Name: 用于单分子 FRET-TIRF 显微镜的长 RNA 的荧光末端标记和封装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 了解长RNA的双色末端标记与磷脂囊泡封装技术，用于单分子FRET-TIRF显微镜研究。该方法可实现RNA折叠动态与功能关系的实时可视化分析。

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感谢瑞士国家科学基金会 [200020_192153，授予 RKOS]、苏黎世大学研究信贷 [FK-20-081，授予 EA]、苏黎世大学科学研究中心基金会 [授予 RKOS 和 SZP]、研究生研究园区（GRC）短期资助 [2024__SG_092，授予 EA]、苏黎世化学与分子科学研究生院（CMSZH）以及苏黎世大学提供的经费支持。

Dual-Color End-Labeling and Vesicle Encapsulation of RNAs for smFRET-TIRF Studies

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<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

单分子水平的FRET具有独特性，因为它能够实现对单个分子的观察与分析，揭示样品的异质性，并捕捉在系综测量中可能被掩盖的瞬时状态1,2。利用单分子FRET观测单个RNA分子，可高分辨率地揭示其折叠路径与动态行为。本实验方案描述了RNA的化学双端标记及其通过磷脂囊泡包封实现的表面固定化方法，从而可通过单分子FRET-TIRF显微镜技术追踪其动态构象变化。
研究RNA动态是一个不断发展的领域，需要开发新的位点特异性荧光标记策略。我们通过碳二亚胺靶向5'-磷酸基团，以及通过高碘酸盐靶向3'-核糖糖基，实现对RNA末端的标记。这些方法此前已有报道（5'-末端18，19 和 3'-末端19，20，21，22），但尚未应用于与野生型Sc.ai5γ II型内含子核酶大小相似的RNA，因此需要进行条件优化。碳二亚胺（如EDC）对5'-磷酸的活化是可逆的，因此使用咪唑与O-酰基异脲中间体发生不可逆反应，生成高反应活性的磷酸咪唑酯19，20。然而，目前已有研究表明，在较高pH条件下，碳二亚胺可修饰碱基，特别是鸟嘌呤和尿嘧啶，这一特性最近使其被用作结构探针23，24。
为避免交叉反应，在将pH值升至7.5进行染料偶联步骤之前，必须从EDC中纯化活化的RNA。然而，当我们在活化步骤与染料连接步骤之间引入纯化环节时25，获得的产率极低。类似地，在蛋白质标记中，可利用碳二亚胺活化表面可及的赖氨酸残基。但与防止活化逆转的咪唑不同，通常使用NHS。我们也采用了这一策略，从而将磷酸咪唑中间体替换为NHS-磷酸中间体。通过这种方法，我们不仅实现了pH控制，还在较低温度和较短孵育时间内提高了标记密度，即在25 °C下孵育4小时，而非37 °C下孵育16小时。该5'端标记策略虽为RNA设计，但也可应用于任何具有5'-磷酸的单链核酸。
5'端磷酸活化与3'端核糖氧化是相互排斥的，因为这两种化学反应不具有正交性。为克服这一挑战并避免交叉标记，我们首先从5'端开始标记，随后进行封闭步骤，以抑制已活化但未标记的位点，再进行3'端标记。在氧化3'端二醇的过程中，过量的偏高碘酸钠（NaIO4）可能会淬灭已连接在5'端的荧光染料。因此，我们将用于单一位点标记的NaIO4浓度从20 mM降低至10 mM。
建议同时处理多个等分试样，而不是扩大反应体系。本方案需要进行多次乙醇（EtOH）沉淀步骤。当同时处理多个等分试样时，可预先配制沉淀混合液（30 mL 100% 绝对乙醇和 1 mL 3 M NaOAc，pH 5.2）。由于 NaCl 在乙醇中溶解度较低，因此不使用 NaCl。加入 3.1 倍体积的该混合液沉淀 RNA，于 -20 °C 过夜孵育，随后进行离心。用 500 µL 冰冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀物两次，每次洗涤后在 4 °C 下离心，并进行真空干燥。乙醇沉淀法利用了 RNA 在 70% 乙醇中不溶而游离染料可溶的特性。离心过滤法则凭借游离染料与 RNA 之间显著的分子大小差异有效去除游离染料，同时有助于缓冲液置换，从而去除盐分。除乙醇沉淀和离心过滤方法外，也可使用凝胶回收和/或层析技术（如 HPLC）去除游离染料；但应根据具体情况相应调整规模。请勿通过涡旋振荡使长链 RNA 重悬，以免造成机械剪切26。本实验方案最适宜的暂停点是在 RNA 已形成沉淀之后。我们使用低吸附 DNA 离心管以提高核酸回收率。尽管最终反应体积为 100 µL，但仍推荐使用 1.5 mL 管（而非更小体积的管），以便更有效地进行乙醇沉淀纯化。
通过沉淀和离心过滤去除未反应的游离染料后，我们采用荧光凝胶电泳（图4A）、紫外-可见光谱法和分析型高效液相色谱法3确认了标记效果。然而需要注意的是，这些方法无法区分携带两种荧光团的单个RNA分子与每种RNA仅标记单一荧光团的混合物。同样，它们也无法确定某个RNA分子是否携带多个相同颜色的荧光团。由于尺寸限制，质谱法在此不适用。如图4B和图5B所示，整体3和单分子FRET光谱技术验证了双荧光标记的存在。在单分子FRET实验中，0.5的化学计量比（sCy3与Cy5的比例为1:1）证实了两种荧光团的等量偶联。一个需要关注的问题是，可能发生两个醛基均被标记，而非预期的环化反应，从而导致3'端双重标记。而在单分子FRET实验中未观察到化学计量比为0.25（sCy3与Cy5的比例为1:2）的物种，表明染料的连接在空间位阻上阻碍了第二个染料的结合。
通过这种双荧光标记，FRET信号的变化可归因于RNA折叠和催化过程中的结构重排。为了在单分子TIRF成像中将荧光标记的RNA保持在衰逝场内，优先选择包封法而非直接表面固定。该方法涉及将单个RNA分子捕获于囊泡的脂双层内，从而构建一个有利于观察其动态行为的受控环境。所描述的方案可富集单分子包封，这一点可通过单步光漂白实验证实11。为了理解RNA的折叠与功能，弥合体外（in vitro）与体内（in vivo）之间的差距至关重要27。分子拥挤剂可模拟细胞内环境，从而增强II型内含子的RNA催化活性7,28。 Alternatively，包封可形成受限的微环境，促进RNA折叠29，使我们对RNA结构与动态的理解更接近真实的细胞环境。

