Name: 体外研究 使用人诱导多能干细胞对唐氏综合症神经发生进行建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 探索利用人诱导多能干细胞建立唐氏综合症神经发生障碍的体外模型，揭示双相细胞周期缺陷导致神经发生受损的分子机制，为开发针对性治疗策略提供重要平台。

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作者感谢Stuart H. Orkin教授为我们提供了唐氏综合征及等基因型正常核型的hiPSCs细胞系。作者同时感谢位于浦那的印度国家细胞科学中心（BRIC-NCCS）为开展本项工作提供资金支持。

以下方案使用两对唐氏综合征及其同基因型正常人iPSCs进行。其中一对通过逆转录病毒介导的重编程方法获得19, 并使用非整合型仙台病毒递送方法生成了第二对（NSi003-A 和 NSi003-B）20该方案主要包括两个阶段：神经发生阶段（第一阶段）和神经分化阶段（第二阶段）。在神经发生阶段，根据唐氏综合征细胞系与同基因型正常二倍体细胞系增殖差异，还可分为早期和晚期两个阶段。本研究中所用试剂、培养基和设备的详细信息列于 材料表.
1. 唐氏综合征hiPSCs及同基因型正常核型hiPSCs的培养与维持
<ol>
	<li>人诱导多能干细胞（hiPSC）的饲养层铺板 
	注意：饲养层细胞的质量和密度对高质量的人诱导多能干细胞培养至关重要。
	<ol>
		<li>在接种饲养层细胞前，使用 2 mL 0.1% 明胶对 6 孔板进行包被，并于 37 °C 下孵育至少 1–2 小时。</li>
		<li>将明胶包被的 6 孔板置于细胞培养超净台内室温环境中至少 30 分钟，再进行细胞接种。</li>
		<li>将用于复苏的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基在珠浴/水浴中预热至 37 °C。</li>
		<li>将 5 mL MEF 培养基分装至 15 mL 离心管中。</li>
		<li>从液氮罐（LN2 罐）中取出一管饲养层细胞。 
		注意：饲养层细胞系通过使用 10 µg/mL 丝裂霉素 C 处理 E13.5 小鼠胚胎成纤维细胞 3 小时，随后用 DPBS 洗涤 2–3 次制备而成18。饲养层细胞可直接使用，也可冻存于液氮罐中以备后续使用。所有实验小鼠均经机构动物伦理委员会批准后使用。</li>
		<li>将冻存管置于水浴中 37 °C 浮动架上，直至管内仅剩少量冰晶。</li>
		<li>将冻存管转移至生物安全柜内，先用酒精消毒管壁，再放入生物安全柜中。</li>
		<li>逐滴加入 1 mL 预热的 MEF 培养基（见材料表）。</li>
		<li>轻柔吸取管内液体，逐滴转移至含有 5 mL MEF 培养基的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>室温下以 200 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>使用真空抽吸系统（VAS）吸除上清液。</li>
		<li>加入 1 mL MEF 培养基，轻柔吹打 3–4 次。</li>
		<li>使用血细胞计数板进行细胞计数，台盼蓝染色排除死细胞。</li>
		<li>每孔接种 3.1–3.3 × 105 个活饲养层细胞至 6 孔板中，或每孔接种 2 × 106 个细胞至 MEF 培养基中。</li>
		<li>将培养板置于 37 °C、85% 湿度的 CO2 培养箱中过夜。在 CO2 培养箱内前后及左右轻摇培养板 2–3 次，以实现饲养层细胞的均匀分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>唐氏综合征 hiPSC 及其同基因型正常核型 hiPSC 的复苏 
	注意：将所需体积的 hiPSC 培养基在 37 °C 珠浴中预热。 
	&#8203;人诱导多能干细胞（hiPSC）复苏培养基：在 hiPSC 培养基中新鲜添加 25 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和 10 µM Rho 相关卷曲螺旋激酶抑制剂（RI）（Y-27632 2HCl）。
	<ol>
		<li>移除饲养层孔中的 MEF 培养基，沿孔壁轻柔加入 1 mL/孔预热的 DMEM/F12 培养基进行一次洗涤。吸除洗涤液后，每孔加入 2 mL 预热的 hiPSC 复苏培养基。将培养板置于培养箱中至少 2 小时后再接种 hiPSC。</li>
