Name: 通过细胞外囊泡释放 LC3-II 与细胞内 LC3 阳性囊泡积累的关系的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 探索自噬调控TDP-43蛋白通过细胞外囊泡释放的机制，以HeLa细胞为模型研究ALS和FTLD-TDP等神经退行性疾病的潜在治疗靶点。该方法结合免疫印迹与超速离心技术分离囊泡组分。

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本工作获得了日本科学技术振兴机构（JSPS）KAKENHI [资助号 23K06837]（日本东京）和武田科学基金会（日本大阪）向 Y.T. 提供的资金支持。作者感谢英国剑桥大学医学研究所 David C. Rubinsztein 博士提供 HeLa 细胞。

1. 从 HeLa 细胞培养基中制备细胞、P1 和 P2 EV 组分
<ol>
	<li>从 HeLa 细胞培养基中制备 P1 和 P2 EV 组分
	<ol>
		<li>第 1 天
		<ol>
			<li>使用细胞计数仪计数细胞，并将 1 × 106 个细胞接种至含有培养基的 6 cm 培养皿中，培养基成分为 DMEM 高糖培养基、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素。将细胞在 37 °C、5% CO2 及受控湿度条件下孵育 24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第 2 天（可选）
		<ol>
			<li>制备 20 µM 的 siRNA 溶液。</li>
			<li>在低吸附离心管中混合 100 µL 低血清培养基和 3 µL siRNA，制备 溶液 A。</li>
			<li>在低吸附离心管中混合 100 µL 低血清培养基和 5 µL 转染试剂，制备 溶液 B。</li>
			<li>将 溶液 A 与 溶液 B 混合，室温（RT）孵育 5 分钟。</li>
			<li>将 溶液 A 与 溶液 B 的混合物加入 HeLa 细胞培养用培养基中。将细胞在 37 °C、5% CO2 及受控湿度条件下孵育 24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第 3 天
		<ol>
			<li>用 PBS 洗涤细胞，并在 37 °C、5% CO2 及受控湿度条件下，加入 500 µL 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液处理 5 分钟。</li>
			<li>向细胞中加入 2.5 mL 培养基，使用带有 200 µL 吸头的巴斯德移液管制备单细胞悬液。</li>
			<li>使用细胞计数仪计数细胞，并将 1 × 106 个细胞接种至 10 cm 培养皿中。将细胞在 37 °C、5% CO2 及受控湿度条件下孵育 24 小时。 
			注：为进行免疫印迹分析所需的培养基中 EV 的收集，至少需准备 1 × 106 个细胞。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第 4 天
		<ol>
			<li>制备培养基（见步骤 1.1.1.1），其中添加溶剂（DMSO）或 100 nM 巴佛洛霉素 A1（Baf）。</li>
			<li>用含溶剂或 100 nM Baf 的培养基处理细胞，并在 37 °C、5% CO2 及受控湿度条件下孵育 24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第 5 天
		<ol>
			<li>收集 10 cm 培养皿中的全部培养基，转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。 
			注：10 cm 培养皿中剩余的细胞将用于第 1.2.1 节。</li>
			<li>为分离 P1 EV 组分，将 3,000 × g 离心后的上清液转移至离心管中，然后在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 1 小时。</li>
			<li>为分离 P2 EV 组分，将 20,000 × g 离心后的上清液转移至超速离心管中，然后在 4 °C 条件下以 110,000 × g 离心 1 小时。</li>
			<li>用实验室擦拭纸擦去离心管内壁多余的水分，将沉淀用 50 µL 2x 上样缓冲液 [2.5% SDS、125 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 6.8）、30% 甘油、10% 2-巯基乙醇、0.4% 溴酚蓝] 重悬，制备 P1 EV 组分。</li>
			<li>倾去上清液，用实验室擦拭纸擦去超速离心管内壁多余的水分，然后将沉淀用 50 µL 2x 上样缓冲液重悬，制备 P2 EV 组分。</li>
			<li>将 P1 和 P2 EV 组分在金属浴中 100 °C 孵育 10 分钟。 
			注：在 20,000 × g 和 110,000 × g 离心后，切勿振荡离心管，以免意外丢弃沉淀。倾倒上清液时倾斜离心管后，应保持管体位置固定，防止沉淀再次浸入残留上清液中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从培养的 HeLa 细胞中制备细胞组分
	<ol>
		<li>第 5 天
		<ol>
			<li>将 10 cm 培养皿中的培养基转移至 15 mL 离心管后，用 PBS 洗涤 10 cm 培养皿中的细胞，并在 37 °C、5% CO2 及受控湿度条件下，加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA 溶液处理 5 分钟。</li>
			<li>向细胞中加入 8 mL 生长培养基，然后使用带有 200 µL 吸头的巴斯德移液管吹打细胞，制备单细胞悬液。</li>
			<li>将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。</li>
			<li>用移液器吸除上清液，向细胞沉淀中加入 PBS，然后在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>用移液器吸除 PBS，并在含 1% 萨尔科西尔的 1 mL A68 缓冲液 [10 mM Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5，0.8 M NaCl，1 mM 乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N,N-四乙酸（EGTA）] 中超声处理细胞沉淀。</li>
			<li>使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定细胞裂解液的蛋白浓度。</li>
			<li>将 300 µL 细胞裂解液与 100 µL 4x 上样缓冲液混合，在金属浴中 100 °C 孵育 10 分钟，制备细胞组分。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫印迹分析
<ol>
	<li>通过 SDS-PAGE 分离各样品中的等量蛋白质18。</li>
	<li>将分离后的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>转移完成后，用封闭剂在室温下封闭膜 20 分钟。</li>
	<li>将封闭后的膜在含有 10%（v/v）小牛血清的 Tris 缓冲液中，与指定的一抗在室温下孵育过夜。</li>
	<li>用 Tris 缓冲液洗涤膜 5 秒，然后在室温下与生物素标记的二抗孵育 2 小时。</li>
