Name: 小容量腔室中的高分辨率呼吸测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 了解高分辨率呼吸测量技术在小容量腔室中的应用方法，使用0.5毫升腔室进行线粒体功能分析。该方法仅需传统样本量的四分之一，适用于线粒体疾病诊断和药物开发研究。

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我们感谢 Manuela&#160;Passrugger 在分离线粒体数据收集方面的贡献，Patrizia Guerth 在搅拌转速测试方面的技术支持，以及 Mateus Grings 对搅拌器测试时间常数的分析。我们感谢我们的合作伙伴奥地利 Kolsass 的 WGT Elektronik GmbH &amp;#38; Co KG 提供玻璃腔室、密封塞和磁场强度的技术参数信息。我们感谢 Luiza HD Cardoso、Alejandra Romero-Martinez、Ondrej Sobotka、Alba Timon-Gomez 和 Jaime Willis 提出的宝贵意见。本研究部分由欧盟“地平线2020”研究与创新计划资助，资助号为 859770（NextGen-O2k 项目）。同时感谢 COST 行动 CA15203 MitoEAGLE 项目提供的短期科学访问计划（LFGS、LR）的财政支持。

在人类血小板研究中，八名志愿者签署了书面知情同意书，同意参与本研究，该研究已获得瑞典伦理审查局批准（编号：2013/181）。两株来自男性新生儿的人类皮肤成纤维细胞系购自ATCC，并根据捷克共和国卫生部的伦理批准（项目编号：AZV MZ CR NU22-07-00474）进行使用。涉及小鼠的实验操作均依照奥地利动物实验法以及《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》进行（Tierversuchsgesetz 2012；指令 2010/63/EU；BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016）。实验中遵循3R原则，以尽量减少实验动物的使用数量。
1. 体积校准
<ol>
	<li>将小体积腔室（sV）或经典体积腔室（cV）安装到Oroboros&#160;上（图1A、B；表1）。</li>
	<li>打开Oroboros&#160;仪器，并连接至DatLab软件。</li>
	<li>干燥腔室。</li>
	<li>向sV&#160;中加入0.54 mL H2O（有效实验体积0.50 mL，毛细管死体积0.04 mL），或向cV&#160;中加入2.07 mL H2O（有效体积2.00 mL，毛细管死体积0.07 mL）。 
	注意：为避免液体在玻璃筒顶部与聚甲醛（POM）腔室支架之间流失，应将移液枪头插入足够深度，使其接触玻璃腔室壁。</li>
	<li>启动搅拌器。</li>
	<li>在关闭腔室前，润湿密封塞的O型圈，同时保持其毛细管部分干燥。松开体积校准环，将密封塞向下插入，直至液体充满密封塞毛细管，并在毛细管顶端的接收处形成一小滴液体（表1）。</li>
	<li>拧紧体积校准环以固定其位置，确保每次插入密封塞时均可获得校准后的体积。</li>
</ol>
2. Oroboros&#160;常规设置
<ol>
	<li>开始 DatLab 软件</li>
	<li>设置 实验温度 (37 &#176;C）以及 搅拌转速 在 550 rpm （9.2 Hz 或每秒转数）在腔室中V 或 750 rpm (12.5 Hz) 在 Chamber c 中V. 设置 数据采样间隔 在 2 s 与 平滑处理 结束 80 s （40个数据点）在仪器O中2&#160;背景测试或 40 s （20 个数据点）用于呼吸测定。 
	注意：磁力搅拌子（AlNiCo 材质，外包聚偏二氟乙烯 [PVDF]）； 表1由腔室内搅拌器水平处强度为3.5 mT的脉冲旋转磁场驱动振荡。</li>
	<li>进行空气校准28 在MiR05或后续实验所用的相同孵育介质中。</li>
	<li>偶尔进行零氧校准，但切勿在开始实验前立即进行。
	<ol>
		<li>通过溶解 O 制备新鲜的 Na-连二亚硫酸盐储备液2-将Zero粉末溶于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中，配制成2.5 mM或10 mM浓度，用于sV 或 cV 分别</li>
		<li>过量滴加连二亚硫酸钠以获得原始信号 R0 或零电流&#181;A] 在 O2&#160;浓度 0 &#181;M14,28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 仪器操作O2 背景测试
<ol>
	<li>腔室 sV
	<ol>
		<li>空气校准后，关闭腔室。监测氧气信号约60分钟，直至O₂2&#160;浓度从空气饱和状态下降至约 150 &#181;M. 设置四个标记 J&#176;1&#160;到 J&#176;4&#160;在图 'O 上2&#160;斜率负值 