		<li>从液氮罐中取出一管 hiPSC 冻存管。</li>
		<li>将冻存管置于 37 °C 水浴中的浮动架上，直至管内仅剩少量冰晶。</li>
		<li>在将冻存管转移至生物安全柜前，使用 70% 酒精对管体进行表面消毒。</li>
		<li>向冻存管中加入 1 mL 预热的 hiPSC 复苏培养基。</li>
		<li>轻柔吸取管内液体，逐滴转移至含有 5 mL hiPSC 复苏培养基的 15 mL 离心管中。</li>
		<li>室温下以 100 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>使用真空抽吸系统（VAS）吸除上清液，并通过轻弹管壁使细胞沉淀松散。</li>
		<li>加入 500 µL 含 10 µM RI 的 hiPSC 培养基，覆盖至已含 hiPSC 复苏培养基的饲养层培养板上。在培养板上标注细胞名称、传代次数、研究人员姓名和日期。</li>
		<li>在倒置显微镜下以 4 倍物镜观察 hiPSC 克隆，应可见细胞团块。</li>
		<li>将培养板置于 CO2 培养箱内，前后及左右轻摇 2–3 次，使细胞均匀分布。24 小时内避免扰动培养板。</li>
		<li>次日，部分克隆应已贴附于饲养层，部分可能仍漂浮。无需吸除原有培养基，直接补充新鲜的含 25 ng/mL bFGF 和 10 µM RI 的 hiPSC 培养基。</li>
		<li>复苏后第二天，大多数克隆应已贴壁。更换为含 25 ng/mL bFGF 的完整 hiPSC 培养基。随后几天内，hiPSC 克隆将逐渐清晰可见。 
		注意：hiPSC 复苏并形成具有光滑、边界清晰、细胞形态均一且克隆中心致密的克隆，通常至少需要一周时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在饲养层上对唐氏综合征 hiPSC 及其同基因型正常核型 hiPSC 进行传代 
	注意：所有试剂在使用前应预热。避免过度吹打细胞。操作过程需轻柔。
	<ol>
		<li>当大多数克隆开始相互融合，或出现过多分化克隆时，应对 hiPSC 进行传代。通常在首次传代后 5–7 天内需进行一次分裂。</li>
		<li>在传代前一天复苏一管饲养层细胞。</li>
		<li>使用 1 mL/孔预热的 DMEM/F12 对饲养层进行一次洗涤，随后每孔加入 2 mL 含 25 ng/mL bFGF 的预热 hiPSC 培养基。将培养板置于 37 °C CO2 培养箱中至少 2 小时，再接种 hiPSC。</li>
		<li>在体视显微镜下观察 hiPSC 培养板，识别分化克隆，并使用 200 µL 移液枪头刮除分化区域。</li>
		<li>使用 1 mL/孔预热的 DMEM/F12 对 hiPSC 进行一次洗涤。</li>
		<li>每孔加入 1 mL 1 mg/mL 胶原酶溶液。将培养板置于培养箱中孵育 8–10 分钟，随后在倒置显微镜下观察克隆边缘是否松动。</li>
		<li>吸除胶原酶溶液，用 DMEM/F12 洗涤两次，然后每孔加入 1 mL hiPSC 培养基。</li>
		<li>使用 2 mL 注射器针头在孔内对克隆进行水平和垂直方向的轻柔切割，共 8–10 次。在倒置显微镜下观察，确认大多数克隆已被切割至合适大小。</li>
		<li>若克隆已充分切割，使用细胞刮轻轻抬起克隆。</li>
		<li>根据克隆大小，使用 1 mL 枪头在孔内轻柔吹打 5–8 次，使克隆悬浮。</li>
		<li>将所有细胞收集至 15 mL 离心管中，室温下以 100 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>使用移液器轻柔吸除上清液，轻弹管壁使细胞沉淀松散，加入 200 µL 含 25 ng/mL bFGF 和 10 µM RI 的 hiPSC 培养基。用 200 µL 枪头吹打 2–3 次，再加入 300 µL 含 25 ng/mL bFGF 和 10 µM RI 的 hiPSC 培养基。</li>
		<li>将上述细胞轻柔接种至含 hiPSC 培养基 + 25 ng/mL bFGF 的饲养层培养板上。根据去除分化克隆后的克隆数量，可将一孔细胞按 1:2 或 1:3 比例传代。在培养板上标注细胞名称、传代次数、研究人员姓名和日期。</li>
		<li>将培养板置于 CO2 培养箱内，前后及左右轻摇 2–3 次，使细胞均匀分布。</li>
