人诱导多能干细胞来源的表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞研究进展

我们的研究范围主要集中在开发具有增强抗肿瘤活性和体内持久性的诱导多能干细胞来源的CAR-NK细胞，以更有效地治疗多种恶性肿瘤。通过这一新型的CAR-iPSC-NK细胞生成方案，我们旨在探究这些细胞如何克服肿瘤微环境的抵抗作用，提高疗效，并确保安全且可放大的生产过程。在开发iPSC来源的CAR-NK细胞过程中，主要的实验挑战包括实现iPSC向功能性NK细胞的一致且高效的分化，确保CAR的稳定表达而不产生任何不良影响，以及提升细胞在体内的持久性。

此外，研究人员在临床应用方面还面临着可扩展性、免疫排斥以及监管方面的障碍。我们通过采用基于转座子的基因修饰技术，实现了高效的非病毒载体介导的CAR基因整合，从而显著推动了诱导多能干细胞（iPSC）来源的CAR-NK细胞研究。此外，我们在iPSC水平上优化了CRISPR-Cas9技术，以敲除免疫检查点和TMA因子，从而提升细胞的功能、在实体瘤模型中的抗肿瘤疗效以及体内持久性。

通过采用非病毒型piggyBac载体介导的CAR基因表达方案，我们旨在填补诱导多能干细胞来源的CAR-NK细胞在基因修饰方面对于安全性、高效性及可扩展性需求的空白。该方法降低了插入突变的风险，同时提高了CAR-NK细胞制备的可重复性与成本效益，适用于癌症免疫治疗。未来，本实验室将致力于开发靶向免疫检查点的新型工程化诱导多能干细胞来源的NK细胞。我们还将研究利用双特异性或三特异性抗体靶向多种肿瘤微环境因子，以增强其在体内的特异性、持久性及抗肿瘤活性。

开始进行悬浮胚胎体（EB）形成传代时，将约200,000个经基因工程改造的CAR诱导多能干细胞（iPSCs）接种至六孔基底膜基质预包被的培养板中，每孔加入MT补充剂，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。两天后，移除培养基，并加入1毫升预热的TrypLE Select溶液，在37摄氏度下孵育5分钟以解离细胞。随后，轻柔地将细胞聚集体解离为单细胞悬液，并将悬液转移至15毫升锥形管中。加入3毫升磷酸盐缓冲液（PBS）以终止解离反应。

接下来，将细胞重悬于MK SR-plus培养基中，通过70微米细胞筛过滤以去除细胞团块。离心细胞，用5毫升PBS洗涤沉淀，然后将其重悬于1毫升EB形成培养基中。

计数后，使用含有细胞因子和10 µM ROCK抑制剂的拟胚体形成培养基将细胞稀释至适当密度。用多通道移液器在96孔板中每孔加入100 µL拟胚体培养基，每孔接种3000至10,000个细胞。以300 ×g离心5分钟，随后在37°C、5% CO₂条件下培养6天。

为检查胚胎体质量，首先准备4毫升预热的含0.4%鸡血清的0.25%胰蛋白酶溶液，用于解离拟胚体。培养六天后，将10至30个拟胚体转移至15毫升锥形管中。向拟胚体中加入胰蛋白酶-鸡血清溶液，并在水浴中孵育。

每3至5分钟涡旋振荡EBs一次，持续10分钟。用移液器将消化后的EBs上下吹打数次，以确保充分解离。然后加入5毫升PBS以终止消化过程。

将细胞悬液通过70微米细胞滤网过滤至新的锥形管中。随后以300 ×g离心5分钟，并将沉淀重悬于3至5毫升新鲜EB培养基中。计数后，使用典型的EB标记物对细胞进行染色。

将推荐体积的抗体加入含有100微升流式缓冲液的EB解离单细胞各管中，冰上孵育30分钟。孵育后，用流式缓冲液洗涤细胞两次。加入SYTOX蓝死活染料，然后使用流式细胞术进行分析。

首先，在六孔板的每个孔中加入5至10微升2%的灭菌明胶溶液进行包被。将六孔板置于37摄氏度孵育2至4小时。孵育结束后，吸除残留的明胶溶液，并向明胶包被的六孔板每孔中加入3毫升含有细胞因子的自然杀伤（NK）分化培养基。

接下来，使用1毫升移液器，将来自经基因工程改造的CAR iPSCs的拟胚体（EBs）小心转移至10厘米培养皿中。向6孔板的每孔加入3毫升含细胞因子的NK分化培养基。使用1毫升微量移液器将16至20个拟胚体（EBs）分配至6孔板的每孔中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养3至4周。

孵育后，通过流式细胞术检测悬浮细胞中NK细胞标志物CD45阳性与CD56阳性的表达情况。当超过80%的悬浮细胞表达CD45阳性与CD56阳性时，将细胞经70 µm滤网过滤，以去除细胞团块，收集细胞。

在将人工抗原呈递细胞（artificial APCs）与NK细胞共培养之前，需用100戈瑞（gray）照射人工APCs，并将其作为冷冻储备保存。收获NK细胞后，将其以每毫升5×10⁵个细胞的密度接种于含50单位/毫升白细胞介素-2和白细胞介素-15的NK细胞扩增培养基中。按1:1的比例将解冻后的经照射人工APCs加入NK细胞中，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育。

首先启动流式细胞仪。检测抗GPC3 CAR诱导多能干细胞来源的NK细胞上NK激活受体的表达，以评估CAR修饰细胞的活性及成熟状态。进行Caspase-3/7检测实验。

在GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞中计数靶细胞，并在37摄氏度、避光条件下，用终浓度为五微摩尔的CellTrace Violet染料在PBS中对靶细胞预染色15分钟。在与CAR iPSC来源的NK细胞以不同效应细胞与靶细胞比例进行共培养前，用完全培养基洗涤染色后的靶细胞。共培养3小时30分钟后。

加入Caspase-3/7绿色检测试剂，再孵育30分钟。在染色的最后五分钟内加入SYTOX死细胞染色液，并轻轻混匀。使用流式细胞术分析染色后的细胞。

在第6天观察到由GPC3 CAR基因工程改造的IPCs形成的旋转EBs，证实了早期分化。从第3天到第28天，由GPC3 CAR IPCs分化而来的自然杀伤（NK）细胞在各个阶段均表现出明显的形态学特征。

流式细胞术分析显示，在第6天，野生型和GPC3 CAR iPSCs来源的旋转EBs均表达造血抗原CD34和CD31，以及少量CD43，但尚未表达CD45。在第35天，检测到成熟野生型及GPC3 CAR iPSC来源的NK细胞具有特异性标志物，证实NK细胞分化成功。

扩增的野生型及靶向GPC3的CAR-iPSC来源的NK细胞表现出多种活化标志物，表明NK细胞已成熟。通过流式细胞术确认了肿瘤细胞系上GPC3抗原的表达，验证了靶向GPC3的CAR-iPSC来源NK细胞的靶向特异性。与野生型iPSC来源的NK细胞相比，靶向GPC3的CAR-iPSC来源NK细胞对表达GPC3的HepG2、SNU-449、CAL 27和SKOV3细胞系表现出更高的细胞毒性活性。