Name: 人诱导多能干细胞衍生的嵌合抗原受体表达自然杀伤细胞的研究进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: 了解人诱导多能干细胞衍生的嵌合抗原受体表达自然杀伤细胞的分化与扩增方法，用于癌症免疫治疗。该技术通过非病毒基因整合和CRISPR-Cas9优化，提高抗肿瘤活性和体内持久性。

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感谢Kaufman实验室所有成员的支持、科学见解和讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助U01CA217885、P30CA023100（行政补充资助）以及加州大学圣地亚哥分校桑福德干细胞研究所的支持。JT：撰写和修改稿件。DSK：审阅并编辑稿件。

DSK 是 Shoreline Biosciences 的联合创始人及顾问，并持有该公司股权。DSK 还为 Therabest 和 RedC Bio 提供咨询服务，并从中获得收入和/或股权。这些安排的条款已经过加州大学圣地亚哥分校根据其利益冲突政策审查并批准。其余作者声明无竞争利益。

本方案概述了一种标准化且可重复的方法，旨在通过稳定的细胞来源生成表达CAR的iPSC来源的NK细胞，以促进靶向治疗 &#34;现成的&#34; 癌症免疫治疗。多项临床前和临床研究已表明，基于过继性自然杀伤（NK）细胞的免疫治疗在治疗癌症方面具有疗效，同时可最大限度地减少移植物抗宿主病（GvHD）或细胞因子释放综合征（CRS）等毒性反应。23,42, 49,50,51,52,53,54,55,<sup class="xr...

自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统中的一种淋巴细胞，在抵御肿瘤和病毒感染细胞的早期防御中起着关键作用1,2,3。与T细胞不同，NK细胞不需要通过主要组织相容性复合体（MHC）分子进行抗原呈递。相反，NK细胞表达一系列激活性和抑制性受体，用以调控其活性3。NK细胞介导的细胞毒性作用通过多种机制实现，包括释放穿孔素和颗粒酶、激活死亡受体，以及产生如IFN-γ和TNF-α等促炎性细胞因子。这种独特的作用模式使NK细胞成为癌症免疫治疗的理想候选者，特别是在治疗免疫逃逸构成重大障碍的实体瘤方面具有潜力1,2,3,4。
肝细胞癌（HCC）是全球最常见且致死率最高的肝癌类型之一5。传统的治疗方法，包括手术、化疗和放疗，通常临床获益有限，并导致较高的复发率6,7。近年来，免疫治疗和靶向治疗的进展显著影响了HCC的治疗策略8,9。免疫检查点抑制剂，如纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab），通过增强免疫细胞对癌细胞的反应，已显示出良好的疗效10,11。这些疗法已使部分患者的生存率提高，生活质量改善。然而，它们也可能引发免疫相关的不良反应，从而限制其在某些患者中的应用12。靶向治疗药物，如索拉非尼（sorafenib）和仑伐替尼（lenvatinib），可特异性抑制促进癌细胞生长和血管生成的信号通路13。这些治疗在控制疾病进展和延长生存期方面具有明确的疗效8,14。然而，靶向治疗通常会出现耐药性，且治疗相关的副作用较为常见15,16。在癌症免疫治疗策略的诸多新兴方向中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞的出现彻底改变了癌症治疗格局，尤其在淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了突破性进展17,18,19。
表达CAR的NK细胞将NK细胞的天然细胞毒性与CAR技术的精准靶向能力相结合，为肝细胞癌（HCC）等实体瘤提供了一种创新且具有潜在变革性的治疗策略20,21,22,23,24。经CAR改造的细胞可特异性识别并杀伤表达靶抗原的肿瘤细胞，同时保护正常组织，从而降低传统疗法相关的脱靶效应风险25,26,27。由外周血或脐带血分离的NK细胞制备的CAR-NK细胞，通常通过将CAR结构转导至NK细胞中实现，该结构包含一个胞外抗原识别域、一个跨膜域以及对细胞活化和增殖至关重要的胞内信号域28,29,30。
通过使用诱导性多能干细胞（iPSCs），可以解决为临床治疗构建稳定且均一的功能性工程化自然杀伤（NK）细胞群体所面临的挑战31,32。对人源iPSCs进行基因改造，使其携带针对NK细胞优化的嵌合抗原受体（CAR），可增强NK细胞的活化与增殖信号，并提供一种标准化的、可无限扩增且高度均一的CAR表达NK细胞群体，作为即用型治疗方案&#34;off-the-shelf therapy&#34;20,33。本方案中，通过对iPSCs进行遗传修饰以生成表达CAR的iPSC来源NK细胞，涉及整合一种针对NK细胞优化的CAR结构，该结构包含来源于NK细胞的跨膜区和信号传导结构域(NKG2D-2B4-CD3ζ)，以及一种抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）的单链可变区片段（scFv），如我们先前研究所述23。随后，利用此前建立的NK细胞分化方案对基因工程化后的iPSCs进行分化与扩增34。这些经工程化改造、表达CAR的iPSC来源NK细胞能够识别并清除表达特定肿瘤相关抗原（如在肝细胞癌及其他恶性肿瘤中高表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3））的肝细胞癌（HCC）及其他肿瘤细胞35,36,37,38。
iPSC来源的CAR-NK细胞在治疗多种癌症中的应用具有重要意义30,39,40; 目前许多由iPSC衍生的CAR-NK细胞正处于临床试验阶段41,42,43为促进该领域的进展，本方案实现了从细胞工程化到分化为成熟自然杀伤细胞的高效制备工程化诱导多能干细胞来源的CAR-NK细胞， 体外 扩增

