Name: 使用非病毒性睡美人转座子系统工程化靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 了解利用睡美人转座子系统构建靶向烟曲霉的CAR-NK细胞技术。该方法通过非病毒基因递送实现抗真菌免疫治疗，为侵袭性真菌感染提供可扩展的现成细胞疗法方案。

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本项目由 Wilhelm Sander Stiftung（项目编号 2020.017.1，资助对象 M.H. 和 J.L.）以及德国研究基金会（合作研究中心/跨区域研究中心 124“致病性真菌与其人类宿主：相互作用网络—FungiNet”；项目 A8，资助对象 M.H. 和 H.E.）提供资金与支持。

此处描述的所有实验均须在无菌条件下进行。本方案中，我们展示了两种条件：（I）不含DNA的模拟转染，作为对照；（II）使用先前描述的Af-CAR6进行CAR转染。Af-CAR质粒在CAR下游包含一段截短的表皮生长因子受体（EGFRt）序列，将用作转染标记物（补充图S1）。每种条件下均需要4 × 106个NK-92细胞。
1. NK-92 细胞的培养
<ol>
	<li>转染前一至两天，配制新鲜细胞培养基，成分如下：75% (v/v) α-MEM 培养基（含核苷）+ 12.5% (v/v) 热灭活胎牛血清（FBS）+ 12.5% (v/v) 热灭活马血清 + 2 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>将至少 107 个 NK-92 细胞重悬，细胞密度为 5 × 105 个细胞/mL。</li>
	<li>向细胞悬液中加入白细胞介素-2（IL-2），终浓度为 150 UI/mL。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱中培养。 
	注：IL-2 也可使用终浓度为 5 ng/mL。</li>
</ol>
2. 非病毒转染
<ol>
	<li>在显微镜下检查细胞质量。细胞呈簇状悬浮且背景清晰，表明细胞培养状态良好。</li>
	<li>在6孔板中，每孔每种条件加入2 mL细胞培养基。将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中。 
	注意：抗生素可能降低转染后的细胞活力。培养基中应避免使用抗生素。</li>
	<li>计数细胞，并使用（例如台盼蓝染色法）检测细胞活力。</li>
	<li>将8 × 106个NK-92细胞转移至15 mL锥底离心管中。以200 × g离心5分钟，加速度和减速度均设为3。后续所有离心步骤均使用此程序。</li>
	<li>离心过程中，准备两个1.5 mL离心管。将Af-CAR的DNA（8 µg质粒DNA和4 µg SB100X微型环状DNA，表1）移入其中一管。另一管不加DNA，作为Mock对照。</li>
	<li>离心结束后，轻柔弃去上清液，并向含有细胞的离心管中加入最多15 mL预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>离心（步骤2.4）。</li>
	<li>离心过程中，为每种条件准备一个转染系统用管，每管加入3 mL电转缓冲液。将第一管放入移液器工作站中。</li>
	<li>离心结束后，轻柔弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于200 µL重悬缓冲液中（每4 × 106细胞使用100 µL）。 
	注意：避免细胞在重悬缓冲液中停留超过15–30分钟，否则会降低细胞活力和转染效率。</li>
	<li>将100 µL细胞悬液分别加入两个反应管中，轻轻混匀。 
	注意：移液时避免产生气泡，气泡会导致电弧放电，进而引起细胞死亡。</li>
	<li>使用转染系统移液器吸取第一个反应管中的DNA-细胞混合液，并将移液器垂直插入移液器工作站中的转染管内。 
	注意：确保移液器吸头安装到位。</li>
	<li>设置第一次电击参数为1,650 V，脉冲时间为20 ms，然后按下启动。</li>
	<li>第一次电击完成后，设置第二次电击参数为500 V，脉冲时间为100 ms，按下启动。</li>
	<li>电击完成后，缓慢将移液器从工作站中取出，并立即将细胞转移至已准备好的培养板的一个孔中，该孔内含有2 mL预热的细胞培养基（参见步骤2.2）。轻柔地以环形方式晃动培养板，确保细胞均匀分布。</li>
	<li>对于Mock样本，从不含DNA的反应管中取100 µL细胞悬液（参见步骤2.9），使用新的离心管和新的移液器吸头，重复步骤2.11至步骤2.14的操作。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。</li>
	<li>培养30分钟后，加入IL-2，使其终浓度为150 UI/mL。</li>