		<li>次日，使用预热的 DMEM/F12 轻柔洗涤一次，每孔加入 2.5 mL 含 25 ng/mL bFGF 的 hiPSC 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从饲养层上冻存唐氏综合征 hiPSC 及其同基因型正常核型 hiPSC 
	注意：在冻存过程中应避免对人诱导多能干细胞进行过度吹打。
	<ol>
		<li>在 hiPSC 仍处于对数生长期时进行传代冻存，即传代后 4–5 天。</li>
		<li>在体视显微镜下观察 hiPSC 培养板，识别分化克隆，并使用 200 µL 移液枪头刮除。</li>
		<li>使用 1 mL/孔预热的 DMEM/F12 对 hiPSC 进行一次洗涤。</li>
		<li>每孔加入 1 mL 1 mg/mL 胶原酶溶液。将培养板置于培养箱中孵育 8–10 分钟，随后在倒置显微镜下观察克隆边缘是否抬起。</li>
		<li>吸除胶原酶溶液，用 DMEM/F12 洗涤两次，然后每孔加入 1 mL hiPSC 培养基。</li>
		<li>使用细胞刮轻轻抬起克隆。</li>
		<li>根据克隆大小，使用 1 mL 枪头在孔内轻柔吹打 5–8 次，使克隆悬浮。</li>
		<li>将所有细胞收集至 15 mL 离心管中，室温下以 100 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>使用移液器轻柔吸除上清液，轻弹管壁使细胞沉淀松散，根据原孔数加入不含抗生素但含 25 ng/mL bFGF 的 hiPSC 培养基。将细胞分装至冻存管中。</li>
		<li>向冻存管中加入含 25 ng/mL bFGF、20% DMSO 的不含抗生素的 hiPSC 培养基，使 DMSO 的终浓度为 10%。</li>
		<li>将冻存管放入含异丙醇的程序降温盒（frosty）中，以实现缓慢降温。</li>
		<li>将程序降温盒置于 -80 °C 过夜，次日将冻存管转移至液氮罐中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 神经元分化
注意：饲养层条件培养基（FCM）的制备：使用T-75培养瓶，每瓶接种4 × 106个饲养层细胞。次日加入40 mL含4 ng/mL bFGF的hiPSC培养基。连续收集7天。每天收集的培养基储存于-20 °C，可保存长达1个月。在消化细胞前，至少提前2小时于37 °C用10 mL 0.1%明胶包被15 cm培养皿。在消化细胞前1天，使用符合hESC标准的基底膜基质（下文简称&#34;合格基质&#34;）包被6孔板。在整个实验流程中进行细胞消化时，需在细胞解离液（见材料表）、DPBS及铺板培养基（添加25 ng/mL bFGF的FCM）中加入10 µM RI。每次诱导分化均需新鲜制备饲养层条件培养基（FCM）。避免对hiPSC进行过度吹打。
<ol>
	<li>天 体外 (DIV) 2：制备单细胞并接种 hiPSCs 用于神经分化
	<ol>
		<li>向添加了25 ng/mL bFGF的hiPSC培养基、DPBS、细胞解离溶液以及添加了25 ng/mL bFGF的饲养层条件培养基中加入10 µM RI。将所有这些试剂在37 °C下预热。</li>
		<li>取一个饲养层上的6孔板iPSC，去除已分化的克隆，并加入新鲜的hiPSC培养基，培养基中添加25 ng/mL bFGF和10 µM RI。将培养板置于培养箱中孵育2小时。</li>
		<li>2小时后取出iPSCs培养板，用不含Ca的DPBS洗涤一次++ 和 Mg++.</li>
		<li>加入1 mL/孔细胞解离溶液（含10 µM RI），并将培养板置于CO₂培养箱内2 孵育12-14分钟。</li>
		<li>12–14 分钟后，在倒置显微镜下观察细胞；大多数细胞开始从培养板上脱落。若仍有部分细胞贴壁，可轻轻从培养板侧面轻敲。</li>
		<li>通过向每孔加入3 mL不含Ca²⁺的DPBS稀释细胞解离液++ 和 Mg++ （加入10 µM RI）。使用5 mL移液器轻轻吹打2-3次，避免产生气泡以破碎团块。</li>
		<li>用40 µM滤网过滤细胞。</li>
		<li>将细胞收集到50 mL离心管中。</li>
		<li>室温下以 200 x g 离心 5 分钟 g 使用 VAS 轻柔地吸除培养基。</li>
		<li>用10 mL hiPSC培养基（含25 ng/mL bFGF 和 10 µM RI）重悬细胞。将细胞接种于经0.1%明胶包被的15 cm培养皿中，孵育1.5小时以去除饲养层细胞，因为饲养层细胞相较于hiPSC更易优先黏附于明胶包被的表面。</li>