		注意：执行此仪器操作时2&#160;每天开始实验前进行背景测试。</li>
		<li>可选：使用 Hamilton 注射器，滴加按步骤 2.4.1 制备的连二亚硫酸钠溶液，以达到所需的 O₂ 浓度。2&#160;浓度 100 &#181;M (图1C). 
		注意：在另一项方案中，连二亚硫酸钠被滴加到&#160;使用滴定-注射微泵（TIP2k； 补充图1 和 补充图2) 与标准方法测定仪器本底O进行比较2&#160;通量28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腔室 cV
	<ol>
		<li>空气校准后，关闭腔室，等待 O2&#160;斜率，并设置 J&#176;1&#160;在图上标记“O2 斜率负值”28使用 Hamilton 注射器，按照 2.4.1 步骤制备的 Na-连二亚硫酸盐，以逐步滴定 0.7 &#181;L 以匹配腔室的氧气环境V 并降低 O2&#160;浓度至 150 &#181;M.</li>
		<li>添加另一步连二亚硫酸钠滴定（约 7 &#181;L) 以降低 O2&#160;浓度至 100 &#181;M (图1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仪器 O2&#160;背景数据分析
	<ol>
		<li>计算仪器的O2&#160;DatLab 中的背景斜率28选择 通量/斜率 从顶部菜单。</li>
		<li>打开 O2 背景校正 窗口。选择 活动文件 作为O的来源2 背景并选择 J&#176; 标记 用于线性回归的计算。 应用 O2&#160;背景校正。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg" /> 
图1：小体积（sV）和经典体积（cV) 室和仪器 O2&#160;背景检测 (A) 室V. (B) 室 cV. (C代表性轨迹图&#160;斜率呈负值且 J&#176;1&#160;标记，sV （0.5 mL；绿色）和 cV （2.0 mL；蓝色） （D） 相应的氧浓度和R1标记。三次手动添加连二亚硫酸钠&#160;滴定（约 0.7 &#181;L，10 mM 储存液；cV）和最终 7.0 &#181;L 2.5 mM 和 10 mM 的滴定&#160;s中的储备V 和 cV 分别对腔室进行滴定，由此产生的峰信号已被消除。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
4. 将样品加入 Oroboros 反应室
注意：样本可通过两种方法加入腔室：部分体积置换法（本研究中的血小板和成纤维细胞）或完全体积置换法（本研究中的分离线粒体）。
<ol>
	<li>部分体积置换
	<ol>
		<li>移除完全插入的塞子。用移液器吸取并弃去体积为 Vout 的 MiR05。对于血小板，Vout 为 60–70 µL；对于成纤维细胞，为 80–150 µL，具体数值根据储备细胞悬液中的细胞浓度计算确定。</li>
		<li>用移液器将等体积 VJ.i 的储备细胞悬液（已知细胞浓度）加入氧电极室中，该体积与 Vout 相同（图2）。</li>
		<li>根据实际体积 V'（0.54 mL 和 2.07 mL）计算实验中的细胞浓度，该体积大于有效实验体积 V（0.5 mL 和 2.0 mL）。 
		注：储备细胞悬液的浓度和实验细胞浓度应预先设计，以确保 VJ.i = Vout 的体积值可兼容较小的滴定误差。在血小板实验中，sV 室使用了一种原型塞子，其帽状部分的死体积为 0.05 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完全体积置换
	<ol>
		<li>用虹吸法将室内的全部培养基吸出，并分别向 sV 或 cV&#160;室中加入至少 0.54 mL 或 2.07 mL 含实验样品浓度的分离线粒体储备溶液。</li>
		<li>关闭反应室，再用虹吸法将塞子接收腔中多余的线粒体储备液吸出。 
		注：完全体积置换可避免通过 Hamilton 注射器经塞子毛细管向密闭&#160;反应室中滴加样品时可能引入的线粒体浓度变异。后一种方法适用于由高浓度储备悬液制备的小直径样品（例如分离的线粒体）；然而，该方法会使脆弱细胞暴露于 Hamilton 注射器长 51 mm、内径 0.41 mm 的针头所产生的剪切力下，可能导致细胞质膜受损。通过移除塞子并采用部分或完全体积置换的方式将样品移入反应室，可避免此类损伤。本研究共分析了三种类型的线粒体制剂。样品制备方法详见 补充文件11,26,29,30。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞：人血小板
	<ol>
		<li>将含有血小板的冻存管插入 37 °C 水浴中，缓慢融化至仅剩少量冰晶。</li>
		<li>打开冻存管，缓慢逐滴加入 1 mL 预热培养基（DPBS + 10 mM EGTA，37 °C）。</li>