荧光共振能量转移（FRET）是一种强大且灵敏的技术，可用于在纳米尺度上研究生物分子的分子间和分子内相互作用。该技术基于激发态的供体分子向邻近的受体分子发生非辐射能量转移，其作用距离通常在1 nm至10 nm之间。供体与受体染料之间的距离决定了能量转移的效率，因此FRET成为研究各种生物系统中分子动力学、构象变化和相互作用的宝贵工具1,2，包括RNA。全内反射荧光（TIRF）显微镜已被证明是进行单分子FRET（smFRET）研究的有力技术，因为它仅选择性地激发靠近表面的分子，从而实现对单个分子FRET动态的高空间和时间分辨率观测。然而，在进行smFRET-TIRF实验之前，必须首先用合适的FRET荧光对对目标分子进行标记，然后将其固定在显微镜载样表面上。本文所描述的smFRET-TIRF实验方案使用来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体的野生型II型内含子Sc.ai5γ（两侧包含其两个外显子序列，共915个核苷酸）进行了验证3。有关II型内含子荧光标记及其在smFRET TIRF显微镜中固定方法的更详细说明，请参阅我们的综述文章4。
理想的位点特异性RNA标记策略应能够在预定位置精确地引入供体和受体染料，同时不改变RNA的结构或功能，从而确保FRET测量的准确性和高效性。由于四种碱基在化学性质上具有相似性，实现选择性标记具有挑战性。&#160;末端标记法通过靶向5'-磷酸基团和3'-核糖，将供体和受体染料连接到RNA的两端。该方法具有较低的侵入性，同时仍可提供有关结构动态和分子相互作用的重要信息。II型内含子在Mg2+存在下具有自剪接能力，这限制了依赖金属离子的酶的应用。本文介绍了一种对长链且具有催化活性的RNA（核酶）进行双末端标记的方法，该方法无需使用酶或合成特殊的探针。
用于在表面固定RNA分子以进行全内反射荧光（TIRF）显微镜观察的常用方法，是将生物素基团直接共价连接到RNA上，或与携带生物素的反义寡核苷酸（ASO）5,6,7进行杂交。然而，这种直接固定方法可能因RNA与表面之间的相互作用而引入假象，导致RNA错误折叠8。为减轻此类固定假象，一种巧妙的解决方案是将RNA包封于表面附着的纳米级磷脂囊泡中9,10,11。这些直径约为100 nm的囊泡通过生物素-链霉亲和素连接固定在表面12,13,14，使RNA可在其内部自由扩散，同时允许离子通过脂质膜进行交换10。在对一种较大的功能性RNA进行共价标记后3，本文介绍了一种结合已有表面钝化与囊泡包封技术并加以改进的方法，以实现RNA功能的保持10,11,14，从而将此类RNA包封于磷脂囊泡中。该双端标记与包封策略可实现功能性RNA在单分子FRET TIRF显微镜检测中的高效单分子包封率。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;RNA标记&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&amp;nbsp;mL DNA LoBind 管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC-HCl 或 EDC）</td><td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC，无需称量形式。于&amp;nbsp;-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>3-吗啉丙磺酸（MOPS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra，分子生物学级别，&amp;ge;99.5%（滴定法）</td></tr><tr><td>乙酸（冰醋酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>100%，无水，分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>离心过滤单元&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500，截留分子量 50,000，PES，500 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>氰基5 肼（Cy5-肼）</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg，CAS 号 1427705-31-4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>分子生物学级别</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>无水乙醇，&amp;ge;99.8%</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>分子生物学级别，&amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td><td>发烟盐酸 37%，分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-羟基琥珀酰亚胺（NHS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>98%</td></tr><tr><td>乙酸钠（NaOAc）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>无水，ReagentPlus，&amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>偏高碘酸钠（NaIO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Life Technologies</td><td>20504</td><td>Pierce 产品系列</td></tr><tr><td>磺化氰基3 胺（sCy3-胺）</td><td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg，CAS 号 2183440-43-7</td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）</td><td>Biosolve</td><td>200923</td><td>分子生物学级别</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;样品室制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>99%</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>生物素-聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（biotin-PEG-SVA，bPEG）和甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺戊酸酯（mPEG-SVA）</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA，分子量 