</ol>
3. 使用流式细胞术检测转染效率
<ol>
	<li>细胞每隔一天培养并传代一次，一周后，取每种条件下 1-5 × 105 个细胞至聚苯乙烯圆底试管中。</li>
	<li>加入 1 mL 缓冲液（PBS + 0.5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA）洗涤细胞，离心后弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 50 µL 缓冲液中，加入 1 µL 7-AAD 以检测死细胞。</li>
	<li>加入 5 µL anti-tEGFR-Alexa fluor 647 抗体，用于标记转染的细胞。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
	<li>洗涤细胞（参见步骤 3.2）。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 200 µL 缓冲液中。</li>
	<li>使用流式细胞仪检测样品。 
	注意：若转染效率不理想，可继续进行目的基因表达细胞的富集。</li>
</ol>
4. 通过磁性激活细胞分选（MACS）富集表达转基因的细胞
注意：为了获得最佳结果，建议从 8-10 × 106 个细胞开始实验。所有离心步骤均在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>按照步骤 3.2 所述配制缓冲液。在 15 mL 圆底离心管中，用缓冲液将细胞稀释至浓度为 1–2 × 106/100 µL。</li>
	<li>每 1–2 × 106 个细胞加入 1 µL 抗 EGFRt-生物素抗体，轻轻旋转混匀离心管，确保溶液均匀分布。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育 25 分钟，然后用缓冲液加满至 10 mL。</li>
	<li>离心，弃去上清液。</li>
	<li>每 1 × 106 个细胞加入 8 µL 冷缓冲液。</li>
	<li>每 1 × 106 个细胞加入 2 µL 抗生物素磁珠。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>用缓冲液加至 10 mL 进行洗涤。</li>
	<li>离心，弃去上清液，并将细胞重悬于 500 µL 缓冲液中。</li>
	<li>将 LS 柱置于 MACS 磁铁上，并用 3 mL 缓冲液洗涤。</li>
	<li>待缓冲液完全流经柱子后，立即加入细胞悬液。</li>
	<li>用 3 mL 缓冲液洗涤柱子 3 次。</li>
	<li>将柱子从磁铁上取下，放入一个洁净的 15 mL 圆底离心管中。</li>
	<li>向柱中加入 5 mL 缓冲液，使用推杆尽快将 EGFR 阳性细胞洗脱下来。</li>
	<li>将细胞培养数天后，通过流式细胞术检测分选效率。</li>
</ol>
5. 功能测试
注意：进行接下来的实验时，请准备并使用以下培养基：RPMI + 20% FBS。
<ol>
	<li>第1天 - 接种Aspergillus fumigatus分生孢子
	<ol>
		<li>在培养基中制备浓度为2.5 × 105 个分生孢子/mL的A. fumigatus分生孢子悬液。</li>
		<li>在96孔培养板中，每孔加入100 µL分生孢子悬液，于25 °C孵育16小时。 
		注意：孵育结束后，分生孢子将开始萌发（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天 - 与CAR NK-92细胞共培养
	<ol>
		<li>用培养基将Mock组和Af-CAR NK-92细胞洗涤2次。</li>
		<li>以效应细胞与靶细胞比例为2:1的条件进行共培养，每孔加入含5 × 104 个细胞的100 µL培养基（图2）。</li>
		<li>阳性对照组每孔加入1 ng PMA和100 ng离子霉素溶于100 µL培养基中；仅含培养基的细胞作为阴性对照。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、加湿的CO2培养箱中孵育至少6小时。</li>
		<li>以300 × g离心5分钟。</li>
		<li>收集每孔100 µL上清液，避免触碰孔底；将上清转移至反应管中。 
		注意：确保仅吸取上清液，避免吸取生长的真菌。如有疑问，可增加一次离心步骤。</li>
		<li>按照试剂盒说明书进行IFN-ɣ ELISA检测，或立即将样品储存于-80 °C待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Sleeping Beauty Approach to Obtain CAR-NK Cells for Targeting Fungal Pathogens