		<li>轻轻混匀血小板，转移至 50 mL 离心管中，加入预热培养基（DPBS + 10 mM EGTA，37 °C）至终体积 10 mL。在室温（RT）下，使用摆动转子以 1000 g 离心 10 分钟（加速度 6，刹车 2）。</li>
		<li>将血小板重悬于 0.25 mL DPBS + 10 mM EGTA（室温）中，通过部分体积置换加入反应室，使初始实验细胞浓度在 0.5 mL 室中为 157&#160;·&#160;106 至 210&#160;·&#160;106 x·mL-1，在 2.0 mL 室中为 164&#160;·&#160;106 至 220&#160;·&#160;106 x·mL-1（有关基本单位 x 的详细信息见31）。 
		注：一台 Oroboros 仪器在 A 和 B 位置分别装配 sV 和 cV 反应室，与另一台在 B 和 A 位置分别装配 sV 和 cV 反应室的 Oroboros&#160;仪器并行使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透化细胞：人成纤维细胞
	<ol>
		<li>通过部分体积置换将细胞加入 Oroboros&#160;反应室，名义细胞浓度为 0.75 · 106 x·mL-1&#160;（两种反应室均适用），并计算实际浓度（步骤 4.1.3）。 
		注：并行使用了多台不同的 Oroboros&#160;仪器，每台仪器分别装配 sV 或 cV 反应室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离线粒体：小鼠心脏
	<ol>
		<li>将 15 µL 线粒体悬液加入 5985 µL 线粒体呼吸介质（MiR05）中，得到线粒体蛋白储备浓度范围为 0.013–0.026 mg∙mL-1。</li>
		<li>通过完全体积置换将线粒体悬液加入 Oroboros&#160;反应室中。 
		注：一台 Oroboros&#160;仪器在 A 和 B 位置分别装配 sV 和 cV 反应室，与另一台在 B 和 A 位置分别装配 sV 和 cV 反应室的 Oroboros&#160;仪器并行使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg" /> 
图2通过部分体积置换添加细胞悬液。 (A)&#160;0.5 mL 反应室中的添加步骤V 以及（B2.0 mL 室 cV. (1) 带有呼吸介质体积的密闭室 V 并填充带塞毛细管 Vstc，用于测量仪器本底O2&#160;通量 JO2&#176;. (2塞子移除， Vstc 流入腔室，导致总体积 V'= V+Vstc. (3部分去除培养基 V出 = -VJ.i. 一个体积 V''= V'+V出 留在室中。4移液取体积子样本 VJ.i 将呼吸测定用储备细胞悬液加入腔室，终体积为 V# = V+Vstc 稀释后的细胞悬液。5) 带有填充塞的密闭腔室（死体积） Vstc用于测定体积特异性氧2&#160;通量 JV，O2&#160;在实验体积中 V此图已根据 图2A 细胞计数与HRR中的归一化41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
5. SUIT 实验方案
<ol>
	<li>使用 Hamilton 微量注射器将 补充表 1 中所列化学品的储备溶液滴加到腔室中，调整滴加体积，使 sV 和 cV 腔室中的实验浓度保持一致（参见图 6、图 8 和图 10 的图注）。</li>
	<li>选择实验方案 SUIT-003_D01832,33（本研究中用于血小板）。</li>
	<li>选择实验方案 SUIT-001_D0044,15,34,35 和 SUIT-002_D0074,15,35,36（本研究中用于成纤维细胞）。</li>
	<li>选择实验方案 SUIT-002_D0054,15,35,37（本研究中用于分离的线粒体）。</li>
</ol>
6. SUIT 数据分析
<ol>
	<li>在 DatLab 中设置标记，以定义所选图表的各个区段。</li>
	<li>在顶部菜单中选择通量/斜率，打开通量/斜率窗口。应用滴定体积校正，以校正 SUIT 方案中每次滴定对悬浮样品造成的稀释效应。</li>
	<li>从顶部菜单中选择标记，打开标记统计，显示经减去残余氧消耗（rox）进行基线校正后的标记数据点的中位数。</li>
	<li>使用电子表格软件，通过反向回归分析25,28，计算 sV 和 cV 腔室中成对结果之间的截距和斜率。</li>
	<li>使用软件 jamovi 2.3.1338，通过配对样本 t 检验比较 sV 和 cV 腔室中 rox&#160;状态（最低 O2&#160;通量）下的呼吸速率。 
	注意：由于 Oroboros&#160;仪器中的两个腔室在功能上相互独立（除温度和 DatLab 记录间隔外），每个&#160;腔室的测量可视为独立进行，类似于使用不同的&#160;仪器。最终结果可报告为多个腔室的中位数或平均值，并附上其变异性信息。</li>
</ol>