	<li>用 Tris 缓冲液洗涤膜 5 秒，然后在室温下与试剂盒中的溶液 A 和溶液 B（各 0.4% v/v）的 Tris 缓冲液孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤膜，然后在含有 0.04%（w/v）二氨基联苯胺、0.8%（w/v）NiCl2·6H2O 和 0.3%（v/v）H2O2 的 PBS 中孵育，以进行条带的比色检测。 
	注意：也可采用化学发光法检测信号。</li>
	<li>使用扫描仪对膜图像进行数字化，并使用 Fiji 软件进行密度分析。
	<ol>
		<li>在 Fiji 中打开数字化图像，点击 Image | Type | 8-bit 将 RGB 彩色图像转换为 8 位图像。</li>
		<li>点击 矩形工具，通过拖动调整矩形大小以包围条带区域，然后点击 Analyze | Gels | Select First lane 确定待分析的条带。</li>
		<li>将矩形移至第二条及后续条带位置，并通过点击 Analyze | Gels | Select Next Lane 依次确定待分析条带。</li>
		<li>识别到最后一条带后，点击 Analyze | Gels | Plot Lanes 对矩形区域进行密度扫描测量。</li>
		<li>用直线包围条带的信号区域，点击 魔棒工具，并在区域内点击以计算条带的信号强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 自噬体和自噬溶酶体数量的分析
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>使用细胞计数仪对HeLa细胞进行计数，并将1 × 105个表达LAMP1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞接种至3.5 cm培养皿中。于37 °C、5% CO2及恒定湿度条件下培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天（可选）
	<ol>
		<li>在3.5 cm培养皿中执行第1.1.2节所述步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>弃去3.5 cm培养皿中的培养基。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞，加入400 µL含0.25%胰蛋白酶和1 mM EDTA的溶液，于37 °C、5% CO2及恒定湿度条件下孵育5分钟。</li>
		<li>向细胞中加入1.6 mL生长培养基，使用巴斯德移液管吹打制成单细胞悬液。</li>
		<li>使用细胞计数仪对细胞进行计数，并将1 × 104个细胞接种至8孔腔室盖玻片上。于37 °C、5% CO2及恒定湿度条件下培养24小时。 
		注：根据第3.4.2节所述，分别用DMSO或Baf处理，为对照组和STX6敲低细胞各准备两个腔室孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天
	<ol>
		<li>准备不含酚红的生长培养基（无酚红DMEM，含10% FBS和1%青霉素/链霉素），其中分别加入溶剂（DMSO）或100 nM Baf（溶于DMSO）。</li>
		<li>将原培养基更换为不含酚红并含有溶剂或100 nM Baf的培养基，孵育4小时。 
		注：为评估Baf对自噬体和自噬溶酶体数量的影响，需设置经溶剂处理的细胞作为对照组。</li>
		<li>在观察前，用0.33 µg/mL Hoechst 33342对细胞核染色30分钟。</li>
		<li>使用共聚焦激光显微镜配备60倍物镜进行活细胞成像，并采集十个不同的视野图像。
		<ol>
			<li>在Fiji中打开RGB合并图像，点击图像 | 颜色 | 拆分通道，将其拆分为红、绿、蓝三个独立的图像通道。</li>
			<li>对每张图像的红、绿信号，通过点击图像 | 调整 | 阈值设置固定阈值。</li>
			<li>点击分析 | 分析颗粒，统计红或绿信号阳性的区域数量。勾选汇总框，点击确定，记录计数结果，以识别与自噬体和溶酶体相关的囊泡。</li>
			<li>为将绿色图像叠加到红色图像上，点击编辑 | 粘贴控制，将传输模式设为AND。复制绿色图像并粘贴至红色图像上进行合并，以突出显示红绿信号双阳性的区域。</li>
			<li>为识别自噬溶酶体数量，点击分析 | 分析颗粒，统计红绿信号双阳性区域的数量。勾选汇总框，点击确定，记录计数部分的数值，以识别与自噬体和溶酶体相关的囊泡。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将自噬溶酶体和自噬体的总数除以细胞总数，计算每个细胞中自噬溶酶体和自噬体的数量。 
		注：在三次独立实验中，每组至少计数35个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成泡沫体形成的分析
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>使用细胞计数器计数HeLa细胞数量，并将1 × 105个细胞接种至3.5 cm培养皿中。在37 °C、5% CO2及湿度控制条件下培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天（可选）
	<ol>
		<li>执行第1.1.2节中描述的步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>按照步骤3.3.1–3.3.2所述方法制备单细胞悬液。</li>
		<li>使用细胞计数器计数细胞，并将1 × 105个细胞接种至3.5 cm培养皿中。在37 °C、5% CO2及湿度控制条件下培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天
	<ol>
		<li>在低吸附离心管中混合1 µg pEGFP-C1-hAtg13质粒、3 µL DNA转染试剂和100 µL低血清培养基。将混合物孵育20分钟，然后加入培养基中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2及湿度控制条件下继续培养细胞24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天
	<ol>
		<li>按照步骤3.3.1–3.3.2所述方法对细胞进行胰酶消化处理。</li>
		<li>向细胞中加入2.5 mL完全培养基。使用巴斯德移液管吹打混匀，制备单细胞悬液。</li>
		<li>使用细胞计数器计数细胞，并将1 × 104个细胞接种至&#160;8孔盖玻片中。在37 °C、5% CO2及湿度控制条件下培养24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第6天
	<ol>
		<li>按照步骤3.4.1–3.4.4，使用共聚焦激光显微镜对第4.5.3步所得细胞进行活细胞成像。采集十个不同的图像帧。
		<ol>
			<li>按照步骤3.4.4.1–3.4.4.3，将RGB合并图像拆分为红色、绿色和蓝色各通道图像，对每张图像中的绿色信号设定统一阈值，并测定GFP信号强度。记录总面积部分的数值，以确定GFP-ATG13的信号强度。</li>
			<li>将总信号强度除以检测的细胞数，计算单个细胞的信号强度。 
			注意：在三次独立实验中，每次至少计数34个细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assessing LC3-II-Positive EV Release in Autophagy with Impaired Lysosome Fusion