<ol><li>Fang, W., Latgé, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+profile%3A+Aspergillus+fumigatus%3A+A+saprotrophic+and+opportunistic+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Microbe profile: Aspergillus fumigatus: A saprotrophic and opportunistic fungal pathogen.</a> Microbiology (Reading). 164 (8), 1009-1011 (2018).</li>
<li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+Human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: Human fungal infections.</a> Sci Transl Med. 4 (165), 165rv113(2012).</li>
<li>Sun, K. S., Tsai, C. F., Chen, S. C., Huang, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcome+and+prognostic+factors+associated+with+invasive+pulmonary+aspergillosis%3A+An+11-year+follow-up+report+from+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clinical outcome and prognostic factors associated with invasive pulmonary aspergillosis: An 11-year follow-up report from Taiwan.</a> PLoS One. 12 (10), e0186422(2017).</li>
<li>Meis, J. F., Chowdhary, A., Rhodes, J. L., Fisher, M. C., Verweij, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+globally+emerging+azole+resistance+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of globally emerging azole resistance in Aspergillus fumigatus.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1709), 20150460(2016).</li>
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<li>Lu, H., Zhao, X., Li, Z., Hu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+CAR-T+cells+to+CAR-NK+cells%3A+A+developing+immunotherapy+method+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">From CAR-T cells to CAR-NK cells: A developing immunotherapy method for hematological malignancies.</a> Front Oncol. 11, 720501(2021).</li>
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<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
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</ol>

M.H.：CAR 技术相关专利申请及已授权专利的发明人，部分专利已许可给产业界。Würzburg T-CURX GmbH 公司联合创始人及股权持有者。演讲酬金：BMS、Janssen、Kite/Gilead、Novartis。研究资助：BMS。M. B. 报告收到与本研究无关的制药公司“Eli Lilly and Company”的差旅资助。其他作者无任何利益冲突。

本方案提供了一种简单且可靠的方法，利用非病毒型Sleeping Beauty转座子系统制备靶向真菌病原体的CAR-NK细胞。该方法可实现大片段转基因的稳定且永久性插入，从而支持细胞扩增以获得后续分析所需的足够数量细胞14,16。
影响转染成功的关键因素包括细胞数量和活力、脉冲强度&#160;和持续时间，以及DNA的质量和数量17。在开始实验前必须评估细胞的健康状态，确保细胞活力至少达到90%。研究表明，提高脉冲强度可增强细胞群体的转染效率，但这种方法也可能导致细胞活力显著下降。当细胞数量过多而DNA的量或质量有限时，成功摄取质粒的细胞数量可能不足17。然而，高浓度的DNA已被证明具有细胞毒性，会降低细胞活力18。
既往研究虽已实现较高的转染效率，但仅专注于瞬时蛋白表达17。相比之下，我们的实验方案可确保外源基因的稳定整合。为解决转染效率低的问题，我们采用了对成功转染细胞进行富集的策略，最终获得约95%的CAR表达细胞。然而，该步骤使生产周期延长至约1周。若需缩短生产时间，可将转座子DNA以微环（minicircle）形式递送，此举可提高转染效率，并可能省去富集步骤19。尽管如此，由于需要留出细胞恢复与增殖的时间，生产周期无法缩短至&#60;1周。
鉴于侵袭性曲霉病的急性特征， &#34;现成的&#34; 细胞治疗将具有显著优势。然而，从患者体内分离细胞以及扩增原代细胞所面临的挑战和高昂成本，使得NK-92细胞系成为CAR-NK细胞制备中一种便捷且广受欢迎的选择。20NK-92 细胞通常具有较强的活力，并在 IL-2 存在下快速增殖，可在相对较短时间内获得大量细胞。鉴于这些优势，我们开发了一种对 NK-92 细胞进行基因工程改造的方案，证明了安全转染并制备高纯度 CAR-NK 细胞产品的可行性。尽管该方案可经调整用于制备原代 CAR-NK 细胞，但仍需考虑若干修改，包括优化电穿孔脉冲的次数与强度、所用 DNA 的量，以及建立合适的扩增方案。对该方案的任何修改均需进行充分验证，以确保其有效性。然而，本方案提供了一个基础模板，未来可据此调整用于原代 NK 细胞的实验。
总之，这种用于生成稳定表达Af-CAR的NK细胞的创新转染方案是一种高效且可重复的方法，可用于靶向其他疾病。此外，该方法还可作为一种经济有效的手段，用于筛选针对多种抗原的新型CAR。