		<li>孵育1.5小时后，轻柔收集含有细胞的培养基，在室温下以200 × g离心5分钟 g使用VAS吸除培养基。</li>
		<li>用1 mL FCM（含25 ng/mL bFGF和10 µM RI）重悬细胞，并进行细胞计数。</li>
		<li>使用FCM（加入25 ng/mL bFGF和10 µM RI），制备30,000–50,000个细胞/mL的细胞悬液，按每60 mm培养皿5 mL、6孔板每孔2 mL或24孔板每孔500 µL接种细胞悬液。培养板应包被合格的基质（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DIV 0：（约48小时后）：将饲养层条件培养基更换为NPC培养基（DDM + 不含维生素A的B27 + N2）（参见 材料表).</li>
	<li>第2天：每隔一天添加含0.125 µM Dorsomorphin的NPC培养基，直至第18天。</li>
	<li>第18天：加入不含Dorsomorphin的NPC培养基，每隔一天更换一次，直至第28天。</li>
	<li>第28至30天：制备单细胞并接种神经前体细胞用于第二阶段
	<ol>
		<li>在DIV 28天，取出培养板（含NPCs），更换为NPC培养基（含10 µM RI）。将培养板放入CO2 孵育2小时。</li>
		<li>2小时后，吸去培养基，用不含Ca的DPBS洗涤一次++ 和 Mg++).</li>
		<li>每孔加入1 mL细胞解离溶液（含10 µM RI），将培养板置于培养箱中孵育14分钟。</li>
		<li>14分钟后，在倒置显微镜下以4倍物镜观察细胞。大多数细胞开始从培养板上脱落。若仍有部分细胞贴壁，可轻轻从侧面轻敲培养板。</li>
		<li>将细胞解离溶液用 DPBS（含 Ca）稀释，每孔加入 3 mL++ 和 Mg++ （加入10 µM RI）。使用5 mL移液器轻轻吹打2-3次，避免产生气泡以破碎团块。</li>
		<li>将样品通过置于50 mL离心管上的40 µm滤器。</li>
		<li>室温下以 200 x g 离心 5 分钟 g使用VAS轻轻吸除培养基。</li>
		<li>用含维生素A的DDM + B27培养基（添加10 µM RI）重悬细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板和台盼蓝对活细胞进行计数。</li>
		<li>在已验证的基质包被的48孔板（每孔1倍）中，每孔接种50,000个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第33天：将培养基更换为神经分化培养基（参见 材料表每5天更换一次培养基，持续补充培养基至DIV 85/90。</li>
</ol>
3. 免疫细胞化学（ICC）
注意：在各个阶段均需加入足量缓冲液以覆盖细胞，并在洗涤阶段吸液时避免孔内干燥。
<ol>
	<li>将已分化的细胞板从细胞培养区域取出。</li>
	<li>吸除培养基，并用DPBS洗涤一次。</li>
	<li>固定时，向细胞中加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA），用铝箔纸包裹后置于37 °C摇床上固定30分钟。</li>
	<li>吸除PFA，用不含Ca++和Mg++的DPBS洗涤三次，每次15分钟。</li>
	<li>加入封闭液（3% BSA + 5%驴血清（或与二抗宿主动物相同的血清）+ 0.2% Triton-X 溶于DPBS中），室温孵育1小时。</li>
	<li>每孔加入250 µL一抗溶液 [Ki67（1:100稀释）、TUBB3（1:500稀释）、PAX6（1:100稀释）]，在4 °C摇床上孵育过夜。抗体稀释使用封闭液进行。</li>
	<li>一抗孵育后，用DPBS洗涤三次。</li>
	<li>每孔加入250 µL二抗（按1:250比例稀释于含3% BSA和0.2% Triton-X的DPBS中），室温孵育1小时。</li>
	<li>二抗孵育后，用DPBS洗涤三次。</li>
	<li>加入DAPI（将5 mg/mL储备液按1:1000比例稀释于DPBS中），室温孵育15分钟。随后用DPBS洗涤三次，最后一次洗涤后保留DPBS于培养板中，置于显微镜下观察。</li>
</ol>
4. 图像采集与分析
<ol>