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
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<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

免疫印迹研究揭示了细胞组分、富含微囊泡的P1细胞外囊泡（EV）组分以及富含外泌体的P2 EV组分中LC3-II和TSG101的水平。活细胞成像用于观察自噬体、自噬溶酶体和omegasomes，以探究STX6基因敲低是否影响自噬过程。这些综合结果表明，STX6基因敲低会影响LC3-II阳性EV的释放，可能与自噬通路的失调有关。该方法的一个关键优势在于能够区分来源于不同途径的大、小EV。利用针对微囊泡、外泌体或高尔基体的特异性标志物进行流式细胞术分析，可进一步阐明STX6基因敲低如何影响LC3-II阳性囊泡的释放。
然而，免疫印迹研究的一个局限性在于，尚不清楚在Baf处理条件下，STX6 敲低后EV组分中LC3-II水平的升高是由于释放的LC3-II阳性囊泡数量增加，还是每个EV中LC3-II水平升高所致。为了区分这两种可能性，可通过纳米颗粒追踪分析或流式细胞术分析对囊泡进行计数，以确定LC3-II阳性囊泡的数量是否增加，或每个囊泡中的LC3-II水平是否升高。
该实验方案中的一个关键步骤是对培养基进行分级分离，以制备细胞外囊泡（EV）组分。EVs 在离心管中表现为微小的沉淀物。为了制备可比的 EV 组分，离心后必须仔细转移或弃去上清液，以避免稀释 EV 沉淀物中的蛋白质浓度。为检测细胞组分对 EV 组分的污染情况，本研究比较了细胞质蛋白 unc-51 样自噬激活激酶 1（ULK1）和核蛋白 PCNA 在不同组分间的表达水平（补充图 S1）。细胞组分中的蛋白质浓度通常反映细胞数量，但细胞内蛋白质浓度会受到细胞周期阶段20或蛋白质稳态失衡21的影响。自噬对于维持蛋白质稳态至关重要22。通过 STX6 沉默或 Baf 处理导致的自噬失调可能会影响蛋白质浓度，且该影响与细胞数量无关。
通过siRNA转染实现STX6基因的敲低，通过DNA转染实现GFP-ATG13的过表达。转染效率受细胞类型、密度和数量的影响。siRNA序列的有效匹配也可能影响敲低效率。当转染效率较低时，需进行相应调整。
目前的结果表明，在巴佛洛霉素（Baf）处理条件下，STX6 敲低增加了EV组分中自噬小体标志物LC3-II的水平，但不影响TSG101的水平。这提示当自噬小体-溶酶体融合受到抑制时，STX6抑制来源于自噬小体的囊泡释放，但不影响来源于多泡体（MVBs）的囊泡释放。
STX6 敲低在生长条件下也增加了细胞内 LC3-II 水平，表明 STX6 调控自噬过程。事实上，STX6 敲低增加了自噬小体和自噬溶酶体的数量，但并未促进omegasome的形成。自噬溶酶体的成熟可引发自噬性溶酶体重建23。STX6 可能介导了自噬溶酶体的成熟过程，其功能缺失可能导致未成熟自噬溶酶体数量增加，从而因抑制自噬性溶酶体重建而扰乱自噬小体与溶酶体的融合。
Baf处理增加了EV组分中的STX6水平，即使其表达被下调。先前的研究表明，当溶酶体功能受到抑制时，与自噬体相关的囊泡会以EV形式释放13,14。已知STX6定位于与自噬体相关的囊泡，例如含有A族链球菌（GAS）的类似自噬体的空泡24。因此，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，STX6可能定位于作为EV释放的自噬体相关囊泡上。
TDP-43 病理的扩散与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和TDP-43蛋白病相关的额颞叶变性（FTLD-TDP）的进展密切相关3。尽管目前尚不清楚 TDP-43 病理如何在脑和脊髓中扩散，但细胞外囊泡（EV）通路可能介导了这一过程。先前的研究表明，自噬-溶酶体通路的失调会导致含有 TDP-43 的 LC3-II 阳性细胞外囊泡的释放13。本研究提示，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，STX6 在调控细胞外囊泡释放中发挥一定作用。通过免疫印迹法检测细胞及细胞外囊泡组分中 LC3-II 水平的方法，将在未来的研究中具有重要参考价值。