Aspergillus fumigatus（A. fumigatus）是一种广泛存在的真菌，普通人每天会吸入约100至1,000个分生孢子1。在患有获得性或先天性免疫缺陷的患者中（例如正在接受化疗或患有白血病的患者），A. fumigatus 可引起严重的侵袭性曲霉病。全球每年有超过20万人感染曲霉病。尽管已使用抗真菌药物（如唑类衍生物）进行预防和治疗，但死亡率仍介于30%至95%之间2,3。此外，此类治疗具有显著的副作用，且已有7%的A. fumigatus培养株对唑类药物产生耐药性4。
嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞疗法在治疗恶性疾病方面已显示出临床疗效，并在对抗侵袭性曲霉病等感染性疾病中取得了有前景的临床前结果5,6,7,8我们先前描述的靶向细胞壁中某种蛋白的Af-CAR-T细胞 A. fumigatus 菌丝在临床前模型中已显示出良好的效果6.
移植物抗宿主病、细胞因子释放综合征和神经毒性的风险降低，使得CAR-NK细胞成为针对急性感染的即用型（&#34;off-the-shelf&#34;）治疗方案中一种有价值的CAR-T细胞替代选择9。此外，自然杀伤（NK）细胞已被证实在外抗真菌免疫应答中发挥关键作用。当受到A. fumigatus刺激时，NK细胞会分泌IFN-ɣ等细胞因子以及CCL-3和CCL-4等趋化因子，并释放细胞毒性颗粒10,11。
NK-92细胞系是自然杀伤细胞遗传工程的常用来源，具有在相对简单的培养条件下快速增殖和扩增的优势12多项临床前研究已证实，经CAR转导的NK-92细胞在治疗血液系统肿瘤和实体瘤方面具有治疗潜力。目前正在进行多项临床试验，以评估其安全性、有效性及潜在的临床应用价值 &#34;现成的&#34; 细胞治疗13.
在自然杀伤（NK）细胞中实现高效的转染效率和稳定的外源基因表达具有挑战性。尽管病毒方法可实现较高的转染效率，但存在插入突变导致继发性肿瘤发生的风险9,14。新一代的“睡美人”（Sleeping Beauty, SB）转座子载体提供了一种安全、高效且经济可行的稳定基因转移系统，克服了病毒载体及瞬时非病毒基因递送方法的局限性15。
因此，本方案概述了一种生成Af-CAR-NK-92细胞的新型方法，该细胞有望作为 &#34;即用型&#34; 治疗危及生命的侵袭性曲霉病患者的一种治疗选择。该方法的有效性体现在经刺激后IFN-ɣ的产量显著增加 A. fumigatus 菌丝