<table><tbody><tr><td>aAPC&amp;nbsp;</td><td>Dean A. Lee 实验室&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>a-MEM 培养基&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Cat#12634</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗 DYKDDDDK（FLAG 标签）</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#637308</td><td></td></tr><tr><td>APC-抗人 TRA-1-81&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17-8883-42&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD16</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#302015</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD43&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>Cat# 560198&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD45&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>Cat# 555485&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>APC-GPC3</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#DB100B</td><td></td></tr><tr><td>APC-NKG2D&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat# 558071&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 绿色检测试剂&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Cat#C10423</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Violet 细胞增殖试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Cat#C34571</td><td>细胞示踪荧光染料&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CryoStor 溶液&amp;nbsp;</td><td>干细胞科技公司</td><td>https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html</td><td>冷冻保存培养基</td></tr><tr><td>CTS NK Xpander</td><td>吉布科</td><td>A5019001</td><td></td></tr><tr><td>CTS NK-Xpander 培养基</td><td>生命技术公司</td><td>Cat#A5019001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>吉布科</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充剂，丙酮酸钠</td><td>吉布科</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 人 NK 细胞富集试剂盒&amp;nbsp;</td><td>干细胞科技公司&amp;nbsp;</td><td>Cat#19055</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Cat# 10437010</td><td></td></tr><tr><td>荧光素异硫氰酸酯-CD94&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#555888</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>吉布科</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#555029</td><td></td></tr><tr><td>GolgiStop&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#554724</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 营养混合物，含 GlutaMAX 补充剂</td><td>吉布科</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>马血清&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Cat#16050130</td><td></td></tr><tr><td>人血清&amp;nbsp;</td><td>AB 西格玛奥德里奇</td><td>Cat#BP2525100</td><td></td></tr><tr><td>人干细胞 Nucleofector™ 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>龙沙&amp;nbsp;</td><td>Cat# VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>人：HePG2 细胞&amp;nbsp;</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）&amp;nbsp;</td><td>Cat#HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>人：HePG2-td-tomato-luc 细胞&amp;nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman 实验室</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>人：iPS 细胞&amp;nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman 实验室&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>人：SNU-449 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat#CRL-2234</td><td></td></tr><tr><td>人：SNU-449-td-tomato-luc 细胞&amp;nbsp;</td><td>Dan S. Kaufman 实验室</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Caspase-3/7 绿色凋亡检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Essen Bioscience&amp;nbsp;</td><td>Cat#4440</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>MP 生物医学&amp;nbsp;人血清，AB 型</td><td>MP 生物医学</td><td>ICN2938249</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus</td><td>干细胞科技公司&amp;nbsp;</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress 软件&amp;nbsp;</td><td>ACEA 生物科学&amp;nbsp;</td><td>https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 抗人 SSEA-4 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>330420</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD16&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#560995&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD226</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#559789</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD34&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>Cat# 555822&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat# 555483&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD94&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#555888&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-cy7-CD56&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 318318&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-FAS 配体&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#564261&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp30</td><td>BD 生物科学</td><td>Cat# 558407</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp44&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#558563&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#331908</td><td></td></tr><tr><td>PE-NKp46&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#557991&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>外周血血沉棕黄层&amp;nbsp;</td><td>圣迭戈血库（https://www. sandiegobloodbank.org/）&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PE-TRAIL&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>Cat#565499&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO&amp;nbsp;</td><td>Branden Moriarity 实验室&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMAX-GFP 质粒</td><td>龙沙</td><td>N/A</td><td>GFP 阳性对照&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>Graphpad&amp;nbsp;</td><td>版本 9</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9&amp;nbsp;</td><td>金斯瑞</td><td>PX165</td><td></td></tr><tr><td>RBC 裂解缓冲液（10×）</td><td>Biolegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>重组人 bFGF 基础型&amp;nbsp;</td><td>R&amp;D 系统&amp;nbsp;</td><td>Cat#4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>重组人 BMP-4&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat#120-05</td><td></td></tr><tr><td>重组人 FLT-3 配体&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-15&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat# 200-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat# 200-02</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-3&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat#200-03</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-7&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat# 200-07</td><td></td></tr><tr><td>重组人 Nodal 蛋白</td><td>R&amp;D 系统&amp;nbsp;</td><td>Cat#3218-ND-025</td><td></td></tr><tr><td>重组人 SCF&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>重组人 TGF-&amp;beta;1</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat#100-21</td><td></td></tr><tr><td>重组人 VEGF&amp;nbsp;</td><td>百肽生物科技</td><td>Cat# 100-20</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>吉布科</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 培养基</td><td>干细胞科技公司&amp;nbsp;</td><td>5270</td><td>拟胚体形成培养基</td></tr><tr><td>STEMdiff APEL2 培养基&amp;nbsp;</td><td>干细胞科技公司&amp;nbsp;</td><td>Cat#05270</td><td></td></tr><tr><td>超级 piggyBac 转座酶表达载体</td><td>SBI</td><td>Cat#PB210PA-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX AADvanced 死细胞染色试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S10274, S10349</td><td>死细胞染色溶液试剂盒</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>吉布科</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