	<li>使用荧光显微镜以 20 倍分辨率采集图像。</li>
	<li>使用 540 nm 激发滤光片采集 Ki67 以及 TUBB3 染色图像，使用 488 nm 激发滤光片采集 PAX6 图像，使用 358 nm 激发滤光片采集 DAPI 图像。</li>
	<li>从十个不同的随机视野采集图像用于分析。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件分析免疫细胞化学（ICC）图像。</li>
	<li>对于 TUBB3 和 PAX6 的分析，分别对红色和绿色信号的所有图像进行阈值处理，并对 DAPI 的蓝色信号强度进行处理。TUBB3 红色像素的平均强度和 PAX6 绿色像素的平均强度均以 DAPI 蓝色像素的平均强度进行归一化。</li>
	<li>对于 Ki67 分析，使用 ImageJ 软件中的自动细胞计数功能进行细胞计数。将 Ki67 阳性细胞数量以 DAPI 阳性细胞数量进行归一化。</li>
	<li>使用统计与绘图软件，通过非配对 t 检验 比较两组数据。数据应表示为三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）。当 p 值小于 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。</li>
</ol>

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<li>Meharena, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+syndrome-induced+senescence+disrupts+the+nuclear+architecture+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).</li>
<li>Sharma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+cell+cycle+defect+causes+impaired+neurogenesis+in+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome.</a> Front Genet. 13, 1007519(2022).</li>
<li>Maclean, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+hematopoiesis+in+trisomy+21+as+revealed+through+in+vitro+differentiation+of+isogenic+human+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).</li>
<li>Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+Down+syndrome+and+isogenic+euploid+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 67, 103041(2023).</li>
<li>Yu, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究描述了一种高效的、用于同基因型正常核型人诱导多能干细胞（Euploid hiPSCs）与唐氏综合征人诱导多能干细胞（DS hiPSCs）的非定向单层皮质神经分化方案。由于细胞以单层形式培养，其对培养条件的暴露更为充分，而其他方案中常用的类胚体法在诱导iPSC分化时则难以实现同等程度的暴露14,16。尽管类器官系统的应用日益广泛，基于单层培养的神经分化系统在为细胞提供均一的分化环境方面仍具有优势。在基于类器官的系统中，由于其三维结构特性，可能形成类似局部模式化中心的活性区域。此外，类器官中的所有细胞无法均等地接触外源添加的生长因子，导致形态发生素梯度不受控制，这已在类器官中心区域出现细胞死亡的现象中得到证实。尽管类器官方法已有多种改进，但仍需通过其重现人类样本中观察到表型的能力来验证这些方法的有效性。如前所述，已有多个先前的方案未能重现唐氏综合征中受损的神经发生。因此，本研究优先采用基于单层的方法，以便在神经分化过程中实现更可控的培养条件。神经分化方法正在不断演进：一些方法可实现更快的神经分化<sup class="...