5,000 和 MPEG-SVA，分子量 5,000 - 组合试剂盒</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm，厚度 0.13–0.16&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>Deconex 11 通用清洗剂</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>实验室玻璃器皿清洗液</td></tr><tr><td>金刚石涂层钻头</td><td>Crystalite corporation</td><td></td><td>厚度 1 mm</td></tr><tr><td>金刚石钻孔机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296P</td><td>无水乙醇，&amp;ge;99.8%</td></tr><tr><td>带盖玻璃 Coplin 染色缸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成像间隔片</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal，8 孔，&amp;nbsp;9&amp;nbsp;mm &amp;times; 0.12&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>氧等离子体清洗仪</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>分子生物学级别，&amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>石英载玻片</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5&amp;nbsp;×&amp;nbsp;2.5&amp;nbsp;cm，厚度 1 mm</td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra，99.5–100.5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;脂质膜制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 生物素帽PE，bPE（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素帽)（钠盐），C&lt;sub&gt;53&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;98&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;PNaS）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>于 -20 &amp;deg;C 下可稳定保存 1 年</td></tr><tr><td>14:0 PC，DMPC（1,2-十四烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 或 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，C&lt;sub&gt;36&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;72&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;P）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管，Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>高压灭菌以消毒</td></tr><tr><td>500&amp;nbsp;mL 施伦克烧瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>分析纯 EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通过包埋实现表面固定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&amp;plusmn;)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（Trolox&amp;reg;）</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-吗啉丙磺酸（MOPS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra，分子生物学级别，&amp;ge;99.5%（滴定法）。于 +4 &amp;deg;C 避光保存。</td></tr><tr><td>粘性密封条</td><td>Grace Bio-Labs&amp;nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, C30</td><td>来源于牛肝，水溶液，10,000–40,000 单位/mg 蛋白质</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>&amp;ge;99.5%（GC），BioXtra</td></tr><tr><td>挤出器聚碳酸酯（PC）膜</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>0.1 &amp;mu;m，19 mm</td></tr><tr><td>带加热模块的挤出器套装</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>来源于&lt;em&gt;黑曲霉&lt;/em&gt;，VII 型，&amp;nbsp;冻干粉末，&amp;ge;100,000 单位/g 固体（无额外氧气）</td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, M1028</td><td>分子生物学级别，1.00 M &amp;plusmn; 0.01 M 溶液</td></tr><tr><td>聚酯（PE）排水盘，膜</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra，分子生物学级别，&amp;ge;99.5%（AT）</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>分子生物学级别，&amp;ge;99.0%</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Thermo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