自然杀伤（NK）细胞是一类先天性免疫细胞，在机体抵御肿瘤和病毒感染中发挥关键作用。利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源、表达嵌合抗原受体（CAR）的NK细胞，已成为一种具有前景的“即用型”癌症免疫治疗策略。本文中，我们采用了一种针对NK细胞优化的CAR结构，该结构包含NKG2D的跨膜区、2B4共刺激区以及CD3ζ信号区，已被证实可有效激发NK细胞介导的强效抗原特异性抗肿瘤活性。利用iPSC生成CAR-NK细胞具有多项优势，包括CAR表达均一、可扩展性强、可重复性高以及具备临床应用潜力。本方案从细胞工程改造到分化过程提供了详细的逐步操作流程，可用于生成经NK细胞优化的iPSC来源CAR表达NK细胞，为提高抗肿瘤活性提供了一种标准化且靶向性强的癌症免疫治疗方法，凸显其作为多种恶性肿瘤潜在治疗手段的重要前景。

抗GPC3-CAR iPSC来源的NK细胞分化与扩增示意图 
示意图展示了 体外 由人诱导多能干细胞（iPSCs）分化的抗GPC3-CAR工程化NK细胞，以及携带GPC3 CAR结构的piggyBac载体示意图。首先，将未修饰的iPSCs转染携带编码GPC3 CAR（嵌合抗原受体）的piggyBac载体。转染后，表达GPC3 CAR的iPSCs进行克隆扩增，随后分化为具有功能的CAR iPSC来源NK细胞。这些工程化NK细胞随后接受 体外 和 体内 用于评估其对多种肿瘤细胞系抗肿瘤活性的功能实验图1).
野生型及抗GPC3-CAR基因修饰iPSC在不同阶段NK分化过程的显微分析 
将GPC3 CAR基因修饰的iPSC分化为抗GPC3-CAR基因修饰的iPSC来源的NK细胞。从GPC3 CAR基因修饰的iPSC形成悬浮胚状体（EB），到进一步分化为GPC3-CAR iPSC来源的NK细胞，整个...

本文介绍一种可分化并扩增人诱导多能干细胞（iPSC）来源的表达嵌合抗原受体（CAR）的自然杀伤细胞的方法，该方法能增强其对多种恶性肿瘤的杀伤能力。本方案展示了优化后的iPSC来源CAR-NK细胞的分化与扩增过程，以及针对多种肿瘤细胞系的抗肿瘤活性检测方法。