Exploring Chamber Volumes for Mitochondrial High-Resolution Respirometry

<ol><li>Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+respiratory+activity+in+attached+and+suspended+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts.</a> PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).</li>
<li>Schöpf, B., et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32198407/">OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation.</a> Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).</li>
<li>Meszaros, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predictive+value+of+graft+viability+and+bioenergetics+testing+towards+the+outcome+in+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation.</a> Transplant International. 37, 12380(2024).</li>
<li>Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).</li>
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<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14713113/">Oxygen Conformance of Cellular Respiration.</a> Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).</li>
<li>Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+redox+states+and+respiratory+control+in+mouse+and+beef+heart+mitochondria+at+steady-state+levels+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia.</a> J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
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</ol>

EL 是 Oroboros Instruments 的员工。EG 是 Oroboros Instruments 的创始人兼首席执行官。
在本项目中，Oroboros Instruments 使用了 LFGS。EÅF 和 EE 是位于瑞典隆德的 Abliva AB 公司的员工，该公司与 Oroboros Instruments 持有商业协议。
LR 声明不存在利益冲突。

呼吸测定实验中可获取的样品量通常有限，例如在活检组织、原代细胞或细胞数量较少的慢速生长细胞培养物的研究中1此外，由于线粒体损伤，呼吸活性受到抑制11 或在研究呼吸容量较低的线粒体通路时，例如脂肪酸氧化12. 在这些情况下，较低的呼吸测量室体积有助于提高 O₂ 流量检测的分辨率2&#160;通量。然而，仪器的背景氧通量2&#160;在较低的腔室体积下，通量会增加，若未能可靠测量并针对氧浓度进行适当校正，则可能引发误差2&#160;浓度。仪器氧2&#160;背景测试与背景校正对于小体积实验腔室尤为重要。理论值（J&#176;R1）和实验（J&#176;空气) O2&#160;通量为使用4 e的极谱法测量的准确性提供了证据-/2&#160;在&#160;的&#160;阴极&#160;POS 反应。两者之间的差异 J&#176;R1 以及 J&#176;空气 为1.64 &#177; 0.43 和 0.22 &#177; 0.31 pmol&#8729;s-1&#8729;mL-1 在 sV 和 cV 分别表明测量的精确度处于2.0-mL chamber的检测限范围内&#177;1 pmol&#8729;s-1&#8729;毫升-1)28. 在 2.0-mL 和 0.5-mL 实验 chamber 中使用相同类型的极谱氧传感器时，单位体积的背景 O₂ 通量2&#160;通量随腔室体积成反比增加4倍，两种腔室体积下的变异程度几乎相同，标准差分别为0.5和0.3 pmol&#8729;s-1&#8729;mL-1 用于 J&#176;空气 和 0.9 与 0.8 pmol&#8729;s-1&#8729;毫升-1 用于 J&#176;50 在 sV 和 cV 室，分别（Table 2）。在最低呼吸活性（小体积 chamber 的设计目标）条件下，即使微小的背景效应也变得显著（补充&#160;Table 3; 补充图 2）。因此，对仪器背景氧通量进行常规评估是必要的2&#160;通量图1) 是进行适当校正所必需的28.
为了维持体系的均一性并保证稳定的氧信号，需要对介质进行高速且持续的搅拌。2.0 mL 搅拌腔的搅拌速度设定为 750 转/分钟（rpm），但 0.5 mL 搅拌腔的最佳搅拌速度尚不明确。由于玻璃腔室与搅拌子在几何结构上的差异（表 2），需对 0.5 mL 腔室的最佳搅拌速度进行独立评估。氧传感器对 550 rpm 至 950 rpm 之间的搅拌速度变化有响应，在 750 rpm 时，O2&#160;信号 R1 仅有微小偏离，且不受腔室体积影响。在相同搅拌速度下，对 Chamber sV 计算得到的指数时间常数 τ 与 2.0 mL 腔室报道的 τ 值一致13。这些结果表明，两种腔室几何结构下的搅拌效率相当，因此 2.0 mL 腔室默认的 750 rpm 搅拌速度可直接应用于 0.5 mL 腔室。在“开放”和“封闭”两种腔室构型下，0.5 mL 腔室均表现出更高的信噪比，提示其具有更高的检测精度，这是 0.5 mL 腔室的一项优势（图 5），尽管个体间 POS 的差异影响尚不能排除。由于将搅拌速度从 750 rpm 降低至 550 rpm 时噪声并未增加，因此在 0.5 mL 腔室中将搅拌速度降至 550 rpm 可能有助于减小剪切应力，同时不损害信噪比。
几乎相同的O₂通量2&#160;在应用适当的背景校正后，于三种实验模型中分别在 0.5-mL 和 2.0-mL 检测室中测定了耗氧速率。使用少量血小板所得的结果 &#181;直径为 m42，活细胞和透化纤维细胞以及分离的线粒体结果表明，在0.5-mL和2.0-mL chamber中可获得一致的呼吸速率&#160;多种细胞类型和线粒体制备样品中均适用。然而，本研究尚未测试透化肌纤维。准确测量 rox 需要控制氧水平40 且具有高仪器分辨率1. 体积特异性氧2&#160;通量 rox 可能低至检测限。当实验中使用较少的细胞数量或通常较少的样品量时，无需重新氧合。然而，如有必要，建议在氧通量较低的呼吸状态下进行重新氧合2&#160;通量，以避免氧气的快速下降2&#160;稳定 O₂ 所需时间段内的浓度2&#160;通量。氧气2&#160;复氧后的通量在0.5 mL chamber中恢复所需时间更长。
作为质量控制的一部分，在部分换液过程中对悬浮液中样品的稀释需特别注意。在完全插入的塞子被取出后，总体积 V&#39;&#160;呼吸介质在腔室中的体积由实验体积决定 V 以及封口毛细管体积 Vstc (Table 2）。因此，储备体积 VJ. i 在实际体积中被稀释 V'，大于 V，导致稀释倍数 V/V' 0.5/0.54 = 0.926 和 2.0/2.07 = 0.966，分别对应 0.5 mL 和 2.0 mL 气室（图2）。在血小板实验中，使用了 Chamber 的原型塞子 sV 毛细管死体积为0.05 mL，对应的稀释因子为0.909。
在相同样品浓度（单位体积内的量）下，0.5-mL 比 2.0-mL 气室所需的活细胞、透化细胞和分离线粒体的用量少近四倍，经细胞数量或蛋白质量归一化后的呼吸性 O2&#160;消耗量测定结果具有可比性。这表明 Chamber sV 是样品量有限的研究中一种有价值的工具。另一方面，在 Chamber sV 中使用相同量的样品可提高体积特异性 O2&#160;通量，从而在呼吸活性较低时降低测量的不确定性。
本研究中的氧环境仅限于从空气饱和至30 µM的O2&#160;范围。在该范围之外的氧水平下的适用性尚需进一步评估，以研究组织常氧或低氧状态下的线粒体功能43，以及高氧条件下的透化组织9。Oroboros NADH和Q-&#160;模块的多种多传感器配置，以及pH、NO和TPP+-电极10,44，无法适配于sV腔室，仍需使用2.0-mL腔室。

