通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

我们的研究聚焦于以核蛋白TDP-43在细胞质中异常积聚为特征的进行性神经退行性疾病，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）或TDP-43蛋白病变型额颞叶变性（FTLD-TDP）。我们致力于阐明TDP-43病理如何以类似朊病毒的方式在脑内扩散。我们先前发现，TDP-43通过细胞外囊泡释放的过程由自噬功能失调所介导。

FTLD-TDP 中的颗粒蛋白原（progranulin）促进此过程。下一步的挑战是阐明自噬如何调控含 TDP-43 的细胞外囊泡的生成与释放，这可能为肌萎缩侧索硬化症（ALS）或 FTLD-TDP 发现治疗靶点。首先，取培养的 HeLa 细胞，使用细胞计数器计数，并将一乘十的六次方个细胞接种至含培养基的六厘米培养皿中。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳及受控湿度条件下孵育24小时。接着，配制20微摩尔的siRNA溶液。取100微升低血清培养基与3微升siRNA于低吸附离心管中混合，制备溶液A。然后，取100微升低血清培养基与5微升转染试剂于低吸附离心管中混合，制备溶液B。随后，将溶液A与溶液B混合，并在室温下孵育5分钟。

现在将溶液A和溶液B的混合物加入用于培养HeLa细胞的培养基中，孵育24小时。次日，用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度、5%二氧化碳及受控湿度条件下，用500微升0.25%胰蛋白酶和1毫摩尔EDTA溶液处理细胞5分钟。接着，向细胞中加入2.5毫升培养基，使用带有20微升吸头的巴斯德转移移液管，制备单细胞悬液。

计数细胞后，将一乘以十的六次方个细胞接种至十厘米培养皿中，并按先前所示进行孵育。孵育结束后，准备含有溶剂对照或100纳米摩尔巴佛洛霉素A1的培养基。随后将细胞暴露于含有溶剂对照或100纳米摩尔巴佛洛霉素A1的培养基中，继续孵育24小时。次日，收集十厘米培养皿中的全部培养基。

将收集的培养基转移至15毫升离心管中，在4°C条件下以3,000 G离心10分钟，以去除细胞碎片。为分离P1细胞外囊泡组分，将3,000 G离心后的上清液转移至离心管中，在4°C条件下以20,000 G离心1小时。

为了分离P2细胞外囊泡组分，将20,000 G离心后的上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下以110,000 G离心1小时。用实验室擦拭纸擦去离心管内壁多余的水分后，将离心管中残留的沉淀物重悬于50 µL的两倍浓度上样缓冲液中，以制备P1细胞外囊泡组分。

然后通过倾倒法去除上清液。用实验室擦拭纸擦去管内多余的水分，并将超速离心管中剩余的沉淀物重悬于50 µL的2倍上样缓冲液中，以制备P2细胞外囊泡组分。将P1和P2细胞外囊泡组分置于95–100 °C金属浴中孵育10分钟。

将培养基从10厘米培养皿转移至15毫升离心管后，用PBS清洗10厘米培养皿中的细胞。随后在37摄氏度、5%二氧化碳及受控湿度条件下，用2毫升0.25%胰蛋白酶和1毫摩尔EDTA溶液处理细胞5分钟。向细胞中加入8毫升生长培养基。

使用带有200微升移液枪头的巴斯德转移移液管吹打细胞，制备单细胞悬液。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在4摄氏度下以1,000 G离心10分钟。然后使用吸液装置移除上清液。

向细胞沉淀中加入 PBS，于 4 摄氏度、1,000 G 离心 5 分钟。去除 PBS 后，在含有 1% sarcosil 的 1 毫升 A68 缓冲液中对细胞沉淀进行超声处理。取 300 微升细胞裂解液与 100 微升 4 倍上样缓冲液混合。

将混合物置于加热块上，在 100 摄氏度下孵育 10 分钟，以制备细胞组分。