自然杀伤（NK）细胞是一类先天免疫细胞，在机体抵御肿瘤和病毒感染中发挥关键作用。NK细胞的生成……

我们的研究范围主要集中在开发具有增强抗肿瘤活性和体内持久性的诱导多能干细胞来源的CAR-NK细胞，以更有效地治疗多种恶性肿瘤。通过这一新型的CAR-iPSC-NK细胞生成方案，我们旨在探究这些细胞如何克服肿瘤微环境的抵抗作用，提高疗效，并确保安全且可放大的生产过程。在开发iPSC来源的CAR-NK细胞过程中，主要的实验挑战包括实现iPSC向功能性NK细胞的一致且高效的分化，确保CAR的稳定表达而不产生任何不良影响，以及提升细胞在体内的持久性。此外，研究人员在临床应用方面还面临着可扩展性、免疫排斥以及监管方面的障碍。我们通过采用基于转座子的基因修饰技术，实现了高效的非病毒载体介导的CAR基因整合，从而显著推动了诱导多能干细胞（iPSC）来源的CAR-NK细胞研究。此外，我们在iPSC水平上优化了CRISPR-Cas9技术，以敲除免疫检查点和TMA因子，从而提升细胞的功能、在实体瘤模型中的抗肿瘤疗效以及体内持久性。通过采用非病毒型piggyBac载体介导的CAR基因表达方案，我们旨在填补诱导多能干细胞来源的CAR-NK细胞在基因修饰方面对于安全性、高效性及可扩展性需求的空白。该方法降低了插入突变的风险，同时提高了CAR-NK细胞制备的可重复性与成本效益，适用于癌症免疫治疗。未来，本实验室将致力于开发靶向免疫检查点的新型工程化诱导多能干细胞来源的NK细胞。我们还将研究利用双特异性或三特异性抗体靶向多种肿瘤微环境因子，以增强其在体内的特异性、持久性及抗肿瘤活性。开始进行悬浮胚胎体（EB）形成传代时，将约200,000个经基因工程改造的CAR诱导多能干细胞（iPSCs）接种至六孔基底膜基质预包被的培养板中，每孔加入MT补充剂，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。两天后，移除培养基，并加入1毫升预热的TrypLE Select溶液，在37摄氏度下孵育5分钟以解离细胞。随后，轻柔地将细胞聚集体解离为单细胞悬液，并将悬液转移至15毫升锥形管中。加入3毫升磷酸盐缓冲液（PBS）以终止解离反应。接下来，将细胞重悬于MK SR-plus培养基中，通过70微米细胞筛过滤以去除细胞团块。离心细胞，用5毫升PBS洗涤沉淀，然后将其重悬于1毫升EB形成培养基中。计数后，使用含有细胞因子和10 µM ROCK抑制剂的拟胚体形成培养基将细胞稀释至适当密度。用多通道移液器在96孔板中每孔加入100 µL拟胚体培养基，每孔接种3000至10,000个细胞。以300 ×g离心5分钟，随后在37°C、5% CO₂条件下培养6天。为检查胚胎体质量，首先准备4毫升预热的含0.4%鸡血清的0.25%胰蛋白酶溶液，用于解离拟胚体。培养六天后，将10至30个拟胚体转移至15毫升锥形管中。向拟胚体中加入胰蛋白酶-鸡血清溶液，并在水浴中孵育。每3至5分钟涡旋振荡EBs一次，持续10分钟。用移液器将消化后的EBs上下吹打数次，以确保充分解离。然后加入5毫升PBS以终止消化过程。将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至新的锥形管中。随后以300 ×g离心5分钟，并将沉淀重悬于3至5毫升新鲜EB培养基中。计数后，使用典型的EB标记物对细胞进行染色。将推荐体积的抗体加入含有100微升流式缓冲液的EB解离单细胞各管中，冰上孵育30分钟。孵育后，用流式缓冲液洗涤细胞两次。加入SYTOX蓝死活染料，然后使用流式细胞术进行分析。首先，在六孔板的每个孔中加入5至10微升2%的灭菌明胶溶液进行包被。将六孔板置于37摄氏度孵育2至4小时。孵育结束后，吸除残留的明胶溶液，并向明胶包被的六孔板每孔中加入3毫升含有细胞因子的自然杀伤（NK）分化培养基。接下来，使用1毫升移液器，将来自经基因工程改造的CAR iPSCs的拟胚体（EBs）小心转移至10厘米培养皿中。向6孔板的每孔加入3毫升含细胞因子的NK分化培养基。使用1毫升微量移液器将16至20个拟胚体（EBs）分配至6孔板的每孔中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养3至4周。孵育后，通过流式细胞术检测悬浮细胞中NK细胞标志物CD45阳性与CD56阳性的表达情况。当超过80%的悬浮细胞表达CD45阳性与CD56阳性时，将细胞经70 µm滤网过滤，以去除细胞团块，收集细胞。在将人工抗原呈递细胞（artificial APCs）与NK细胞共培养之前，需用100戈瑞（gray）照射人工APCs，并将其作为冷冻储备保存。收获NK细胞后，将其以每毫升5×10⁵个细胞的密度接种于含50单位/毫升白细胞介素-2和白细胞介素-15的NK细胞扩增培养基中。按1:1的比例将解冻后的经照射人工APCs加入NK细胞中，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。首先启动流式细胞仪。检测抗GPC3 CAR诱导多能干细胞来源的NK细胞上NK激活受体的表达，以评估CAR修饰细胞的活性及成熟状态。进行Caspase-3/7检测实验。在GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞中计数靶细胞，并在37摄氏度、避光条件下，用终浓度为五微摩尔的CellTrace Violet染料在PBS中对靶细胞预染色15分钟。在与CAR iPSC来源的NK细胞以不同效应细胞与靶细胞比例进行共培养前，用完全培养基洗涤染色后的靶细胞。共培养3小时30分钟后。加入Caspase-3/7绿色检测试剂，再孵育30分钟。在染色的最后五分钟内加入SYTOX死细胞染色液，并轻轻混匀。使用流式细胞术分析染色后的细胞。在第6天观察到由GPC3 CAR基因工程改造的IPCs形成的旋转EBs，证实了早期分化。从第3天到第28天，由GPC3 CAR IPCs分化而来的自然杀伤（NK）细胞在各个阶段均表现出明显的形态学特征。流式细胞术分析显示，在第6天，野生型和GPC3 CAR iPSCs来源的旋转EBs均表达造血抗原CD34和CD31，以及少量CD43，但尚未表达CD45。在第35天，检测到成熟野生型及GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞具有特异性标志物，证实NK细胞分化成功。扩增的野生型及靶向GPC3的CAR-iPSC来源的NK细胞表现出多种活化标志物，表明NK细胞已成熟。通过流式细胞术确认了肿瘤细胞系上GPC3抗原的表达，验证了靶向GPC3的CAR-iPSC来源NK细胞的靶向特异性。与野生型iPSC来源的NK细胞相比，靶向GPC3的CAR-iPSC来源NK细胞对表达GPC3的HepG2、SNU-449、CAL 27和SKOV3细胞系表现出更高的细胞毒性活性。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人诱导多能干细胞衍生的嵌合抗原受体表达自然杀伤细胞的研究进展