研究线粒体呼吸途径对于揭示各种疾病、衰老或应激反应背后的代谢机制至关重要，从而为治疗干预提供潜在靶点，并提升诊断能力1,2,3。高分辨率呼吸测定法（HRR）能够对多种样本类型和制备条件下氧化磷酸化（OXPHOS）中的线粒体通路控制和偶联控制进行详细分析4。实验腔室的体积是呼吸测定仪器的一项基本设计特征。Oroboros仪器先前确定的腔室体积为2.0 mL。该体积经过优化，可确保仪器背景氧（O2&#160;）通量较低，并保证搅拌介质的均一性。这些是准确测量低氧条件和高氧条件下呼吸速率的关键质量标准，分别适用于线粒体氧动力学和透化肌纤维实验5,6,7,8,9。此外，多种多传感器插入装置10也需要占用2.0 mL腔室的空间（表 1）。
在本研究中，我们探讨了将高分辨率呼吸测定法（HRR）的腔室体积从2.0 mL减少至0.5 mL的可行性。在较小的腔室内进行呼吸测定实验时，是否可以使用较少的细胞数量或组织量，同时不降低检测的准确性？明确这一问题对于研究人体组织和液体活检样本、原代细胞以及生长缓慢的细胞培养物具有重要意义1同样，对于研究线粒体功能缺陷且呼吸活性较低的样品，减小反应室体积可能具有优势。11 以及固有容量较低的线粒体通路，例如大脑中的脂肪酸氧化12然而，由于O的伪影随腔室尺寸减小而 disproportionately 增加，分辨率可能会降低2&#160;倒扩散与不准确的体积校准13,14因此，我们分析了Oroboros仪器的性能表现&#160;使用小体积室（sV) 校准至最小实验体积为 0.5 mL，相较于传统体积腔室（cV) 校准至2.0 mL。特别地，我们分析了仪器背景O2&#160;流速与最佳搅拌速度。
底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案用于评估氧化磷酸化（OXPHOS）分析中的呼吸速率和呼吸状态。SUIT方案在每次呼吸测定实验中包含14至20次滴定，涉及的氧通量（O2&#160;）范围从每秒每毫升几皮摩尔（pmol∙s-1∙mL-1）到数百皮摩尔（pmol∙s-1∙mL-1）不等。&#160;偶联控制状态包括漏呼吸率 L，即呼吸中以耗散形式存在的组分，无法用于将腺苷-5'-二磷酸（ADP）磷酸化为腺苷-5'-三磷酸（ATP），其来源包括质子漏、质子滑移、阳离子循环和电子漏。OXPHOS容量 P 指在存在ADP的条件下，电子传递（以O2&#160;消耗（氧化）来测量）与ATP合成（磷酸化）相偶联时线粒体的呼吸能力。解偶联状态下的电子传递容量 E 通过在存在线粒体底物的条件下滴加质子载体（protonophore）进行定量测定15。残余氧消耗 rox 则在加入复合体I和复合体III抑制剂鱼藤酮（rotenone）和抗霉素A（antimycin A）后测定。
我们在sV和cV室中测量了细胞和线粒体分离物的呼吸作用。血小板是巨核细胞的无核细胞质碎片，是易于获取的人类线粒体来源。因此，血小板被用作具有完整质膜的活细胞（或细胞颗粒）的模型。血细胞的呼吸作用可作为系统性线粒体疾病的生物标志物，并与代谢活跃器官的生物能量健康状况相关16,17,18,19，尽管这些发现尚不能普遍化20,21,22。人成纤维细胞被选为线粒体功能障碍的细胞模型1,23,24,25。质膜的完整性对细胞存活至关重要，但其选择性通透化可允许细胞质与周围介质之间的分子交换。因此，化学法通透化质膜的成纤维细胞被作为通透化细胞的示例进行研究，而分离的线粒体则用于评估线粒体功能，并可用于分离不同的线粒体亚群26,27。