长rna的荧光末端标记与封装用于单分子fret-tirf显微镜观察

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术在研究动态生物大分子方面具有显著优势，能够精确观测其随时间发生的构象变化。为了利用smFRET监测RNA的动力学过程，我们开发了一种方法，可在RNA的末端共价标记一对荧光共振能量转移（FRET）荧光染料。这种直接末端标记策略通过碳二亚胺（EDC）/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化靶向5'-磷酸基团，并通过高碘酸盐氧化靶向3'-核糖，该方法可适用于不同大小和序列的其他RNA，从而无需依赖人工修饰即可独立研究其性质。此外，5'-EDC/NHS活化策略对所有含有5'-磷酸基团的核酸均具有普遍应用价值。使用市售化学品即可完成标记，无需合成特定于RNA的探针。
全内反射荧光（TIRF）显微镜要求固定在表面的目标分子位于隐逝场内才能被激发照明。将RNA分子包裹在磷脂囊泡中是一种使其保持在隐逝场内的精巧方法。这种方法兼具双重优势：既将分子锚定在表面，又允许分子自由扩散。我们确保每个囊泡仅包含一个RNA分子，从而实现单分子成像。在对目标RNA进行双端标记并包裹后，单分子FRET（smFRET）测量可提供RNA行为的动态且详细的观察结果。

我们展示了对目标RNA（915个核苷酸的酵母线粒体Sc.ai5γ II型内含子，两侧带有外显子序列）进行位点特异性的单荧光和双荧光标记。通过EDC/NHS活化5'-磷酸基团以及高碘酸盐氧化3'-核糖，将FRET荧光团成对地分别连接至RNA的两端，随后进行相应的染料偶联。接着，我们通过荧光凝胶电泳验证了RNA-染料偶联物，结果如图4A所示。在琼脂糖凝胶中RNA与荧光团共迁移，证实标记成功。接下来，如图4B所示，采用整体荧光光谱法对双标记的II型内含子进行表征。在供体染料被激发时观察到能量转移（即FRET），证明RNA实现了双标记。值得注意的是，与FRET的距离依赖性特征一致，在金属离子存在下II型内含子RNA发生折叠，导致FRET效率升高，表现为供体发射信号降低（绿色箭头）以及受体发射信号相应增强（红色箭头）。这表明该FRET标记可有效追踪核酶的构象变化。
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg" /> 
图 4：RNA-染料偶联物的表征。（A）基于凝胶的分析显示单荧光和双荧光标记的RNA在2%琼脂糖凝胶上与染料共迁移。在双标记样品中，荧光团的共定位通过合并图像（底部）中Cy3（顶部，绿色）和Cy5（中间，红色）通道的黄色条带显示，分别在532 nm和635 nm激发光下观察。泳道1：仅5'-sCy3标记的RNA，泳道2：仅3'-Cy5标记的RNA，泳道3：双端（5'-sCy3和3'-Cy5）标记的RNA。（B）整体荧光光谱分析证实了双标记。供体激发时的能量转移（λex = 515 nm，λem = 670 nm）验证了两种染料均成功偶联至RNA。灰色曲线代表前催化状态RNA的发射谱，而黑色曲线显示折叠后的II型内含子RNA具有增强的FRET效率（在500 mM KCl中70 °C孵育3分钟，冷却至42 °C维持5分钟，随后加入100 mM MgCl2）。本图改编自Ahunbay等.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在获得荧光双标记的野生型 II 组内含子后，我们现在能够在其单分子水平上探究其动态行为。将标记的 RNA 封装于磷脂囊泡中后，以极低的表面密度固定在显微镜载物表面，从而实现单分子分辨率的 smFRET-TIRF 检测。如图 5A所示，可同时追踪多个单个分子。TIRF 显微镜可实时监测 FRET 效率及其随时间的变化。图 5B展示了标记并封装 RNA 的静态与动态单分子 FRET 谱图。典型的动态谱图表现为供体与受体信号之间的反相关关系，导致 FRET 效率发生波动。当供体激发下受体发射增强时，供体发射相应减弱，表明染料间距离发生了动态变化。这种反相关性提示 RNA 分子发生了构象变化。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg" /> 
图5：单分子FRET揭示II型内含子RNA的高度动态行为。 双端标记的II型内含子RNA被包裹在磷脂囊泡中，并固定于表面，使用基于物镜的全内反射荧光显微镜进行成像。（A）单个标记RNA分子在532 nm激发下显示供体发射（sCy3，绿色）和受体发射（Cy5，红色）的合并图像。（B）典型的单分子FRET轨迹：（左侧）静态RNA分子，其供体和受体荧光强度不随时间波动；（右侧）动态RNA分子，其供体和受体荧光强度呈反相关，FRET效率以黄色表示。单个分子的定位与分析使用MASH-FRET17完成。已进行直接激发、串扰及γ因子校正。缩写：smFRET = 单分子Förster共振能量转移。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了在长链RNA的末端位置进行双色标记，并通过将其包裹在磷脂囊泡中实现表面固定，从而应用于单分子FRET全内反射荧光显微镜检测。结合这些技术可实现对RNA动态行为在单分子水平上的精确可视化与分析。