<table><tbody><tr><td>15 毫升锥底管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>PP，17/120 毫米，CELLSTAR，无菌</td></tr><tr><td>50 mL 锥形底离心管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227270</td><td>PP，30/115 毫米，CELLSTAR，无菌</td></tr><tr><td>6孔和96孔细胞培养板</td><td>康宁生命科学公司</td><td>83-3736/ 83-3474</td><td>经TC处理的多孔板，平底，表面经处理以促进细胞最佳贴附，经γ射线辐照灭菌，无热原</td></tr><tr><td>7-AAD（7-氨基放线菌素D）</td><td>BD 生物科学</td><td>559925</td><td>用于流式细胞术检测中排除非活细胞的即用型核酸染料</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗人 EGFR 抗体</td><td>Biolegend</td><td>352918</td><td>克隆 AY13</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads UltraPure</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-637</td><td>与单克隆小鼠抗生物素抗体偶联的 UltraPure MicroBeads</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus</td><td>ATCC</td><td>46645</td><td></td></tr><tr><td>生物圈滤芯提示（20 和 100） &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.365 / 70.3030.275</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;prime;磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>&amp;nbsp;无钙、无镁改良型液体，经无菌过滤，适用于细胞培养，内毒素已检测</td></tr><tr><td>ELISA MAX Deluxe Set 人IFN-&amp;gamma;</td><td>Biolegend</td><td>430104</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>用于分子生物学，0.5&amp;nbsp;M in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O、DNase、RNase、NICKase 和蛋白酶均未检出，0.2 &amp;mu;m 过滤。</td></tr><tr><td>FACS 清洁</td><td>BD 生物科学</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACS 流式鞘液</td><td>BD 生物科学</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACS 清洗液</td><td>BD生物科学</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>经无菌过滤，适用于细胞培养，使用前需热灭活</td></tr><tr><td>Gibco，最低必需培养基（MEM） &amp;alpha;，核苷</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22571020</td><td>酚红、核糖核苷、脱氧核糖核苷、碳酸氢钠</td></tr><tr><td>马血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16050122</td><td>经无菌过滤，使用前热灭活</td></tr><tr><td>人IL-2免疫测定，研究级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-742</td><td>研究级。ED50 为 &amp;le;0.3 ng/mL，相当于活性为 &amp;ge;3 &amp;times; 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; IU/mg</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>来自凝聚链霉菌（Streptomyces conglobatus），用作细胞因子分泌的阳性对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W368401</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>MACS LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&amp;nbsp;色谱柱和柱塞，无菌包装</td></tr><tr><td>NK-92</td><td>DSMZ</td><td>ACC 488</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统 100&amp;nbsp;&amp;mu;L-Kit</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK10096</td><td>重悬缓冲液 R，电解缓冲液 E2，100 &amp;mu;L型Neon电穿孔提示，Neon电穿孔管</td></tr><tr><td>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>用作细胞因子分泌的阳性对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>BD生物科学</td><td>S-452400</td><td>用于流式细胞术</td></tr><tr><td>反应管，1.5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7,26,90,001</td><td>聚丙烯，透明，带盖，带刻度。使用前已灭菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，GlutaMAX</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>72400021</td><td>GlutaMax I&amp;nbsp; 酚红，HEPES，无菌过滤</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &amp;mu;L XL 带刻度滤芯吸头</td><td>StarLab</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur</td><td>BD生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; C60 培养箱&amp;nbsp;</td><td>Labotect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HydroFLEX 微孔板洗涤仪&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoQuant Infinite M200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS 分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用非病毒型睡美人转座子系统构建靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞

Engineering Chimeric Antigen Receptor-Natural Killer Cells Targeting Fungal Infections Using the Non-viral Sleeping Beauty Transposon System

基于嵌合抗原受体（CAR）的细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出显著疗效。近年来，这些疗法正被开发用于传染病的治疗，但针对真菌感染的研究仍较为有限。为了确定最佳靶点并优化细胞治疗产品，我们建立了一种工程化嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）的方法，并评估了其对真菌刺激的反应。本文介绍了一种利用非病毒型“睡美人”转座子系统生成针对真菌靶点的CAR-NK细胞的简便且稳健的方法。将NK-92细胞共转染编码高活性转座酶SB100X的微型环状DNA（MC）载体以及质粒编码的CAR转座子。转染效率通过流式细胞术在1周后进行评估。在功能检测前，利用磁珠激活细胞分选技术富集表达外源基因的细胞，并继续培养1周。为评估抗原特异性激活情况，将工程化细胞与Aspergillus fumigatus菌丝管共培养至少6小时，随后采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测分泌的干扰素-γ（IFN-γ）浓度。

