长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

我们的研究聚焦于催化活性RNA的动力学特性，以及这些动力学在不同环境条件下如何发生变化。我们利用单分子FRET技术研究单价和二价离子、分子伴侣蛋白以及拥挤剂等因素对RNA动力学的影响。在不破坏RNA结构和功能的前提下，精确地引入供体和受体荧光染料仍具有挑战性。

此外，追踪大型动态RNA的折叠过程十分困难。然而，通过已建立的标记与封装方案，我们能够随时间监测功能性RNA的折叠动态。本方案解决了在接近生理条件下实时观察大型、具有催化活性的RNA的技术难题。

通过共价标记并包封RNA和囊泡，然后将其固定在表面，我们可利用单分子全内反射荧光（TIRF）技术监测RNA功能。我们重点关注长链催化性RNA，特别是II型内含子的共价FRET标记。由于这些分子结构复杂，该研究具有较大挑战性。

当RNA被包裹在囊泡中时，我们既可使其保留在TIRF显微镜的隐失场内，又能使其自由漂浮。通过这种方式，单分子FRET可无阻碍地揭示RNA的动态行为。我们将继续致力于理解自然界的真实运作机制，采用多种技术相结合的方法，重点研究核糖体、核糖开关及其他调控性RNA的结构-功能关系及其动态特性。

因此，在生理和细胞条件下开展研究将是未来我们工作的重点。首先，将目标RNA分装，每管含50至75微克RNA，溶于55微升双蒸水中，然后向RNA中加入45微升EDC/NHS醋酸钠pH 6混合液。在25摄氏度下振荡孵育该混合物4小时，振荡速度为500 RPM。

孵育后，将活化的RNA沉淀重悬于95微升pH 7.5的100毫摩尔MOPS缓冲液中。然后向活化的RNA中加入5微升2毫摩尔磺化氰胺3胺，于25摄氏度、500转/分钟条件下孵育16小时，使荧光染料与活化的5'磷酸基团偶联。次日，加入200微升双蒸水以改善分离效果。

然后通过乙醇沉淀法纯化5'端磷酸标记的RNA。纯化后，将标记的RNA重悬于100微升100毫摩尔/升Tris HCl溶液中，并在25摄氏度下孵育2小时。随后，为去除游离染料，使用离心过滤法在双蒸水中洗涤标记的RNA。

进行双端标记时，将5'端标记的RNA分装，每管溶液中含有约50至75微克RNA，总体积为90微升。加入5微升1摩尔的乙酸钠缓冲液（pH 5.5）。然后加入4微升 freshly prepared 500毫摩尔的偏亚硫酸钠储备液。

进行3'端单标记时，加入8微升高碘酸盐储备液。将溶液在避光条件下孵育2小时后，用移液器加入30微升50%甘油以终止反应。孵育30分钟后，加入400微升预冷的乙醇-乙酸钠沉淀混合液。

将氧化的RNA沉淀重悬于95微升pH为6的50毫摩尔/升醋酸钠缓冲液中。通过乙醇沉淀和离心过滤纯化双端标记的RNA，方法如前所述。用双蒸水洗脱纯化的RNA。

通过肉眼比较每步操作后获得的上清液和沉淀物的颜色。使用紫外-可见分光光度计测定 RNA 和偶联染料的浓度。荧光凝胶电泳证实了 RNA 单标记和双标记的成功，表现为 RNA 与荧光染料共迁移。

在存在金属离子的情况下，FRET 效率增加，表明 RNA 发生了折叠，从而导致供体发射减少和受体发射增加。为制备微流控腔室，使用金刚石钻孔器在石英载玻片上钻四个孔以形成两个通道。将钻孔后的石英载玻片以及数量约为其两倍的盖玻片放入带盖的玻璃 Coplin 染色缸中。

将载玻片和盖玻片在双蒸水中超声处理5分钟。接着，将玻璃瓶置于10%实验室玻璃器皿清洗液中，在50摄氏度下超声处理30分钟。用双蒸水冲洗玻璃瓶后，再在1摩尔氢氧化钾溶液中超声处理30分钟，并将玻璃瓶留在该溶液中过夜。

用蒸馏水反复冲洗并超声处理后，使用氮气气流干燥载玻片和盖玻片。将干燥的载玻片和盖玻片用氧气等离子体清洗仪处理30分钟。将清洁后的载玻片和盖玻片放入盛有3%AP-测试乙醇溶液的考普林染色缸中，超声处理1分钟，随后孵育30分钟。

将载玻片和盖玻片分别用无水乙醇和双蒸水各清洗三次，然后在氮气流下干燥。接着，准备一个湿盒：将一个空的移液枪吸头盒中加入一半体积的双蒸水。将载玻片放入盒中，使待处理的一面朝上放置。

在载玻片中央加入30 µL新配制的bPEG/mPEG混合液滴，以覆盖两个通道。用洁净的盖玻片覆盖液滴，并关闭湿盒。将湿盒置于避光环境中过夜孵育，以进行PEG化反应。

第二天，用双蒸水冲洗经 PEG 钝化和生物素化的载玻片和盖玻片，观察处理后表面疏水性的变化。将双面胶贴附在载玻片上，确保胶带覆盖目标区域。然后小心地将盖玻片放置在载玻片上方，使 PEG 修饰的表面相对对齐。

将组装好的腔室转移至一个50毫升离心管中，并用氮气充满该管。首先，使用无菌针头从内向外在无菌洁净的2毫升管盖上刺一个小孔。向管中加入109微升bPE-DMPC混合物。

将微量离心管储存盒中的纸板分隔插件放入一个500毫升的Schlenk烧瓶中，用作试管架。使用长镊子小心地将含有脂质混合物的试管放入试管架中。在氮气低流量条件下过夜蒸发氯仿。

获得干燥的脂质层后，用封口膜密封管子以覆盖孔洞。使用100纳米聚碳酸酯膜和10毫米聚酯排水盘组装挤出器。用抗淬灭缓冲液平衡注射器和膜。

将双端标记的RNA与抗闪烁缓冲液混合后，用RNA抗闪烁缓冲液混合物在30摄氏度下水化脂质膜。先在1,400 RPM条件下振荡5分钟，随后在700 RPM条件下振荡15分钟。将混合物在13,000 G条件下离心2分钟，并用250微升抗闪烁缓冲液稀释上清液。

用RNA脂质悬浮液填充注射器，在30摄氏度的加热块上挤出35次，以将双端标记的RNA包封在直径为100纳米的磷脂囊泡中。在室温下，用200微升5倍标准缓冲液冲洗样品室两次。向样品室中加入50微升浓度为20微克/毫升的链霉亲和素溶液，并孵育5分钟。

然后用 200 微升标准缓冲液和 100 微升抗闪烁缓冲液冲洗样品室。加入 75 微升囊泡悬浮液，孵育 10 分钟，使包封的 RNA 固定在表面。固定后，用 200 微升 freshly prepared 成像缓冲液冲洗样品室。

进行数据采集时，将样品腔室安装在全内反射荧光显微镜（TIRF）上，并采用交替激光激发方式采集单分子FRET数据。利用全内反射荧光显微镜进行单分子FRET成像，可追踪单个RNA分子并检测FRET效率的实时变化。动态单分子轨迹显示供体与受体信号之间存在反相关波动，表明RNA发生了构象变化。