本文介绍了一种利用人工抗原呈递细胞（aAPC）从大量T细胞群体中激活并扩增人源NKT细胞的方法。采用基于CD1d的aAPC可提供一种标准化的方法，用于大量生成具有功能活性的NKT细胞。...

人工抗原呈递细胞（aAPC）介导的自然杀伤T细胞活化与扩增

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。...

一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

本文介绍了一种简单且可靠的分析方法，可用于检测不同NK细胞亚群的脱颗粒、细胞因子和趋化因子产生等多种NK细胞功能。...

基于流式细胞术的自然杀伤细胞功能检测方法

我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。...

一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法

本文介绍了一种体外共培养方法，用于反复刺激靶向肿瘤的T细胞，从而实现对T细胞抗肿瘤活性的表型和功能分析。...

体外肿瘤细胞再攻击用于预测性评估嵌合抗原受体T细胞的抗肿瘤功能

人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

本文介绍了一种扩增外周血自然杀伤（PBNK）细胞、肝脏组织来源的NK细胞，以及由外周血单个核细胞（PBMCs）或脐带血（CB）衍生的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的方法。该方案展示了利用221-mIL-21饲养细胞扩增NK细胞和CAR-NK细胞，并实现了扩增后NK细胞的优化纯度。...

利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法

本方案展示了如何在3D和2D培养条件下，从人类扩展潜能干细胞（hEPSCs）中分化出具有轻度细胞毒性的CD3−/CD45+CD56+细胞。该方法可在不破坏复杂微环境的前提下，实现常规的表型验证。...

从人类扩展潜能干细胞生成自然杀伤细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

我们概述了一种利用非病毒型“睡美人”转座子系统制备靶向真菌病原体的嵌合抗原受体-自然杀伤（CAR-NK）细胞的转染方案。为评估抗原特异性激活情况，我们将工程化细胞与Aspergillus...

利用非病毒型睡美人转座子系统构建靶向真菌感染的嵌合抗原受体-自然杀伤细胞

本方案提供了一种标准化的 体外...

利用活细胞成像和流式细胞术定量分析嵌合抗原受体与治疗性抗体增强的自然杀伤细胞毒性

了解人诱导多能干细胞衍生的嵌合抗原受体表达自然杀伤细胞的分化与扩增方法，用于癌症免疫治疗。该技术通过非病毒基因整合和CRISPR-Cas9优化，提高抗肿瘤活性和体内持久性。

人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

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