生成Af-CAR NK-92细胞的整个过程，包括转染、恢复、富集和扩增，大约需要14天。转染后，细胞每两天传代一次。在转染后第2天首次传代时，细胞活力可能会下降。通常，细胞在转染后第4天恢复并开始增殖，倍增时间为48小时。
复苏后，检测转染效率，预期可达10-20%（代表性结果见图3）。通过MACS富集EGFR阳性细胞，可使Af-CAR NK-92细胞的比例提高至95%以上（代表性结果见图4）。
功能检测使用Af-CAR细胞比例超过95%的培养物。在此，我们将细胞与A. fumigatus菌丝管共培养6小时，并检测IFN-ɣ的分泌作为细胞活化的标志。如图5所示，与对照NK-92细胞（均值 = 75.6 ± 19.5 pg/mL）相比，Af-CAR细胞表现出显著的细胞因子分泌（均值 = 340.6 ± 86.5 pg/mL），表明Af-CAR细胞的活化程度显著更高（p值 = 0.03）。
<img alt="细菌细胞培养的显微镜图像、静态平衡分析、实验微生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：烟曲霉的芽管。孵育16小时后A. fumigatus的显微图像。可见芽管/短菌丝均匀分布在孔周围。比例尺 = 400 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养显微镜图像；观察细胞密度、细胞簇及生长模式以进行分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：烟曲霉菌丝与NK-92细胞的共培养。 共培养的显微图像。NK-92细胞形成细胞簇，并与A. fumigatus菌丝接触。比例尺 = 400 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析；示意图显示细胞群体、活力和EGFR表达结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：通过转染标志物EGFR染色评估转染效率。 电穿孔后第5天，对NK-92细胞进行7-AAD和抗EGFR染色。结果显示了一次代表性实验的结果，分别为（A）对照组和（B）Af-CAR NK-92细胞。左列为细胞大小与细胞颗粒度的散点图；门控设定在NK-92细胞群上。通过7-AAD标记排除死细胞（第二列）。活细胞中EGFR+细胞的百分比显示在第三列。缩写：EGFR = epidermal growth factor receptor；7-AAD = 7-aminoactinomycin D；CAR = chimeric antigen receptor。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术直方图显示Mock-NK-92与Af-CAR-NK-92细胞中EGFR的表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：转导基因表达的NK-92细胞富集后细胞表面染色结果。 左侧显示Mock细胞，右侧显示Af-CAR-NK细胞。红色直方图代表未染色细胞，蓝色直方图代表相应染色细胞。门控设在EGFR+细胞上；数值表示阳性细胞百分比。缩写：EGFR = 表皮生长因子受体；CAR = 嵌合抗原受体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IFNγ 分泌柱状图；Mock 与 Af-CAR 比较；免疫学研究结果，pg/ml 水平对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67424/67424fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5NK细胞经激活后的细胞因子分泌 Aspergillus fumigatus 菌丝管 图中显示了Af-CAR细胞与真菌共培养6小时后，通过ELISA检测的IFN-γ分泌结果。数据为三次独立实验的平均值±标准差（n = 3）。 P由韦尔奇法计算得出的值 t使用 GraphPad Prism 10 进行检验，* p &lt; 0.05。缩写：NK = 自然杀伤细胞；IFN-ɣ = 干扰素γ；CAR = 嵌合抗原受体；ELISA = 酶联免疫吸附测定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/67424fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>名称</td>
			<td>公司</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转座酶</td>
			<td>SB100X Mini Circle</td>
			<td>PlasmidFactory</td>
			<td>1 µg/µL</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转座子</td>
			<td>Af-CAR 质粒</td>
			<td>本实验室制备</td>
			<td>1 µg/µL</td>
			<td>6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中使用的DNA。
补充图 S1：Af-CAR 转座子的质粒图谱： 质粒载体的示意图及 CAR 转座子的设计。缩写：EF1 = 延伸因子-1α 启动子；ORI = 细菌复制起点；LIR = 左侧反向重复序列；RIR = 右侧反向重复序列；Cyto = 胞内区；Tm = 跨膜区。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67424/figure%20S1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们概述了一种利用非病毒型“睡美人”转座子系统制备靶向真菌病原体的嵌合抗原受体-自然杀伤（CAR-NK）细胞的转染方案。为评估抗原特异性激活情况，我们将工程化细胞与Aspergillus fumigatus菌丝管进行共培养，并检测干扰素-γ（IFN-γ）的分泌水平。

