体外利用人诱导性多能干细胞模拟唐氏综合征神经发生

长期研究重点是寻找唐氏综合征神经系统疾病潜在的治疗方法。目前我们的研究重点是唐氏综合征导致的神经发生障碍，这是智力障碍的主要原因。我们发现，唐氏综合征的神经发生障碍是由双相细胞周期缺陷引起的，这与普遍认为该障碍仅源于唐氏综合征神经前体细胞衰老的观点相反。

利用本论文所述基于人iPSC的方案鉴定双相细胞周期缺陷，将推动发育潜能治疗策略的发展，该策略需同时考虑细胞周期的两个阶段：早期增殖能力降低，以及晚期无法退出细胞周期。首先，在完全人iPSC培养基、DPBS、细胞解离液以及添加了25纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子的饲养层条件培养基中加入10微摩尔的ROCK抑制剂。将所有试剂预热至37摄氏度。

取一个饲养层上培养的iPSC六孔板。用移液器吸出已分化的克隆，并加入新鲜的完全人iPSC培养基。将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育2小时。

孵育后，用不含钙和镁的DPBS洗涤各孔一次。然后，向每孔加入一毫升细胞解离溶液。将培养板置于37°C的二氧化碳培养箱中孵育12至14分钟。

在倒置显微镜下观察细胞。如果大部分细胞已脱落，但仍有部分细胞贴壁，可轻轻从培养板侧壁敲击。每孔加入 3 mL 含钙和镁的 DPBS，以稀释细胞解离液。

用5毫升移液器轻柔吹打2至3次，以打散细胞团块，同时避免产生气泡。将细胞通过40微米细胞筛滤入50毫升离心管2中。在室温下以200 × g离心5分钟。使用真空抽吸系统轻轻吸除上清液。

现在，将细胞重悬于 10 毫升人 iPSC 培养基中。将所有悬浮细胞转移至经 0.1% 明胶包被的 15 厘米培养皿中，并在二氧化碳培养箱中孵育。将含细胞的培养基收集至离心管 2 中。

在室温下以200 ×g离心五分钟。然后使用真空抽吸系统轻轻吸除培养基。将细胞重悬于1毫升饲养层细胞条件培养基中，该培养基添加有25纳克/毫升的bFGF和10微摩尔的ROCK抑制剂。细胞计数后，制备浓度为每毫升30,000至50,000个细胞的细胞悬液。

将悬浮液接种至培养板中。两天后，将饲养层条件培养基更换为神经前体细胞（NPC）培养基。按照指定时间，在第2天和第18天更换培养基。

第28天，将孔板中的培养基更换为添加了10微摩尔ROCK抑制剂的NPC培养基。然后将孔板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育2小时。孵育结束后，吸去上清液，并用无钙无镁的DPBS洗涤孔板一次。

向每个孔中加入一毫升细胞解离溶液。然后在倒置显微镜下以4倍放大倍数观察细胞。接着，将三毫升含钙和镁的DPBS缓冲液加入到培养板的每个孔中。

用5毫升移液器轻轻吹打悬浮液，打散任何团块。将细胞悬液通过置于50毫升离心管2上的40微米滤网过滤。离心，并如前所述吸除上清，然后将沉淀重悬于1毫升添加了含维生素A的B27的指定分化培养基中。使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞。

然后将50,000个细胞接种至经合格基质包被的48孔板的每个孔中。在第33天，将培养孔中的培养基更换为神经分化培养基。与同基因背景的正常二倍体细胞相比，唐氏综合征细胞培养物中TUBB3阳性神经元数量显著减少，在第85天时减少约两倍。

与同基因型的整倍体细胞相比，在唐氏综合征细胞培养物的早期神经发生阶段，KI67阳性细胞的比例显著降低，大约减少了四倍。在晚期神经发生阶段，大多数同基因型整倍体细胞退出细胞周期，KI67染色极少，而大多数唐氏综合征细胞仍呈KI67阳性，增加了约五倍。另一对唐氏综合征及同基因型整倍体人诱导多能干细胞（iPSCs）证实，在神经分化结束时，唐氏综合征细胞培养物中TUBB3阳性神经元水平降低，PAX6阳性神经前体细胞增多，其中TUBB3阳性神经元减少了两倍，PAX6阳性细胞则增加两倍以上。