唐氏综合征（DS）或21三体综合征是最常见的染色体异常，也是智力障碍（ID）的首要原因1。DS胎儿发育过程中神经发生受损是导致DS患者智力障碍的原因之一2。人类DS胎儿研究表明，其脑重量和体积减少，神经元数量减少，星形胶质细胞增多3,4，且第II层和第IV层神经元分布异常5,6。此外，大脑皮层发育的第二阶段，即层状结构的形成，在DS中不仅延迟，而且结构紊乱7。
唐氏综合征（DS）的神经发育缺陷主要通过DS小鼠模型（如Ts65Dn、Ts1Rhr和Ts1cje8）进行研究。然而，由于小鼠与人类在生理和发育上的差异，这些小鼠模型无法完全重现DS研究中观察到的各种表型9，导致多项临床试验失败10。诱导性多能干细胞的发明11，12为利用直接来源于DS个体的细胞建模唐氏综合征神经系统损伤提供了新途径。然而，早期使用人iPSC建模DS神经发育缺陷的研究结果不一致，且无法充分解释在DS胎儿脑组织切片中观察到的神经发育异常13，14，15，16。例如，Shi等人发表的一项研究报告指出存在与DS相关的阿尔茨海默病表型，但在DS神经发生方面与整倍体对照组相比未发现差异15。类似地，Weick等人报告称DS的突触活性降低，但神经发生正常16。然而，这些研究中报道的DS正常神经发生与DS胎儿脑组织切片的实际观察结果不一致。随后，Hibaoui等人的一项研究报告了DS神经发生减少，这与DS胎儿脑组织切片的观察结果一致14。然而，该报告及另一项近期研究将DS神经前体细胞（NPCs）增殖能力下降归因为DS神经发生减少的原因14，17。然而，仅凭DS神经前体细胞增殖减少这一因素，仍无法解释DS胎儿脑发育过程中星形胶质细胞增多以及皮层分层出现延迟的现象。
在近期发表的研究中，开发出一种基于人类诱导多能干细胞（iPSC）的唐氏综合征（DS）神经发生障碍模型，该模型表现出神经发生能力降低。该模型发现，唐氏综合征中神经发生障碍源于神经发生阶段（即由多能干细胞生成神经前体细胞的阶段）的双相细胞周期缺陷。在神经发生阶段的前期，唐氏综合征神经前体细胞（DS NPCs）相较于同基因型正常核型神经细胞的增殖能力降低；而在神经发生阶段的后期，唐氏综合征神经前体细胞的增殖能力则较同基因型正常核型细胞增强18。
本文描述了一种将唐氏综合征（Down syndrome, DS）来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）及其同基因型正常核型hiPSCs分化为皮层神经元的逐步详细实验方案。该方法的总体目标是提供一份详尽、分步的操作流程，用于将一对DS来源的hiPSCs及其同基因型正常核型hiPSCs定向分化为皮层神经元，重点在于模拟与DS相关的神经发生缺陷。本方案旨在为研究导致DS神经发生障碍的细胞与分子机制提供一个稳定且可重复的实验体系。
本方案的开发原理是利用发育神经生物学的原理，使多能干细胞分化为皮层神经元，从而识别由疾病或障碍引起的表型。该方案旨在通过避免使用cAMP或DAPT等化合物，以最简化的方式实现iPSC的神经分化，因为这些化合物可能分别掩盖由Ca++通道或NOTCH通路缺陷引起的疾病表型。同样，也避免使用抗坏血酸、BDNF和GDNF，因为这些物质可能通过增强神经发生而掩盖其他神经系统疾病相关的表型。
与替代方法相比，该技术的优势在于能够稳健地重现唐氏综合征（DS）胎儿脑组织切片中观察到的神经表型。值得注意的是，与小鼠模型相比，基于人诱导多能干细胞（hiPSC）的系统避免了物种间的差异，为研究人类特有的神经发育过程提供了更具相关性的模型9，但迄今为止，该系统一直未能重现自DS胎儿期开始出现的神经发生障碍。此外，使用同基因型的hiPSC配对细胞可减少变异性，增强所观察到的表型差异的可靠性。本实验方案将特别适用于研究神经发育障碍和人类神经发生的科研人员，尤其适用于那些希望模拟唐氏综合征中人类特有特征，或致力于开发针对21三体相关神经发生缺陷的治疗干预措施的研究者。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;MEF培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>终浓度10%</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;hiPSC培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout血清替代物（KOSR）</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>终浓度20%</td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>35050061</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇（1000X）</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DDM培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>35050061</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>Albumax（10%）</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>11020-021</td><td>终浓度为0.5 X的10% Albumax</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;NPC培养基：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDM培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17502048</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50X），不含维生素A</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>12587010</td><td>终浓度1X</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;神经分化培养基（ND）：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDM培养基</td><td></td><td></td><td>体积的1/2</td></tr><tr><td>Neurobasal培养基</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td>体积的1/2</td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17502048</td><td>终浓度0.5 X</td></tr><tr><td>B-27添加剂（50X）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504044</td><td>终浓度0.5 