基于嵌合抗原受体（CAR）的细胞疗法在血液系统恶性肿瘤的治疗中已显示出显著疗效。近年来，这些……

我们的研究致力于开发一种现成可用的CAR细胞疗法，用于治疗侵袭性真菌感染。我们的目标是确定最佳靶点、CAR设计以及免疫细胞组合，以实现最优的治疗效果。近年来的研究进展，包括我们自身的研究工作，主要集中于开发靶向烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的CAR T细胞疗法。这些工程化细胞在临床前模型中已显示出良好的效果，能够显著降低真菌负荷、调控抗真菌免疫反应，并提高整体生存率。目前该领域内的研究主要集中于利用病毒载体或睡美人转座子系统，针对极为有限的一组靶点开发特异性的CAR T细胞。主要挑战在于确定最佳的真菌靶点，并开发出一种即用型细胞产品，使其在临床应用中兼具有效性与可扩展性。通过本方案，我们旨在解决生成非病毒性CAR-NK细胞所需的成本效益高且可扩展的方法。该方法为筛选新的抗真菌靶点提供了便捷途径，是实现即用型CAR-NK细胞治疗真菌感染的重要基础步骤。首先，在显微镜下检查NK-92细胞，观察其在清晰背景中是否形成簇状结构；然后，向6孔板中每个条件的孔内加入2毫升细胞培养基，将该板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中。将8 × 10⁶个NK-92细胞转移至一个15毫升锥底离心管中，在200 × g条件下以加速度和减速度均为3的设置离心5分钟。弃去上清液后，向含有细胞沉淀的离心管中加入最多15毫升预热的PBS，再次离心。在离心过程中，用移液器将8微克Af-CAR质粒DNA和4微克SB100X微环DNA加入同一反应管中，另取一管不加DNA作为模拟对照（mock control）。对于转染系统，将3毫升电转缓冲液加入第一支试管中，并将其放入移液工作站。离心后，小心弃去上清液，用200微升重悬缓冲液轻柔重悬细胞沉淀。然后将100微升细胞悬液分别加入两支反应管中，并轻柔混匀。使用转染系统移液器从第一个反应管中吸取DNA细胞混合物，将转染移液器垂直插入移液器支架中的管内。设置第一次脉冲电压为1,650伏，脉冲时间为20毫秒，然后按下启动键以开始脉冲。第一次脉冲完成后，设置第二次脉冲电压为500伏，脉冲时间为100毫秒，并启动第二次脉冲。第二次脉冲完成后，缓慢将移液器从移液器架上取下。立即将细胞转移至已准备好的培养板的一个孔中，该孔内含有2毫升预热的细胞培养基，轻轻以圆形运动方式移动培养板，使细胞均匀分布。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。孵育30分钟后，向孔中加入白细胞介素-2，终浓度为每毫升150国际单位。首先，用目标质粒转染NK-92细胞。将细胞转移至15毫升锥底离心管中。然后离心细胞，并用缓冲液将细胞稀释至每100微升含1×10⁶到2×10⁶个细胞的浓度。每1×10⁶个细胞加入1微升抗EGFR-T生物素，轻轻混匀以确保溶液均匀分布。将离心管在4摄氏度下孵育25分钟。孵育后，向离心管中加入最多10毫升缓冲液。接着，以3的加速度和减速度在200 ×g下离心5分钟，离心后弃去上清液。然后每1×10⁶个细胞加入8微升冷缓冲液和2微升抗生物素磁珠。将试管在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。洗涤细胞时，向试管中加入最多 10 毫升缓冲液，然后离心。弃去上清液后，将细胞重悬于 500 微升缓冲液中。将LS柱放入最大磁铁中，并用3毫升缓冲液洗涤。待缓冲液完全流经柱子后，加入细胞悬液。洗涤柱子后，将其从磁铁中取出，放入一个干净的15毫升锥底管中。向柱中加入 5 毫升缓冲液，并尽快使用推杆将 EGF-R 阳性细胞冲洗出来。回收后的转染效率达到 10% 至 20%，最大富集使 Af-CAR-NK-92 细胞纯度提高至 95% 以上。首先，使用磁性激活细胞分选技术获得富集的表达外源基因的 NK-92 细胞。然后，在培养基中制备浓度为每毫升 2.5 × 10⁵ 个分生孢子的烟曲霉分生孢子悬液。将分生孢子悬液以每孔100微升加入96孔细胞培养板的各孔中，于25摄氏度培养16小时。第二天，用培养基将未处理及质粒转染的NK-92细胞各洗涤两次，然后将5×10⁴个NK-92细胞加入含真菌的各孔中，每孔体积为100微升培养基，进行共培养。将培养板置于37摄氏度、加湿的二氧化碳培养箱中孵育至少6小时。以300 G离心96孔板5分钟后，从每个孔中收集100微升上清液，注意勿接触孔底。最后，将上清液转移至反应管中进行ELISA检测。在与烟曲霉菌丝共培养期间，Af-CAR-NK-92细胞的干扰素γ分泌量显著高于对照NK-92细胞。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