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td><td>软件</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Germany</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素 100倍浓缩液</td><td>Biosera, France</td><td>XC-A4110</td><td>警告 H317 可能引起过敏性皮肤反应</td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A8674</td><td>警告 H300&amp;nbsp; 吞咽致命，H400 短期（急性）对水生环境有害&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>&amp;nbsp;A 2383</td><td></td></tr><tr><td>无脂肪酸牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A 6003</td><td>bovine serum albumin</td></tr><tr><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C2759</td><td>羰基氰化物间氯苯腙 警告 H301 + H311 + H331 吞咽、皮肤接触或吸入有毒</td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>细胞色素 c</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Version 7.4</td><td>用于数据采集与分析的软件</td></tr><tr><td>DatLab&amp;nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Version 8.1</td><td>用于数据采集与分析的软件</td></tr><tr><td>DC 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad, USA</td><td>5000112</td><td>蛋白检测试剂盒；警告 H314 可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D5628</td><td>警告 H301 吞咽有毒</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D 0632</td><td>警告 H318 可引起严重眼睛损伤</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech, Germany</td><td>P04-05551</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D2650</td><td>二甲基亚砜</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience, Switzerland</td><td>LONBE17-512F</td><td>无钙 Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>A5256701</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>&amp;nbsp;G7528</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>甘油磷酸</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>HM3S</td><td>离心机</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&amp;nbsp;</td><td>Andreas Hettich GmbH &amp; Co. KG, Germany</td><td>1701</td><td>离心机</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Honeywell Fluka, Austria</td><td>56750</td><td>警告 H302 吞咽有害，H314 可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤，H360D 可能损害未出生婴儿</td></tr><tr><td>jamovi&amp;nbsp;</td><td>The jamovi project</td><td>Version 2.3.13</td><td>软件</td></tr><tr><td>K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;-MES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep 管&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>Z642843-300EA</td><td>带聚乙烯屏障的离心管</td></tr><tr><td>苹果酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M1000</td><td>警告 H319 可引起严重眼睛刺激。</td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Scharlau, Spain</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-试剂盒</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>60101-01</td><td>线粒体呼吸介质</td></tr><tr><td>Mixer&amp;nbsp;</td><td>Swelab Instruments, Sweden</td><td>440S</td><td>摇床</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 冷冻容器</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>5100-0001</td><td>冷冻容器</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td></td><td>NextGen-O2k 和 O2k 统称为 &amp;lsquo;Oroboros&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Oroboros Chamber cV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>23100-01</td><td>经典体积腔室</td></tr><tr><td>Oroboros Chamber sV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>33100-01</td><td>小体积腔室</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-模块</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>11100-03</td><td>滴定-注射微泵</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Zero 粉末</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>26600-02</td><td>&amp;nbsp;Na-连二亚硫酸盐 警告 H251 自热：可能起火，H302 吞咽有害，H319 可引起严重眼睛刺激</td></tr><tr><td>辛酰肉碱</td><td>Biotrend - APExBIO Technology, Germany</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P2256</td><td>警告 H317 可能引起过敏性皮肤反应</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R8875</td><td>警告 H300 吞咽致命</td></tr><tr><td>皮肤成纤维细胞系&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;ATCC, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2002</td><td>警告 H300 + H310 + H330 吞咽、皮肤接触或吸入致命</td></tr><tr><td>枯草杆菌蛋白酶 A</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P 5380</td><td>警告 H318 - 可引起严重眼睛损伤，H334 - 吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难</td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Swelab Alfa 血细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>Boule Diagnostics AB, Sweden</td><td>1420041</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>Tecan, Switzerland</td><td></td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T3134</td><td>N,N,N',N'-四甲基对苯二胺二盐酸盐 警告 H315 可引起皮肤刺激，H319 可引起严重眼睛刺激</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T4799</td><td>警告 H334 吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