长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

单分子Förster共振能量转移（smFRET）通过实现对生物大分子动态行为的精确观测，在研究动态生物分子方面具有显著优势……

我们的研究聚焦于催化活性RNA的动力学特性，以及这些动力学在不同环境条件下如何发生变化。我们利用单分子FRET技术研究单价和二价离子、分子伴侣蛋白以及拥挤剂等因素对RNA动力学的影响。在不破坏RNA结构和功能的前提下，精确地引入供体和受体荧光染料仍具有挑战性。此外，追踪大型动态RNA的折叠过程十分困难。然而，通过已建立的标记与封装方案，我们能够随时间监测功能性RNA的折叠动态。本方案解决了在接近生理条件下实时观察大型、具有催化活性的RNA的技术难题。通过共价标记并包封RNA和囊泡，然后将其固定在表面，我们可利用单分子全内反射荧光（TIRF）技术监测RNA功能。我们重点关注长链催化性RNA，特别是II型内含子的共价FRET标记。由于这些分子结构复杂，该研究具有较大挑战性。当RNA被包裹在囊泡中时，我们既可使其保留在TIRF显微镜的隐失场内，又能使其自由漂浮。通过这种方式，单分子FRET可无阻碍地揭示RNA的动态行为。我们将继续致力于理解自然界的真实运作机制，采用多种技术相结合的方法，重点研究核糖体、核糖开关及其他调控性RNA的结构-功能关系及其动态特性。因此，在生理和细胞条件下开展研究将是未来我们工作的重点。首先，将目标RNA分装，每管含50至75微克RNA，溶于55微升双蒸水中，然后向RNA中加入45微升EDC/NHS醋酸钠pH 6混合液。在25摄氏度下振荡孵育该混合物4小时，振荡速度为500 RPM。孵育后，将活化的RNA沉淀重悬于95微升pH 7.5的100毫摩尔MOPS缓冲液中。然后向活化的RNA中加入5微升2毫摩尔磺化氰胺3胺，于25摄氏度、500转/分钟条件下孵育16小时，使荧光染料与活化的5'磷酸基团偶联。次日，加入200微升双蒸水以改善分离效果。然后通过乙醇沉淀法纯化5'端磷酸标记的RNA。纯化后，将标记的RNA重悬于100微升100毫摩尔/升Tris HCl溶液中，并在25摄氏度下孵育2小时。随后，为去除游离染料，使用离心过滤法在双蒸水中洗涤标记的RNA。进行双端标记时，将5'端标记的RNA分装，每管溶液中含有约50至75微克RNA，总体积为90微升。加入5微升1摩尔的乙酸钠缓冲液（pH 5.5）。然后加入4微升 freshly prepared 500毫摩尔的偏亚硫酸钠储备液。进行3'端单标记时，加入8微升高碘酸盐储备液。将溶液在避光条件下孵育2小时后，用移液器加入30微升50%甘油以终止反应。孵育30分钟后，加入400微升预冷的乙醇-乙酸钠沉淀混合液。将氧化的RNA沉淀重悬于95微升pH为6的50毫摩尔/升醋酸钠缓冲液中。通过乙醇沉淀和离心过滤纯化双端标记的RNA，方法如前所述。用双蒸水洗脱纯化的RNA。通过肉眼比较每步操作后获得的上清液和沉淀物的颜色。使用紫外-可见分光光度计测定 RNA 和偶联染料的浓度。荧光凝胶电泳证实了 RNA 单标记和双标记的成功，表现为 RNA 与荧光染料共迁移。在存在金属离子的情况下，FRET 效率增加，表明 RNA 发生了折叠，从而导致供体发射减少和受体发射增加。为制备微流控腔室，使用金刚石钻孔器在石英载玻片上钻四个孔以形成两个通道。将钻孔后的石英载玻片以及数量约为其两倍的盖玻片放入带盖的玻璃 Coplin 染色缸中。将载玻片和盖玻片在双蒸水中超声处理5分钟。