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是一种广泛表达的异质性核核糖核蛋白，参与调控外显子剪接、基因转录和mRNA稳定性，这些功能对细胞存活至关重要1,2。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）等神经退行性疾病中，原本位于细胞核内的TDP-43蛋白异常积聚于细胞质中。这种定位改变导致TDP-43在细胞核中功能丧失，同时在细胞质中产生毒性获得性功能。TDP-43的病理性积聚始于脑和脊髓的特定区域，并以类似朊病毒的方式在这些区域间扩散，该过程与疾病进展密切相关3。然而，TDP-43病理在脑和脊髓中扩散的确切机制仍不清楚。
TDP-43 通过细胞外囊泡（EVs）分泌，且在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和TDP-43蛋白病相关的额颞叶变性（FTLD-TDP）患者的血浆及脑脊液（CSF）中检测到升高的TDP-43水平4,5,6。来自确诊为ALS和FTLD患者的脑脊液可诱导人胶质瘤细胞内源性TDP-43的细胞内错误定位和聚集7。因此，通过EVs释放到细胞外的TDP-43可能介导了TDP-43病理在细胞间的传播。
自噬是一种高度保守的细胞降解机制，其过程涉及将不需要的物质包裹在双层膜囊泡（即自噬体）中，自噬体以LC3为标志。这些自噬体与溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）阳性的溶酶体融合，形成自噬溶酶体（LC3+/LAMP1+），从而导致其内容物的降解8。组织学分析表明，在散发性肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者神经元中，包裹包涵体的自噬体出现积聚9。一些家族性ALS和额颞叶变性伴TDP-43蛋白病（FTLD-TDP）的致病基因与自噬调控相关10,11,12。这些发现提示，ALS和FTLD-TDP患者的自噬功能受到抑制。
先前的研究表明，当自噬体-溶酶体融合受到抑制时，TDP-43 会通过携带自噬体标志物 LC3-II 的细胞外囊泡（EVs）分泌13。自噬-溶酶体通路的失调不仅可能导致 TDP-43 在细胞内积聚，还可能促进 TDP-43 通过 EVs 向细胞外释放14。然而，目前尚不清楚携带 LC3-II 的 EVs 是如何被释放的，以及这一过程在 TDP-43 病理扩散中的重要性如何。
EVs 分为大 EVs（直径为 100 至 1000 nm），由细胞表面出芽产生；以及小 EVs（直径为 50 至 150 nm），由晚期内体膜向内出芽（即外泌体）和高尔基体产生。为了分别收集大 EVs 和小 EVs，我们进行连续离心，分别在 20,000 × g 和 110,000 × g 条件下离心收集沉淀。P1 EV 组分（20,000 × g 沉淀）用于收集大 EVs，P2 EV 组分（110,000 × g 沉淀）用于收集小 EVs15。通过免疫印迹检测连续离心获得的大 EVs 和小 EVs 中 LC3-II 水平的方法稳定且可重复16。除了分析 EVs 中的 LC3-II 水平外，分析自噬溶酶体和 omegasome 的形成有助于理解自噬失调如何导致 LC3-II 阳性 EVs 的释放。本文研究表明，当自噬体-溶酶体融合受阻时，SNARE 蛋白 syntaxin 6（STX6）在 LC3-II 阳性 EVs 释放过程中发挥抑制作用，而 STX6 通常促进转运囊泡向靶膜移动17。

