小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

本研究旨在探讨校准至0.5毫升的小体积腔室是否可用于呼吸测定实验，且不会影响Oroboros平台中传统2毫升体积所获得的准确性。

我们开发了小体积实验腔室，并通过高分辨率呼吸测定法结合严格的质控（采用精确的OXPHOS分析）对其进行评估，这为后续发展和新创新铺平了道路，具体包括：第一，12腔O2k呼吸仪；第二，用于复杂OXPHOS分析方案中物质自动滴定的机器人系统。这些应用将在进一步拓展线粒体分析、线粒体疾病诊断以及药物研发评估方面发挥关键作用，不仅关注药物对线粒体功能的益处，也关注其对线粒体功能的非靶向性干扰作用。当我的团队在30多年前开发高分辨率呼吸测定技术时，当时的主流观念认为线粒体就是线粒体，也许肌肉和肝脏线粒体之间存在差异，但也就仅此而已。在这些范式之外，几乎无人真正关注线粒体。通过我们为高分辨率呼吸测定所开发的实验方案，我们揭示了线粒体功能的巨大多样性。这使我们能够以全新的视角评估不同细胞类型、组织和物种中的线粒体呼吸控制。30年前，仅有大约10篇文献认识到这一点；而如今，采用我们仪器并使用这些方案的研究已超过1,500项。

与传统的两毫升样品室相比，小体积样品室所需的样品量仅为其四分之一。对于呼吸速率较低的样品，可使用相同量的样品以增加单位体积的氧通量，从而降低测量的不确定性。

我们在Oroboros研发实验室的工作重点是将仪器开发与学术研究相结合。我们通过多传感器分析来评估线粒体呼吸功能和生物发生特征，即测量呼吸作用、氧化还原电位、膜电位、钙离子摄取、过氧化氢生成以及多种其他参数，从而更深入地了解线粒体的生物发生特征及其功能与功能障碍。

[旁白] 首先，将小体积（SV） chamber 安装到 Oroboros 仪器上。然后打开 Oroboros 电源，点击“连接”以将 Oroboros 与 DatLab 软件连接。彻底干燥 chamber 后，使用移液器向 SV chamber 中加入 0.54 毫升水。随后启动搅拌器。在关闭 chamber 前，润湿密封塞的 O 型圈，同时保持毛细管部分干燥。松开体积校准环，然后将密封塞向下插入，直至液体充满密封塞毛细管，并在上端毛细管接口处形成弯月面。拧紧体积校准环以固定其位置，确保后续插入时校准体积的一致性。开始时，用呼吸介质 MiR05 填充 chamber。启动 DatLab 软件，选择适用于仪器本底测试的适当协议。将搅拌转速设为 550 RPM，chamber 体积设为 0.5 毫升，数据记录间隔设为 2 秒，实验温度设为 37 摄氏度。运行搅拌器测试和空气校准。按住 Shift 键并移动光标，在氧浓度图上设置 R1 标记。偶尔进行零氧校准。在空气校准过程中，通过将 O2-Zero Powder 溶解于 50 毫摩尔磷酸缓冲液中，配制新鲜的 2.5 毫摩尔钠连二亚硫酸盐储备液（适用于 SV）。完成空气校准后，关闭 chamber。监测氧信号约 60 至 120 分钟，使氧浓度从空气饱和状态下降至约 150 微摩尔。在氧斜率负相图上设置四个标记，分别标记为 J01 至 J04。可选地，使用 Hamilton 注射器滴加钠连二亚硫酸盐溶液，将氧浓度调节至 100 微摩尔，并设置标记 J05。在 DatLab 中计算仪器氧本底斜率时，选择“Flux Slope”。接着打开氧本底校正窗口，选择“Active file”作为氧本底数据来源。检查所有 J0 标记是否均用于线性回归计算，然后点击“Apply”进行氧本底校正。开始时，用去离子水清洗 Oroboros chamber，并向 chamber 中加入新鲜 MiR05 介质。完成仪器本底测试后，在 DatLab 中新建一个标签页，选择适用于人血小板实验的 SUIT-003 协议。通过 Protocol 侧边栏中显示的 DatLab 协议概览，选择化学储备液，然后根据所用化学品选择相应的 Hamilton 注射器。按照 SUIT 协议顺序，将注射器按标签顺序放置于注射器架上。对于部分体积更换，计算等效体积 V in，该体积应等于从开放 chamber 中实际移除的体积 V out，并计入毛细管死体积。随后取出完全插入的密封塞并置于架上。根据细胞类型和储备细胞悬液的浓度，从 chamber 中移除计算所得的 V out 体积的 MiR05。然后，用移液器向 chamber 中加入等体积、已知细胞浓度的储备细胞悬液。相比之下，对于完全体积更换，则需将 chamber 中的全部培养基虹吸移除。向 SV chamber 中加入 0.54 毫升分离的心肌线粒体储备液。关闭 chamber，并从密封塞接口处虹吸移除多余的样品溶液。开始底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）协议时，在 DatLab 中打开“Event”窗口以可视化滴定体积。使用 Hamilton 微量注射器将化学储备液滴加至 chamber 中，然后在 DatLab 中设置事件。滴定后等待通量稳定。进行数据分析时，在图谱中具有代表性且稳定的区段上设置标记。在空气饱和条件下，0.5 毫升 chamber 的仪器本底氧通量比 2.0 毫升 chamber 高出 3.9 倍，与理论预期的体积特异性本底氧通量四倍差异一致。两种 chamber 体积下的仪器本底通量变异性几乎相同。在应用适当的本底校正后，活血小板、透化成纤维细胞和分离线粒体的呼吸速率在两种 chamber 类型中均表现出高度相关性。再氧合后，2 毫升 chamber 中的氧通量比 0.5 毫升 chamber 更快达到稳定。Complex III 抑制后的残余氧消耗在两种 chamber 之间保持一致，符合仪器检测限水平。