接着，将玻璃瓶置于10%实验室玻璃器皿清洗液中，在50摄氏度下超声处理30分钟。用双蒸水冲洗玻璃瓶后，再在1摩尔氢氧化钾溶液中超声处理30分钟，并将玻璃瓶留在该溶液中过夜。用蒸馏水反复冲洗并超声处理后，使用氮气气流干燥载玻片和盖玻片。将干燥的载玻片和盖玻片用氧气等离子体清洗仪处理30分钟。将清洁后的载玻片和盖玻片放入盛有3%AP-测试乙醇溶液的考普林染色缸中，超声处理1分钟，随后孵育30分钟。将载玻片和盖玻片分别用无水乙醇和双蒸水各清洗三次，然后在氮气流下干燥。接着，准备一个湿盒：将一个空的移液枪吸头盒中加入一半体积的双蒸水。将载玻片放入盒中，使待处理的一面朝上放置。在载玻片中央加入30 µL新配制的bPEG/mPEG混合液滴，以覆盖两个通道。用洁净的盖玻片覆盖液滴，并关闭湿盒。将湿盒置于避光环境中过夜孵育，以进行PEG化反应。第二天，用双蒸水冲洗经 PEG 钝化和生物素化的载玻片和盖玻片，观察处理后表面疏水性的变化。将双面胶贴附在载玻片上，确保胶带覆盖目标区域。然后小心地将盖玻片放置在载玻片上方，使 PEG 修饰的表面相对对齐。将组装好的腔室转移至一个50毫升离心管中，并用氮气充满该管。首先，使用无菌针头从内向外在无菌洁净的2毫升管盖上刺一个小孔。向管中加入109微升bPE-DMPC混合物。将微量离心管储存盒中的纸板分隔插件放入一个500毫升的Schlenk烧瓶中，用作试管架。使用长镊子小心地将含有脂质混合物的试管放入试管架中。在氮气低流量条件下过夜蒸发氯仿。获得干燥的脂质层后，用封口膜密封管子以覆盖孔洞。使用100纳米聚碳酸酯膜和10毫米聚酯排水盘组装挤出器。用抗淬灭缓冲液平衡注射器和膜。将双端标记的RNA与抗闪烁缓冲液混合后，用RNA抗闪烁缓冲液混合物在30摄氏度下水化脂质膜。先在1,400 RPM条件下振荡5分钟，随后在700 RPM条件下振荡15分钟。将混合物在13,000 G条件下离心2分钟，并用250微升抗闪烁缓冲液稀释上清液。用RNA脂质悬浮液填充注射器，在30摄氏度的加热块上挤出35次，以将双端标记的RNA包封在直径为100纳米的磷脂囊泡中。在室温下，用200微升5倍标准缓冲液冲洗样品室两次。向样品室中加入50微升浓度为20微克/毫升的链霉亲和素溶液，并孵育5分钟。然后用 200 微升标准缓冲液和 100 微升抗闪烁缓冲液冲洗样品室。加入 75 微升囊泡悬浮液，孵育 10 分钟，使包封的 RNA 固定在表面。固定后，用 200 微升 freshly prepared 成像缓冲液冲洗样品室。进行数据采集时，将样品腔室安装在全内反射荧光显微镜（TIRF）上，并采用交替激光激发方式采集单分子FRET数据。利用全内反射荧光显微镜进行单分子FRET成像，可追踪单个RNA分子并检测FRET效率的实时变化。动态单分子轨迹显示供体与受体信号之间存在反相关波动，表明RNA发生了构象变化。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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表征 Riboglow 探针 体外 作为活体哺乳动物细胞及三维细胞模型中荧光寿命成像的基础

了解长RNA的双色末端标记与磷脂囊泡封装技术，用于单分子FRET-TIRF显微镜研究。该方法可实现RNA折叠动态与功能关系的实时可视化分析。

长RNA的荧光末端标记与封装用于单分子FRET-TIRF显微镜观察

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