<table><tbody><tr><td>0.25 % 胰蛋白酶 EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液枪头</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>移液</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>用于&lt;br/&gt;样品缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>用于 DAB 溶液的试剂</td></tr><tr><td>3.5 cm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>铝块恒温浴（干式恒温仪）</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>抽滤器</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>吸取溶液</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>巴佛洛霉素 A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔 IgG 抗体</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>免疫印迹二抗</td></tr><tr><td>生物素标记的马抗小鼠 IgG 抗体</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>免疫印迹二抗</td></tr><tr><td>Blocking One</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>用于免疫印迹的封闭剂</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td>用于&lt;br/&gt;样品缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>小牛血清</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>扫描仪</td></tr><tr><td>Centrifuge 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>双腔计数板</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>Digital Sonifier 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>nacalai tasque</td><td>09659-14</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>培养基</td></tr><tr><td>无酚红 DMEM 培养基</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>培养基</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&amp;nbsp;</td><td>348-01311</td><td>用于 A68 溶液的试剂</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>version 16.16.27</td><td>统计分析</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Reference No. 24</td><td>version 1.68</td><td>统计分析</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>图像分析工具</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>用于&lt;br/&gt;样品缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Dojindo&amp;nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>用于 DAB 溶液的试剂</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>清洁擦拭纸</td></tr><tr><td>低吸附离心管</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA 和 DNA 转染</td></tr><tr><td>LSM780 共聚焦激光显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单克隆小鼠抗 LC3 抗体</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>免疫印迹一抗</td></tr><tr><td>氯化镍(II)六水合物</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>用于 DAB 溶液的试剂</td></tr><tr><td>N-月桂酰肌氨酸钠盐</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 减血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>siRNA 和 DNA 转染</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>多克隆兔抗 PCNA 抗体</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>免疫印迹一抗</td></tr><tr><td>多克隆兔抗 syntaxin 6 抗体</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>免疫印迹一抗</td></tr><tr><td>多克隆兔抗 TSG101 抗体</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>免疫印迹一抗</td></tr><tr><td>多克隆兔抗 ULK1 抗体</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>免疫印迹一抗</td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯膜</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>用于免疫印迹的试剂</td></tr><tr><td>R</td><td>R development core team</td><td>version 4.4.1</td><td>统计分析</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA 转染试剂</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>用于转染的 siRNA</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>用于 Tris&lt;br/&gt;缓冲液和 A68 溶液的试剂</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>用于&lt;br/&gt;样品缓冲液的试剂</td></tr><tr><td>SPARK 微孔板读板仪</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi 阴性对照双链体，Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>siRNA 转染</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>用于 A68 溶液的试剂</td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪（带热敏打印机）</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>恒温仪</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>孵育</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>DNA 转染试剂</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>DNA 转染试剂</td></tr><tr><td>三羟甲基氨基甲烷</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>用于 Tris 缓冲液、样品缓冲液和 A68 溶液的试剂</td></tr><tr><td>0.40% 台盼蓝染液</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>超透明开口离心管，16 x 96 mm&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>用于收集 P1 EV 组分</td></tr><tr><td>超透明离心管，14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>用于收集 P2 EV 组分</td></tr><tr><td>Vectastain ABC 标准试剂盒</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>免疫印迹</td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>As One</td><td>1-4640-02</td><td>洗涤膜</td></tr><tr><td>&amp;mu;-Slide 8 孔高壁板</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

