利用非病毒型睡美人转座子系统构建靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞

我们的研究致力于开发一种现成可用的CAR细胞疗法，用于治疗侵袭性真菌感染。我们的目标是确定最佳靶点、CAR设计以及免疫细胞组合，以实现最优的治疗效果。近年来的研究进展，包括我们自身的研究工作，主要集中于开发靶向烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的CAR T细胞疗法。

这些工程化细胞在临床前模型中已显示出良好的效果，能够显著降低真菌负荷、调控抗真菌免疫反应，并提高整体生存率。目前该领域内的研究主要集中于利用病毒载体或睡美人转座子系统，针对极为有限的一组靶点开发特异性的CAR T细胞。主要挑战在于确定最佳的真菌靶点，并开发出一种即用型细胞产品，使其在临床应用中兼具有效性与可扩展性。

通过本方案，我们旨在解决生成非病毒性CAR-NK细胞所需的成本效益高且可扩展的方法。该方法为筛选新的抗真菌靶点提供了便捷途径，是实现即用型CAR-NK细胞治疗真菌感染的重要基础步骤。首先，在显微镜下检查NK-92细胞，观察其在清晰背景中是否形成簇状结构；然后，向6孔板中每个条件的孔内加入2毫升细胞培养基，将该板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中。

将8 × 10⁶个NK-92细胞转移至一个15毫升锥底离心管中，在200 × g条件下以加速度和减速度均为3的设置离心5分钟。弃去上清液后，向含有细胞沉淀的离心管中加入最多15毫升预热的PBS，再次离心。在离心过程中，用移液器将8微克Af-CAR质粒DNA和4微克SB100X微环DNA加入同一反应管中，另取一管不加DNA作为模拟对照（mock control）。

对于转染系统，将3毫升电转缓冲液加入第一支试管中，并将其放入移液工作站。离心后，小心弃去上清液，用200微升重悬缓冲液轻柔重悬细胞沉淀。然后将100微升细胞悬液分别加入两支反应管中，并轻柔混匀。

使用转染系统移液器从第一个反应管中吸取DNA细胞混合物，将转染移液器垂直插入移液器支架中的管内。设置第一次脉冲电压为1,650伏，脉冲时间为20毫秒，然后按下启动键以开始脉冲。第一次脉冲完成后，设置第二次脉冲电压为500伏，脉冲时间为100毫秒，并启动第二次脉冲。

第二次脉冲完成后，缓慢将移液器从移液器架上取下。立即将细胞转移至已准备好的培养板的一个孔中，该孔内含有2毫升预热的细胞培养基，轻轻以圆形运动方式移动培养板，使细胞均匀分布。将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。

孵育30分钟后，向孔中加入白细胞介素-2，终浓度为每毫升150国际单位。首先，用目标质粒转染NK-92细胞。将细胞转移至15毫升锥底离心管中。

然后离心细胞，并用缓冲液将细胞稀释至每100微升含1×10⁶到2×10⁶个细胞的浓度。每1×10⁶个细胞加入1微升抗EGFR-T生物素，轻轻混匀以确保溶液均匀分布。将离心管在4摄氏度下孵育25分钟。

孵育后，向离心管中加入最多10毫升缓冲液。接着，以3的加速度和减速度在200 ×g下离心5分钟，离心后弃去上清液。然后每1×10⁶个细胞加入8微升冷缓冲液和2微升抗生物素磁珠。

将试管在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。洗涤细胞时，向试管中加入最多 10 毫升缓冲液，然后离心。弃去上清液后，将细胞重悬于 500 微升缓冲液中。

将LS柱放入最大磁铁中，并用3毫升缓冲液洗涤。待缓冲液完全流经柱子后，加入细胞悬液。洗涤柱子后，将其从磁铁中取出，放入一个干净的15毫升锥底管中。

向柱中加入 5 毫升缓冲液，并尽快使用推杆将 EGF-R 阳性细胞冲洗出来。回收后的转染效率达到 10% 至 20%，最大富集使 Af-CAR-NK-92 细胞纯度提高至 95% 以上。首先，使用磁性激活细胞分选技术获得富集的表达外源基因的 NK-92 细胞。然后，在培养基中制备浓度为每毫升 2.5 × 10⁵ 个分生孢子的烟曲霉分生孢子悬液。

将分生孢子悬液以每孔100微升加入96孔细胞培养板的各孔中，于25摄氏度培养16小时。第二天，用培养基将未处理及质粒转染的NK-92细胞各洗涤两次，然后将5×10⁴个NK-92细胞加入含真菌的各孔中，每孔体积为100微升培养基，进行共培养。将培养板置于37摄氏度、加湿的二氧化碳培养箱中孵育至少6小时。

以300 G离心96孔板5分钟后，从每个孔中收集100微升上清液，注意勿接触孔底。最后，将上清液转移至反应管中进行ELISA检测。在与烟曲霉菌丝共培养期间，Af-CAR-NK-92细胞的干扰素γ分泌量显著高于对照NK-92细胞。