成年斑马鱼的优化静脉注射

我们的研究利用斑马鱼模型来研究人类血液疾病，重点是确定新的生物标志物、治疗靶点和白血病等疾病的治疗方法。通过利用斑马鱼的独特优势，我们旨在探索血液病的分子机制，并开发创新的治疗策略以改善患者的预后。由于成年斑马鱼体积小且脉管系统复杂，因此静脉注射具有挑战性。

我们开发了一种优化的静脉注射方法，用于精确有效地将物质或细胞输送到成年斑马鱼体内。与心内和眼眶后注射相比，我们在这里介绍的 IV 方法导致更好的鱼存活率和更好的细胞植入。这种方法使成年斑马鱼更适合用于非学期研究。

改进的 IV 技术克服了新模型的一些限制，提高了疾病模型和药物筛选的准确性，有助于推进新疗法。首先，将安乐死的 mpo:EGFP 转基因斑马鱼放在解剖台上。解剖斑马鱼以分离肾骨髓。

然后将肾骨髓转移到含有细胞悬浮培养基的 1.5 ml 微量离心管中。移液悬浮液以解聚肾骨髓细胞。通过 40 微米尼龙细胞过滤器过滤细胞悬液。

然后将细胞以 500G 离心 8 分钟，弃去上清液，然后将沉淀重新悬浮于 500 μL 细胞悬液中。使用自动细胞计数仪对 10 μL 等分试样的细胞进行计数。用 75% 乙醇彻底清洗 Hamilton 注射器 3 到 4 次。

然后用超纯水冲洗注射器 3 到 4 次，以确保去除所有乙醇残留物。对斑马鱼进行麻醉后，通过运动减少和反射反应丧失来确认麻醉深度。将鱼的背侧朝上，头部向左放在干净的湿纸巾上，以稳定注射。

牢牢抓住 Hamilton 注射器，将针头与尾静脉成大约 45 度角。对于 Casper 斑马鱼，通过半透明身体瞄准容器的可见部分。轻轻地将针头插入容器中，并施用从 mpo:EGFP 转基因斑马鱼中分离的 2 微升全肾骨髓细胞。

注射后，用棉签轻轻按压注射部位 10 秒以控制出血。在显微镜下观察注射的斑马鱼，以确认血管内的 GFP 信号。让注射的斑马鱼在新鲜消毒的鱼水中恢复 10 分钟。

然后将鱼转移到静态水箱中。静脉注射方法的成功率最高，43 条鱼中有 41 条鱼可见 GFP 信号。而眼眶后方法在 37 条鱼中只有 3 条检测到 GFP，而心内方法显示 40 条鱼中有 11 条成功。

静脉注射方法导致注射鱼的存活率更高，尤其是与眼眶后和心内方法相比，细胞剂量较高。早在移植后第 3 天即可在静脉注射鱼中检测到 GFP 信号，而眼眶后和心内方法显示 GFP 信号出现延迟。到第 17 天，静脉注射的鱼在肾中显示出最突出的 GFP 信号。

肾骨髓流式细胞术显示，静脉注射的鱼中约有 18% 的 GFP 阳性细胞，是 5 个细胞的 10 倍，与供体肾骨髓中的 GFP 水平对齐。相比之下，心内和眼眶后方法分别显示 5% 和 2% 的 GFP 阳性细胞。