通过细胞外囊泡评估lc3-ii的释放及其与细胞内lc3阳性囊泡积聚的关系

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

（大）自噬是一种基本的细胞降解途径。在此过程中，称为自噬体的双层膜囊泡包裹细胞质内容物，随后与溶酶体融合以实现降解。除了经典的降解功能外，自噬相关基因还调控一种分泌途径，涉及炎性分子、组织修复因子和细胞外囊泡（EVs）的释放。值得注意的是，在影响脑和脊髓的神经退行性疾病中，致病性蛋白在细胞间传播的过程凸显了理解这一现象的重要性。最近的研究表明，肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性中的关键蛋白——43 kDa反式激活反应DNA结合蛋白（TDP-43），可通过富含自噬体标志物微管相关蛋白1A/1B轻链3B-II（LC3-II）的细胞外囊泡以自噬依赖的方式释放，尤其是在自噬体与溶酶体融合受阻时更为显著。
为了阐明LC3-II阳性细胞外囊泡（EV）形成与释放的潜在机制，必须建立一种简便且可重复的方法，用于评估细胞内和细胞外的LC3-II阳性囊泡。本研究提供了一种详细的实验方案，通过差速离心法分离细胞和EV组分，并利用免疫印迹法检测其中的LC3-II水平。巴佛洛霉素A1（Baf）作为一种抑制自噬体-溶酶体融合的试剂，被用作阳性对照，以提高细胞内和细胞外LC3-II阳性囊泡的水平。肿瘤易感基因101（TSG101）则作为多泡体的标志物。应用该方案发现，在Baf处理的细胞中，通过siRNA介导的突触融合蛋白6（STX6）基因敲低——该基因是散发性克雅氏病的遗传风险因素——可显著增加EV组分中的LC3-II水平，但对TSG101水平无明显影响。这些结果表明，STX6可能在自噬体-溶酶体融合受损的条件下，负向调控LC3-II通过EV的细胞外释放。结合已有的自噬评估方法，该方案为研究特定分子在LC3-II阳性EV形成与释放过程中的作用提供了重要依据。

如先前研究所示，Baf处理增加了EV富集组分中TSG101（P1：P &lt; 0.01，P2：P = 0.012，通过EZR19中的双因素方差分析确定）和LC3-II（P1：P &lt; 0.01，P2：P &lt; 0.01，通过EZR19中的双因素方差分析确定）的水平。值得注意的是，Baf处理还增加了EV组分中STX6的水平（P1：P &lt; 0.01，P2：P &lt; 0.01，通过EZR19中的双因素方差分析确定）（图1A），提示STX6可能是EV的组分之一。在EV组分中未检测到增殖细胞核抗原（PCNA）。对细胞组分中STX6的免疫印迹分析显示，STX6的siRNA敲低使其水平降低了一半（图1B）。STX6敲低在对照和Baf处理条件下，均未影响细胞组分和EV组分中的TSG101水平（图1C）。然而，在对照处理条件下，STX6敲低增加了细胞组分中的LC3-II水平，但在Baf处理条件下则无此效应。STX6敲低在Baf处理条件下还增加了EV组分中的LC3-II水平（图1D）。这些结果表明，即使敲低效率并不显著，用于通过免疫印迹检测EV中LC3-II的方法也具有足够的灵敏度。此外，这些结果提示，STX6敲低可增加细胞内自噬小体数量，并在Baf处理条件下增强自噬小体相关囊泡的胞外释放。
为了进一步研究敲低STX6是否影响细胞内自噬小体和自噬溶酶体的数量，使用自噬小体标志物mCherry-LC3和溶酶体标志物LAMP1-GFP对自噬小体和溶酶体进行可视化观察。共聚焦活细胞成像显示，在表达LAMP1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞中存在GFP和mCherry阳性囊泡（图2A）。自噬溶酶体被鉴定为GFP和mCherry双阳性囊泡，而自噬小体被鉴定为GFP阴性、mCherry阳性囊泡。STX6敲低在对照处理条件下增加了自噬小体和自噬溶酶体的数量（图2B、C）。然而，在Baf处理条件下，STX6敲低对自噬小体和自噬溶酶体数量无显著影响（图2B、C）。
为了确定由于STX6基因敲低导致的细胞内自噬体数量增加是否源于自噬体形成的增强，我们通过检测omegasome（自噬体形成所必需的过程）标志物GFP-ATG13的信号强度来评估omegasome的形成。共聚焦活细胞成像提供了GFP-ATG13的整合图像，表明omegasome的形成（图3A）。STX6基因敲低降低了GFP-ATG13的信号强度（经EZR19中双因素方差分析确定，P = 0.023）。在载体处理条件下，STX6基因敲低对GFP-ATG13信号强度无显著影响；但在Baf处理条件下，该信号显著降低（图3B）。综上所述，这些结果表明，STX6基因敲低增加了LC3-II阳性囊泡的释放，从而导致自噬体相关囊泡的积累。