X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>35050061</td><td>Neurobasal培养基中的1X</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Neurobasal培养基中的1X</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫染色所用抗体和试剂：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>4%</td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0.20%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Hyclone</td><td>A7979-50ML</td><td>1.00%</td></tr><tr><td>纯化的抗微管蛋白&amp;beta;-3（TUBB3）（TUJ1）</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>1:500稀释</td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594标记</td><td>Life Tech Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A21203</td><td>1:250稀释</td></tr><tr><td>纯化的小鼠抗人Ki67</td><td>BD Pharmingen</td><td>550609</td><td>1:100稀释</td></tr><tr><td>纯化的抗PAX6</td><td>BioLegends</td><td>901302</td><td>1:100稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG</td><td>Life Tech Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A21206</td><td>1:250稀释</td></tr><tr><td>DAPI溶液（5 mg/mL）</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000稀释</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞解离液（Accutase）&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>A11105-01</td><td>即用型工作液</td></tr><tr><td>ROCK抑制剂（RI）&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem&amp;nbsp;</td><td>Y27632</td><td>终浓度10 mM/ml</td></tr><tr><td> dorsomorphin&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem&amp;nbsp;</td><td>S7306</td><td>终浓度0.125 nM/ml</td></tr><tr><td>含钙、镁的DPBS（DPBS+ Ca, Mg）</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14040133</td><td>即用型工作液</td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>14190136</td><td>即用型工作液</td></tr><tr><td>明胶A型</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G2500-100G</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>人胚胎干细胞认证的基底膜基质（Matrigel GFR）&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>356230</td><td>1 mg原液按1:240稀释</td></tr><tr><td>0.05%胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>0.40%</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>100-18B</td><td>终浓度25 ng/ml</td></tr><tr><td>胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17104-019</td><td>终浓度1 mg/ml</td></tr></tbody></table>

体外利用人诱导性多能干细胞模拟唐氏综合征神经发生

In Vitro Modeling of Down Syndrome Neurogenesis Using Human-Induced Pluripotent Stem Cells

唐氏综合征（DS）由21号染色体多出一条拷贝引起，是智力障碍的主要病因之一。导致该智力障碍的关键因素之一是从胎儿期开始即出现的神经发生障碍。为了研究这些神经发育异常，利用唐氏综合征患者细胞建立的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）提供了一个有价值且相关的研究模型。本文描述了一种全面的实验方案，用于重现唐氏综合征胎儿阶段所观察到的神经发生障碍。该方案采用一对细胞系：一为具有三条21号染色体的唐氏综合征hiPSCs，另一为与其基因背景相同的正常二倍体hiPSCs（具有两条21号染色体）。重要的是，本方案成功重现了唐氏综合征相关的神经发生障碍，并发现其根本原因在于双相细胞周期缺陷，即在神经发生早期阶段，唐氏综合征神经前体细胞（NPC）增殖减少，而在神经发生晚期阶段，其增殖反而增强。唐氏综合征NPC在神经发生晚期阶段的异常增殖导致细胞退出细胞周期的时间延迟，从而减少了由唐氏综合征NPC生成的终末分裂后神经元数量。本方案包括hiPSCs的培养、向神经谱系分化（在神经发生阶段表现出双相细胞周期缺陷）以及后续对唐氏综合征细胞神经分化能力降低的验证等详细步骤。通过采用该方法，研究人员可建立一个稳健的实验体系，模拟唐氏综合征的神经发育状况，从而深入探究21三体所导致的脑发育特异性改变。

将单细胞悬浮的重编程人iPSCs接种至合格的基质包被培养皿中，并通过去除bFGF启动分化。为抑制非外胚层分化，自分化第2天至第18天加入BMP信号通路抑制剂Dorsomorphin。21。为进一步促进神经发生阶段的前体细胞分化，将单细胞悬液以低密度重新接种至合格的基质上（图1）再持续培养6-10周以观察早期神经分化。在神经分化阶段（第二阶段）结束后，第85天的分析显示，与同基因型正常核型细胞相比，唐氏综合征（DS）培养体系中TUBB3+神经元显著减少。图2A). 定量分析显示，DS 培养物中 TUBB3+ 神经元数量减少了约两倍（图2B）。这表明DS细胞的神经元分化能力降低，与DS胎儿脑组织切片的观察结果一致，证明了该方法的可靠性 体外 本研究中使用的DS神经发生模型。
为了探究唐氏综合征（DS）中神经元数量减少的根本原因，采用Ki67免疫...