研究呼吸通量对于理解代谢过程之间复杂的相互作用至关重要。对于样本量有限且呼吸速率较低的细胞和组织研究，采用较小的实验体积可能更具优势。我们考察了在使用Oroboros进行高分辨率呼吸测定、样品浓度相同的情况下，0.5 mL反应室是否能获得与2.0 mL反应室一致的结果。背景氧2&#160;在空气饱和条件下，0.5 mL chamber 中的通量比 2.0 mL chamber 高 4 倍，但结果可重复，允许进行准确的背景校正。0.5 mL chamber 的最佳搅拌速度为每分钟 550 至 750 转（rpm）。在 0.5 mL 和 2.0 mL chamber 中平行测定了活细胞、透化细胞和分离线粒体的呼吸通量。&#160;使用底物-解偶联剂-抑制剂滴定法，进行14至20次滴定。O2&#160;不同条件下的通量&#160;在检测限范围内，腔室类型相同。0.5 mL&#160;腔室所需样本量比2.0 mL腔室少近四倍，对于样本量有限或呼吸能力较低的研究具有显著优势。

本文表明，如果进行了适当的仪器O2&#160;背景校正，0.5 mL高分辨率呼吸测量室所获得的结果与2.0 mL呼吸室的结果具有一致性。该方法所需样品量更少，对于样品来源有限或呼吸活性较低的研究具有优势。

研究呼吸通量对于理解代谢过程之间的复杂相互作用至关重要。对细胞和组织进行的研究……

本研究旨在探讨校准至0.5毫升的小体积腔室是否可用于呼吸测定实验，且不会影响Oroboros平台中传统2毫升体积所获得的准确性。我们开发了小体积实验腔室，并通过高分辨率呼吸测定法结合严格的质控（采用精确的OXPHOS分析）对其进行评估，这为后续发展和新创新铺平了道路，具体包括：第一，12腔O2k呼吸仪；第二，用于复杂OXPHOS分析方案中物质自动滴定的机器人系统。这些应用将在进一步拓展线粒体分析、线粒体疾病诊断以及药物研发评估方面发挥关键作用，不仅关注药物对线粒体功能的益处，也关注其对线粒体功能的非靶向性干扰作用。当我的团队在30多年前开发高分辨率呼吸测定技术时，当时的主流观念认为线粒体就是线粒体，也许肌肉和肝脏线粒体之间存在差异，但也就仅此而已。在这些范式之外，几乎无人真正关注线粒体。通过我们为高分辨率呼吸测定所开发的实验方案，我们揭示了线粒体功能的巨大多样性。这使我们能够以全新的视角评估不同细胞类型、组织和物种中的线粒体呼吸控制。30年前，仅有大约10篇文献认识到这一点；而如今，采用我们仪器并使用这些方案的研究已超过1,500项。与传统的两毫升样品室相比，小体积样品室所需的样品量仅为其四分之一。对于呼吸速率较低的样品，可使用相同量的样品以增加单位体积的氧通量，从而降低测量的不确定性。我们在Oroboros研发实验室的工作重点是将仪器开发与学术研究相结合。我们通过多传感器分析来评估线粒体呼吸功能和生物发生特征，即测量呼吸作用、氧化还原电位、膜电位、钙离子摄取、过氧化氢生成以及多种其他参数，从而更深入地了解线粒体的生物发生特征及其功能与功能障碍。[旁白] 首先，将小体积（SV） chamber 安装到 Oroboros 仪器上。然后打开 Oroboros 电源，点击“连接”以将 Oroboros 与 DatLab 软件连接。彻底干燥 chamber 后，使用移液器向 SV chamber 中加入 0.54 毫升水。随后启动搅拌器。在关闭 chamber 前，润湿密封塞的 O 型圈，同时保持毛细管部分干燥。松开体积校准环，然后将密封塞向下插入，直至液体充满密封塞毛细管，并在上端毛细管接口处形成弯月面。拧紧体积校准环以固定其位置，确保后续插入时校准体积的一致性。开始时，用呼吸介质 MiR05 填充 chamber。启动 DatLab 软件，选择适用于仪器本底测试的适当协议。将搅拌转速设为 550 RPM，chamber 体积设为 0.5 毫升，数据记录间隔设为 2 秒，实验温度设为 37 摄氏度。运行搅拌器测试和空气校准。按住 Shift 键并移动光标，在氧浓度图上设置 R1 标记。偶尔进行零氧校准。在空气校准过程中，通过将 O2-Zero Powder 溶解于 50 毫摩尔磷酸缓冲液中，配制新鲜的 2.5 毫摩尔钠连二亚硫酸盐储备液（适用于 SV）。完成空气校准后，关闭 chamber。监测氧信号约 60 至 120 分钟，使氧浓度从空气饱和状态下降至约 150 微摩尔。在氧斜率负相图上设置四个标记，分别标记为 J01 至 J04。可选地，使用 Hamilton 注射器滴加钠连二亚硫酸盐溶液，将氧浓度调节至 100 微摩尔，并设置标记 J05。在 DatLab 中计算仪器氧本底斜率时，选择“Flux Slope”。接着打开氧本底校正窗口，选择“Active file”作为氧本底数据来源。检查所有 J0 标记是否均用于线性回归计算，然后点击“Apply”进行氧本底校正。开始时，用去离子水清洗 Oroboros chamber，并向 chamber 中加入新鲜 MiR05 介质。完成仪器本底测试后，在 DatLab 中新建一个标签页，选择适用于人血小板实验的 SUIT-003 协议。通过 Protocol 侧边栏中显示的 DatLab 协议概览，选择化学储备液，然后根据所用化学品选择相应的 Hamilton 注射器。按照 SUIT 协议顺序，将注射器按标签顺序放置于注射器架上。对于部分体积更换，计算等效体积 V in，该体积应等于从开放 chamber 中实际移除的体积 V out，并计入毛细管死体积。随后取出完全插入的密封塞并置于架上。根据细胞类型和储备细胞悬液的浓度，从 chamber 中移除计算所得的 V out 体积的 MiR05。然后，用移液器向 chamber 中加入等体积、已知细胞浓度的储备细胞悬液。相比之下，对于完全体积更换，则需将 chamber 中的全部培养基虹吸移除。向 SV chamber 中加入 0.54 毫升分离的心肌线粒体储备液。关闭 chamber，并从密封塞接口处虹吸移除多余的样品溶液。开始底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）协议时，在 DatLab 中打开“Event”窗口以可视化滴定体积。使用 Hamilton 微量注射器将化学储备液滴加至 chamber 中，然后在 DatLab 中设置事件。滴定后等待通量稳定。进行数据分析时，在图谱中具有代表性且稳定的区段上设置标记。在空气饱和条件下，0.5 毫升 chamber 的仪器本底氧通量比 2.0 毫升 chamber 高出 3.9 倍，与理论预期的体积特异性本底氧通量四倍差异一致。两种 chamber 体积下的仪器本底通量变异性几乎相同。在应用适当的本底校正后，活血小板、透化成纤维细胞和分离线粒体的呼吸速率在两种 chamber 类型中均表现出高度相关性。再氧合后，2 毫升 chamber 中的氧通量比 0.5 毫升 chamber 更快达到稳定。Complex III 抑制后的残余氧消耗在两种 chamber 之间保持一致，符合仪器检测限水平。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小容量腔室中的高分辨率呼吸测量