<img alt="使用siSTX6和Baf进行的蛋白质印迹分析；STX6、TSG101、LC3-II蛋白水平的柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：在对照或STX6 siRNA转染的HeLa细胞中，经溶剂或Baf处理后，细胞、P1和P2组分的免疫印迹结果。 HeLa细胞在转染对照或 STX6 siRNA。细胞P1（20,000 × g 沉淀）和 P2（110,000 × g 沉淀）组分被分离出来。A各组分的代表性免疫印迹图像，显示 STX6、TSG101、LC3 和 PCNA。B-D) 密度测定分析用于（BSTX6，（C) TSG101，以及（D) 通过免疫印迹图像对 LC3-II 进行分析。信号强度相对于对照组或 STX6 经siRNA转染并用溶剂或Baf处理的细胞。柱状图表示均值±标准误（N = 3）。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，***表示P < 0.001。 &lt; 0.05，通过双尾非配对检验 t-test 在 Excel 中进行。缩写：STX6 = syntaxin 6；Baf = bafilomycin A1；DMSO = 二甲基亚砜 TSG101 = 肿瘤易感基因101；LC3 = 微管相关蛋白1A/1B轻链3B；PCNA = 增殖细胞核抗原；S.E.M. = 均值的标准误 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，GFP，mCherry，Hoechst，siRNA对自噬体、自噬溶酶体的影响，示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：在载体处理和Baf处理条件下，转染对照或STX6 siRNA的共表达Lamp1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞的共聚焦图像分析。(A) 稳定表达LAMP1-GFP和mCherry-LC3的HeLa细胞转染对照或STX6 siRNA 48小时，随后用DMSO或400 nM Baf处理4小时。比例尺 = 20 µm。(B,C) 使用Fiji软件对(B)自噬体（LAMP1-GFP阴性、mCherry-LC3阳性点状结构）和(C)自噬溶酶体（LAMP1-GFP和mCherry-LC3双阳性点状结构）进行定量分析。柱状图数据以均值±标准误（S.E.M.）表示（N = 3）。*表示P &lt; 0.05，基于Excel中的双尾非配对t-检验。缩写：Lamp1 = 溶酶体相关膜蛋白1；LC3 = 微管相关蛋白1A/1B轻链3B；STX6 = 胞吐复合蛋白6；Baf = 溴莫匹林A1；GFP = 绿色荧光蛋白；S.E.M. = 均值标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，GFP和Hoechst可视化，蛋白质定位分析，柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：表达GFP-ATG13的HeLa细胞经对照或STX6 siRNA转染后，在溶剂处理或Baf处理条件下的共聚焦成像。（A）HeLa细胞先转染对照或STX6 siRNA，随后转染pEGFP-C1-hAtg13，并用DMSO或400 nM Baf处理4小时。比例尺 = 20 µm。（B）通过将各条件下的信号强度归一化至经Baf处理的对照siRNA转染细胞的信号强度来确定相对信号强度。柱状图显示了均值 ± S.E.M.（N = 3）。* 表示使用Excel进行双尾非配对t检验时P &lt; 0.05。缩写：hAtg13 = 人自噬相关基因13；STX6 = syntaxin 6；Baf = 巴佛洛霉素A1；DMSO = 二甲基亚砜；S.E.M. = 标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图 S1：转染对照 siRNA 并经 Baf 处理的 HeLa 细胞的全细胞、P1 和 P2 组分的免疫印迹分析。 HeLa 细胞转染对照 siRNA 后，用 100 nM Baf 处理 24 小时。随后制备各组分：全细胞组分、P1（20,000 × g 沉淀）和 P2（110,000 × g 沉淀）。代表性免疫印迹图像显示 ULK1 和 PCNA 在各组分中的水平，用于比较。缩写：Baf = bafilomycin A1；ULK1 = unc-51 like autophagy activating kinase 1；PCNA = proliferating cell nuclear antigen。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了通过免疫印迹法简洁评估细胞外囊泡（EVs）中自噬体标志物LC3-II水平的方法。对EVs中LC3-II水平、自噬溶酶体形成以及omegasome形成的分析表明，当自噬体与溶酶体融合受阻时，STX6在释放LC3-II阳性EVs中具有新的作用。

