行过滤。接下来，输入合并 MACS 峰的命令。在终端中输入命令以合并 SEACR 峰。生成相关性图并运行主成分分析的命令。然后，使用适当的命令创建比较不同方法的维恩图。输入命令以生成重复样本的维恩图。最后，生成一个聚焦的峰中心热图，然后生成一个完整的峰中心热图。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

CUT&#38;RUN 测序数据的介绍性分析和验证

亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。...

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

本文描述了一种用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）中低频突变的技术——ER-Seq。该方法的独特之处在于采用了双向错误校正、特殊的背景过滤以及高效的分子富集。...

利用下一代测序技术检测循环肿瘤DNA中的稀有突变

靶向二代测序是一种高效且经济的方法，正日益广泛应用于疾病研究和临床诊断。本文所述方案介绍了用于测序的复杂工作流程，以及用于识别致病遗传变异的生物信息学分析过程。...

靶向二代测序与生物信息学分析流程用于评估先天性疾病的遗传决定因素

下一代测序（NGS）是一种强大的基因组表征工具，但其应用受到该平台较高错误率（约0.5–2.0%）的限制。我们介绍了错误校正测序的方法，可消除NGS的错误率影响，检测到低至0.0001变异等位基因分数的突变。...

利用纠错型DNA和RNA测序进行稀有事件检测

我们提供了一种偏倚低于标准方法且对2'-O-甲基化RNA具有更高灵敏度的详细小RNA文库构建方案。该方案可使用自制试剂以降低成本，也可使用现成试剂盒以提高操作便利性。...

改进小RNA测序：减少偏差并更好检测2'-O-甲基化RNA

我们此前已验证了一种基于扩增子的乌苏图病毒（USUV）全基因组测序方案，该方案在纳米孔测序平台上进行。本文中，我们对所使用的方法进行了更详细的描述，并确定了纳米孔R10流通池的错误率。...

以乌苏图病毒为例验证全基因组纳米孔测序

本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。...

降解FFPE-RNA样本测序及分析的优化

本文介绍了一种sgRNA/CAS9核酸酶与下一代测序的实验方案，可用于鉴定与CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变。...

利用下一代测序技术鉴定与Cas9诱导的CD4启动子附近双链断裂修复相关的突变

本方案描述了一种在人类真菌病原体Candida...

全基因组范围转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&amp;RUN方法与数据分析流程

本文描述了一种针对神经内分泌型小细胞肺癌细胞系优化的靶点下方切割并利用核酸酶释放后接高通量测序（CUT&amp;#38;RUN-seq）实验方案。该方法可实现全基因组范围内多种组蛋白修饰及转录因子（如...

使用CUT&amp;RUN技术对神经内分泌小细胞肺癌细胞系进行全基因组组蛋白修饰和转录因子结合位点作图

学习CUT&RUN测序数据的入门分析与验证方法，使用公开分析流程处理组蛋白修饰数据。该计算流程帮助生物信息学初学者理解染色质调控机制并开发个性化分析方案。

CUT&RUN测序数据的初步分析与验证

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