使用非病毒性睡美人转座子系统工程化靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞

本视频展示了一种利用Cas9核糖核蛋白介导对原代自然杀伤（NK）细胞进行基因修饰的技术。通过电穿孔将Cas9核糖核蛋白导入原代自然杀伤细胞，该核糖核蛋白由Cas9核酸内切酶与引导RNA（gRNA）结合而成，其中引导RNA通过CRISPR...

一种利用CRISPR Cas9对自然杀伤细胞进行基因编辑的技术

在我们首次进行的人体基因治疗临床试验中，将表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）的T细胞作为B细胞恶性肿瘤的试验性治疗手段。本文描述了利用Sleeping...

用于外周血和脐带血T细胞基因修饰的Sleeping Beauty及人工抗原呈递细胞的临床应用

本研究的目的是开发能够成功实现原代自然杀伤（NK）细胞基因转导的技术。通过葡聚糖介导的慢病毒转导方法，可实现人或小鼠原代NK细胞的高效基因表达。该基因转导方法将极大改善NK细胞的遗传操作效果。...

右旋糖酐提高小鼠和人原代NK细胞的慢病毒转导效率

本方案描述了一种通过转录调控实现目的基因在人类基因组中稳定整合的方法 睡美人 系统。缺陷型慢病毒载体整合的制备 体外...

一种高效的方法 体外 通过转录调控的睡美人系统介导的转座方法——该系统被包装至整合缺陷型慢病毒载体中

在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1...

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

本文介绍了一种扩增外周血自然杀伤（PBNK）细胞、肝脏组织来源的NK细胞，以及由外周血单个核细胞（PBMCs）或脐带血（CB）衍生的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的方法。该方案展示了利用221-mIL-21饲养细胞扩增NK细胞和CAR-NK细胞，并实现了扩增后NK细胞的优化纯度。...

利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。...

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。...

一种利用mRNA生成非病毒性短暂嵌合抗原受体T细胞用于癌症免疫治疗的方法

提供了一种详细的方案，用于利用CRISPR/Cas9技术在原代人T细胞中实现大片段、多顺反子结构的高效靶向敲入。 通过...

非病毒法改造人原代T细胞 通过 同源介导的末端连接靶向整合大型DNA模板

本方案描述了原代T细胞培养的关键步骤，包括其分离、活化、扩增以及通过mRNA电穿孔进行的瞬时转染。此外，还提出了一套用于流式细胞术分析表型、活化标志物、细胞活力以及嵌合抗原受体（CAR）表达的实验流程和抗体组合。...

分离、培养及瞬时转染人原代T细胞以生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

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