通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

（大）自噬是一种基本的细胞降解途径。在此过程中，称为自噬体的双层膜囊泡包裹……

我们的研究聚焦于以核蛋白TDP-43在细胞质中异常积聚为特征的进行性神经退行性疾病，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）或TDP-43蛋白病变型额颞叶变性（FTLD-TDP）。我们致力于阐明TDP-43病理如何以类似朊病毒的方式在脑内扩散。我们先前发现，TDP-43通过细胞外囊泡释放的过程由自噬功能失调所介导。FTLD-TDP 中的颗粒蛋白原（progranulin）促进此过程。下一步的挑战是阐明自噬如何调控含 TDP-43 的细胞外囊泡的生成与释放，这可能为肌萎缩侧索硬化症（ALS）或 FTLD-TDP 发现治疗靶点。首先，取培养的 HeLa 细胞，使用细胞计数器计数，并将一乘十的六次方个细胞接种至含培养基的六厘米培养皿中。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳及受控湿度条件下孵育24小时。接着，配制20微摩尔的siRNA溶液。取100微升低血清培养基与3微升siRNA于低吸附离心管中混合，制备溶液A。然后，取100微升低血清培养基与5微升转染试剂于低吸附离心管中混合，制备溶液B。随后，将溶液A与溶液B混合，并在室温下孵育5分钟。现在将溶液A和溶液B的混合物加入用于培养HeLa细胞的培养基中，孵育24小时。次日，用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度、5%二氧化碳及受控湿度条件下，用500微升0.25%胰蛋白酶和1毫摩尔EDTA溶液处理细胞5分钟。接着，向细胞中加入2.5毫升培养基，使用带有20微升吸头的巴斯德转移移液管，制备单细胞悬液。计数细胞后，将一乘以十的六次方个细胞接种至十厘米培养皿中，并按先前所示进行孵育。孵育结束后，准备含有溶剂对照或100纳米摩尔巴佛洛霉素A1的培养基。随后将细胞暴露于含有溶剂对照或100纳米摩尔巴佛洛霉素A1的培养基中，继续孵育24小时。次日，收集十厘米培养皿中的全部培养基。将收集的培养基转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以3,000 G离心10分钟，以去除细胞碎片。为分离P1细胞外囊泡组分，将3,000 G离心后的上清液转移至离心管中，在4°C条件下以20,000 G离心1小时。为了分离P2细胞外囊泡组分，将20,000 G离心后的上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下以110,000 G离心1小时。用实验室擦拭纸擦去离心管内壁多余的水分后，将离心管中残留的沉淀物重悬于50 µL的两倍浓度上样缓冲液中，以制备P1细胞外囊泡组分。然后通过倾倒法去除上清液。用实验室擦拭纸擦去管内多余的水分，并将超速离心管中剩余的沉淀物重悬于50 µL的2倍上样缓冲液中，以制备P2细胞外囊泡组分。将P1和P2细胞外囊泡组分置于95–100 °C金属浴中孵育10分钟。将培养基从10厘米培养皿转移至15毫升离心管后，用PBS清洗10厘米培养皿中的细胞。随后在37摄氏度、5%二氧化碳及受控湿度条件下，用2毫升0.25%胰蛋白酶和1毫摩尔EDTA溶液处理细胞5分钟。向细胞中加入8毫升生长培养基。使用带有200微升移液枪头的巴斯德转移移液管吹打细胞，制备单细胞悬液。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在4摄氏度下以1,000 G离心10分钟。然后使用吸液装置移除上清液。向细胞沉淀中加入 PBS，于 4 摄氏度、1,000 G 离心 5 分钟。去除 PBS 后，在含有 1% sarcosil 的 1 毫升 A68 缓冲液中对细胞沉淀进行超声处理。取 300 微升细胞裂解液与 100 微升 4 倍上样缓冲液混合。将混合物置于加热块上，在 100 摄氏度下孵育 10 分钟，以制备细胞组分。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过细胞外囊泡释放 LC3-II 与细胞内 LC3 阳性囊泡积累的关系的评价

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。...

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，对于维持线粒体稳态和健康至关重要。本文介绍了一些在人类细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

体外 与 体内 检测人细胞、C. elegans 及小鼠中的线粒体自噬

渗透压应激影响胞吐作用以及在此过程中释放的神经递质的量。我们展示了如何结合电化学方法与透射电子显微镜技术，用于研究细胞外渗透压对胞吐活性、囊泡量子大小以及胞吐过程中释放的神经递质量的影响。...

监测渗透压胁迫对分泌囊泡及胞吐作用的影响

本文介绍了一种在哺乳动物细胞中测量整体自噬捕获活性的简单且经过充分验证的实验方案。该方法基于定量分析可沉淀细胞组分中乳酸脱氢酶（LDH）所占的比例，并将其与细胞总LDH水平进行比较。...

乳酸脱氢酶封存检测——一种测定哺乳动物细胞大分子自噬封存活性的简单可靠方法

本报告重点阐述了从小胶质细胞或血液单核细胞中分离细胞外囊泡（EV）的时间顺序要求。在体外实验中，评估了小胶质细胞来源的EV对神经突起生长的调控作用，同时研究了血液单核细胞来源的EV对C6胶质瘤细胞侵袭的调控功能。研究目标是更深入地理解这些EV作为免疫介质在特定微环境中的生物学功能。...

免疫细胞来源的细胞外囊泡的表征及其对细胞微环境功能影响的研究

本文介绍了一种用于标记血小板裂解物来源的细胞外囊泡的实验方案，以监测其在骨关节炎模型——软骨组织外植体中的迁移和摄取情况。...

用于监测软骨组织外泌体迁移与摄取的标记方法

细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。...

细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析

AlPcS2a介导的染料辅助激光失活（CALI）是一种用于研究活细胞内细胞内囊泡（IVs）时空损伤的有力工具。...

一种研究细胞内囊泡破裂功能的光动力学方法

本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。...

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

本方案提供了在从细胞培养上清液中分离细胞外囊泡时如何避免内毒素污染以及如何对其进行正确评估的指导。...

低内毒素含量的癌细胞系来源细胞外囊泡的分离

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

探索自噬调控TDP-43蛋白通过细胞外囊泡释放的机制，以HeLa细胞为模型研究ALS和FTLD-TDP等神经退行性疾病的潜在治疗靶点。该方法结合免疫印迹与超速离心技术分离囊泡组分。

通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

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