本方案概述了一种利用唐氏综合征（DS）人源诱导多能干细胞（iPSCs）重现唐氏综合征神经发生障碍的方法。该方案确定了双相细胞周期缺陷是导致唐氏综合征神经发生受损的原因，为理解与唐氏综合征相关的异常神经发生的细胞和分子机制提供了一个可靠的平台。

唐氏综合征（Down syndrome，DS）由21号染色体多出一条引起，是导致智力障碍的主要原因。其中，导致该病症的一个关键因素是……

长期研究重点是寻找唐氏综合征神经系统疾病潜在的治疗方法。目前我们的研究重点是唐氏综合征导致的神经发生障碍，这是智力障碍的主要原因。我们发现，唐氏综合征的神经发生障碍是由双相细胞周期缺陷引起的，这与普遍认为该障碍仅源于唐氏综合征神经前体细胞衰老的观点相反。利用本论文所述基于人iPSC的方案鉴定双相细胞周期缺陷，将推动发育潜能治疗策略的发展，该策略需同时考虑细胞周期的两个阶段：早期增殖能力降低，以及晚期无法退出细胞周期。首先，在完全人iPSC培养基、DPBS、细胞解离液以及添加了25纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子的饲养层条件培养基中加入10微摩尔的ROCK抑制剂。将所有试剂预热至37摄氏度。取一个饲养层上培养的iPSC六孔板。用移液器吸出已分化的克隆，并加入新鲜的完全人iPSC培养基。将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育2小时。孵育后，用不含钙和镁的DPBS洗涤各孔一次。然后，向每孔加入一毫升细胞解离溶液。将培养板置于37°C的二氧化碳培养箱中孵育12至14分钟。在倒置显微镜下观察细胞。如果大部分细胞已脱落，但仍有部分细胞贴壁，可轻轻从培养板侧壁敲击。每孔加入 3 mL 含钙和镁的 DPBS，以稀释细胞解离液。用5毫升移液器轻柔吹打2至3次，以打散细胞团块，同时避免产生气泡。将细胞通过40微米细胞筛滤入50毫升离心管2中。在室温下以200 × g离心5分钟。使用真空抽吸系统轻轻吸除上清液。现在，将细胞重悬于 10 毫升人 iPSC 培养基中。将所有悬浮细胞转移至经 0.1% 明胶包被的 15 厘米培养皿中，并在二氧化碳培养箱中孵育。将含细胞的培养基收集至离心管 2 中。在室温下以200 ×g离心五分钟。然后使用真空抽吸系统轻轻吸除培养基。将细胞重悬于1毫升饲养层细胞条件培养基中，该培养基添加有25纳克/毫升的bFGF和10微摩尔的ROCK抑制剂。细胞计数后，制备浓度为每毫升30,000至50,000个细胞的细胞悬液。将悬浮液接种至培养板中。两天后，将饲养层条件培养基更换为神经前体细胞（NPC）培养基。按照指定时间，在第2天和第18天更换培养基。第28天，将孔板中的培养基更换为添加了10微摩尔ROCK抑制剂的NPC培养基。然后将孔板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育2小时。孵育结束后，吸去上清液，并用无钙无镁的DPBS洗涤孔板一次。向每个孔中加入一毫升细胞解离溶液。然后在倒置显微镜下以4倍放大倍数观察细胞。接着，将三毫升含钙和镁的DPBS缓冲液加入到培养板的每个孔中。用5毫升移液器轻轻吹打悬浮液，打散任何团块。将细胞悬液通过置于50毫升离心管2上的40微米滤网过滤。离心，并如前所述吸除上清，然后将沉淀重悬于1毫升添加了含维生素A的B27的指定分化培养基中。使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞。 然后将50,000个细胞接种至经合格基质包被的48孔板的每个孔中。在第33天，将培养孔中的培养基更换为神经分化培养基。与同基因背景的正常二倍体细胞相比，唐氏综合征细胞培养物中TUBB3阳性神经元数量显著减少，在第85天时减少约两倍。与同基因型的整倍体细胞相比，在唐氏综合征细胞培养物的早期神经发生阶段，KI67阳性细胞的比例显著降低，大约减少了四倍。在晚期神经发生阶段，大多数同基因型整倍体细胞退出细胞周期，KI67染色极少，而大多数唐氏综合征细胞仍呈KI67阳性，增加了约五倍。另一对唐氏综合征及同基因型整倍体人诱导多能干细胞（iPSCs）证实，在神经分化结束时，唐氏综合征细胞培养物中TUBB3阳性神经元水平降低，PAX6阳性神经前体细胞增多，其中TUBB3阳性神经元减少了两倍，PAX6阳性细胞则增加两倍以上。

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