高分辨率呼吸测定法用于测定线粒体的耗氧量。该方法是一种简单直接的技术，可用于测定线粒体呼吸链复合物（I-IV）的呼吸速率、线粒体电子传递系统最大容量以及线粒体外膜的完整性。...

高分辨率呼吸测定法评估透化细胞与完整细胞中的线粒体功能

在此实验中，从一只麻醉的猪体内取出股四头肌组织样本，并通过差速离心法分离线粒体。随后，采用高分辨率呼吸测定法测定线粒体呼吸链复合物I、II和IV的呼吸速率。...

通过差速离心法从骨骼肌中分离完整线粒体用于高分辨率呼吸测定

本实验方案的目的是利用高分辨率呼吸测定法，在天然化合物存在的条件下，测量葡萄糖介导的线粒体呼吸变化对完整832/13...

高分辨率呼吸测定法测量天然化合物存在下完整β细胞的线粒体功能

本方案描述了量热呼吸法，即对热量耗散和呼吸作用进行直接且同步的测量，该方法可无创地评估能量代谢。通过监测细胞总能量流，该技术可用于评估有氧和无氧途径在能量利用中的各自贡献。...

量热-呼吸联合测定法：一种研究细胞能量代谢的强大非侵入性方法

本方案介绍了简化型全身体积描记仪的构建与使用方法，用于无创监测细菌性呼吸道疾病的进展。...

简化型全身体积描记法用于表征呼吸系统类鼻疽期间的肺功能

利用高分辨率呼吸测量仪评估氧化磷酸化已成为线粒体功能及细胞能量代谢分析的重要组成部分。本文介绍了使用腔室型和微孔板型高分辨率呼吸测量仪分析细胞能量代谢的实验方案，并讨论了每种设备的主要优势。...

使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学

本方案描述了微呼吸测定系统的建立与运行方法，该系统可用于研究珊瑚全共生体的生理特征。...

利用新型微呼吸测定工具对珊瑚全生物体进行生理表征

通过高分辨率呼吸测定法分析精子线粒体功能，可在封闭式反应室系统中测量自由运动精子的耗氧量。该技术可用于测定人类精子的呼吸作用，从而提供有关精子线粒体特征及其完整性的信息。...

高分辨率呼吸测定法评估人类精子线粒体功能

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

在本视频文章中，我们介绍了一种构建具有稳定且可控几何形状的气味梯度的新方法。我们简要说明了如何利用这些梯度来筛查嗅觉缺陷（完全性与部分性嗅觉丧失），并研究趋化行为中更为细微的特征。...

高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

了解高分辨率呼吸测量技术在小容量腔室中的应用方法，使用0.5毫升腔室进行线粒体功能分析。该方法仅需传统样本量的四分之一，适用于线粒体疾病诊断和药物开发研究。

小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

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