Name: 使用质子核磁共振波谱定量土壤中基于聚己二酸对苯二酸丁二醇酯的微塑料和纳米塑料 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T12:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 了解如何使用质子核磁共振波谱技术定量检测土壤中的PBAT微塑料和纳米塑料。该方法支持大规模环境样本的并行处理，为评估可生物降解塑料的环境降解过程提供可靠的量化分析工具。

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感谢美国农业部国家粮食与农业研究所（USDA-NIFA）通过资助编号2020-67019-31167向SMS提供本项目资金，同时感谢田纳西大学战略规划研究计划（SPRINT）为DGH和SMS提供的内部资助。资助方在研究设计、数据收集、分析、解释、报告撰写以及决定提交文章发表等过程中均未发挥任何作用。

1. 土壤的采集与制备
注意：采样和处理设备不应含有聚合物PBAT或其组分，以避免样品污染。其他聚合物材料不一定干扰土壤中PBAT的定量。例如，聚乙烯和聚丙烯在氯仿中不会产生光谱峰 1H-NMR 中干扰 PBAT 定量的因素34，但聚对苯二甲酸乙二醇酯因其对苯二甲酸基团，很可能产生干扰35，其他聚酯类材料亦可如此。参考文献如 Brandolini 和 Hills34 可用于确定 1测定各种聚合物的氢核磁共振（H-NMR）谱图，并筛查与用于定量分析的PBAT特征峰（如下所述）重叠的峰。
<ol>
	<li>每个样品至少采集相当于100 g干重的土壤。根据预期的塑料含量确定土壤样品量，以采集具有代表性的样品；如有需要，可对土壤进行均质化处理后再取亚样品36。 
	注意：土壤系统本身具有高度异质性37，其中污染物（例如微塑料）的分布也具有异质性38。此外，用于测定污染物浓度的方法本身也存在变异性39。因此，建议设计包含重复样品的采样方案或实验方案，以评估不确定性，并根据塑料浓度采集具有代表性的样品体积40。已有文献记录土壤中微塑料浓度范围从接近零到每千克土壤1 × 107个颗粒不等，大多数场地的微塑料含量低于每千克土壤10,000个颗粒41。理论上，当微塑料浓度为每平方米10个颗粒时，代表性基本体积可能高达23 m2；而当微塑料浓度为每平方米10,000个颗粒时，该体积可低至0.02 m236。
	<ol>
		<li>为在最小化待处理土壤量的同时扩大野外采样的有效面积，可从较大区域（例如1 m2）采集土壤，然后采用四分法对样品进行均质化和缩分（例如缩至500 g土壤）36。</li>
		<li>四分法操作步骤：将大面积采集的土壤堆放在防水布或其他表面上，使用铲子充分混合后将其均分为四等份，保留其中一份，弃去其余三份。重复此过程，直至样品缩减至所需大小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将土壤通过2 mm孔径的筛网进行筛分。在处理不同土壤样品之间，必须彻底清洁筛网和接样盘。</li>
	<li>将土壤风干，然后储存于密封的样品袋中。干燥后的土壤可在PBAT提取前以此状态长期保存。</li>
</ol>
2. 从土壤中提取PBAT
警告：氯仿具有挥发性和毒性。应将其储存在暗处的棕色玻璃瓶中，并远离氧化剂。操作时需佩戴合适的手套、眼部防护装备和防护服。仅可在通风橱中操作氯仿。甲醇易燃、具有挥发性和毒性。应将甲醇储存在防火柜中。操作甲醇时需佩戴合适的手套、眼部防护装备和防护服。仅可在通风橱中操作甲醇。玻璃器皿可能破裂并造成伤害。操作玻璃器皿时应佩戴眼部防护装备。避免用手直接接触破碎的玻璃。应使用防割手套、镊子、扫帚或其他工具清理破碎的玻璃。
注意：氯仿与大多数塑料或金属不相容。请确保所有材料均兼容（例如玻璃或聚四氟乙烯，PTFE 塑料）。
<ol>
	<li>在通风橱中，配制 100 mL 体积比为 90:10 的氯仿（三氯甲烷；CHCl₃）与甲醇（CH₃OH）混合溶液3）和甲醇（CH3每个待提取样品加入 10 mL 氯仿-甲醇（9:1, v/v）。例如，提取 5 个样品时，将 450 mL 氯仿与 50 mL 甲醇混合。</li>
	<li>将100 g干土、100 mL氯仿-甲醇溶液和20颗玻璃珠加入玻璃提取瓶中。用聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖子将提取瓶密封严密，确保溶剂蒸气无法逸出。 
	注意：PBAT 在氯仿中具有高溶解性；使用氯仿-甲醇混合溶剂是因为甲醇可与溶质形成氢键，与土壤矿物和有机成分竞争，从而提高 PBAT 从土壤中的回收率33.</li>
	<li>使用摇床以200 rpm的速度振荡提取瓶8小时。振荡结束后，静置提取瓶中的土壤至少4小时，使其充分沉降。</li>
	<li>从土壤中分离提取物。在通风橱中，打开提取瓶盖，用移液器将液体通过孔径为 11 &#181;m 转移到已标记的洁净玻璃瓶中。记录从提取瓶中回收的溶剂体积。避免将土壤固体随提取液一同转移；如有需要，可残留少量溶剂（几毫升）在瓶中。 
	注意：滤纸用于去除溶剂溶液中的大块有机物。</li>
	<li>将提取物置于通风橱中干燥，直至溶剂完全蒸发，可能需要长达24小时。同时将土壤也在通风橱中干燥。待土壤完全干燥后，将其丢弃。</li>
	<li>提取物干燥后，盖紧每个样品瓶，于阴凉、避光、干燥处保存，直至使用。</li>
</ol>
3. 核磁共振谱图的采集
警告：氘代氯仿具有与上述质子化氯仿相同的风险，需采取相同的预防措施。
<ol>
	<li>加入内标物42 向样品中加入。使用天平称取1.00 mg的1,4-二甲氧基苯（DMB；C6H14将 O) 加入含有干燥提取物的每个样品瓶中。</li>
	<li>用氘代氯仿（CDCl₃）重悬样品。3；三氯（氘代）甲烷）。在通风橱中，使用微量移液器加入 500 &#181;L 向装有干燥样品提取物的容器中加入氘代氯仿。</li>
	<li>盖上瓶盖，通过轻轻将瓶子在手或实验台面上轻敲约每侧10次，振荡以溶解干燥提取物。然后使用洁净的移液枪头将液体转移至核磁管中。</li>
	<li>重复步骤 3.2 和 3.3，另加 500 &#181;L 用氘代氯仿进行第二次溶解，将样品的第二部分加入与第一部分相同的核磁共振管中。第二次冲洗旨在确保干燥提取物从容器中完全溶解和回收。</li>
	<li>将核磁共振管盖紧，并在采集核磁共振谱前存放3天。适当的存放时间取决于溶剂从核磁共振管中的蒸发速率。使用氘代氯仿制备样品后应尽快进行分析。</li>
	<li>为将核磁共振（NMR）管运送至波谱仪，请使用专为支撑细长且易碎的NMR管而设计的管架。此类管架通常在NMR管的底部和顶部附近均设有固定支撑。运输过程中应始终保持NMR管处于直立状态。</li>
	<li>使用500 MHz核磁共振波谱仪采集 1H质子谱与 90&#176; 脉冲角度29，脉冲宽度为 8 &#181;s33，25秒的延迟时间（由反转恢复实验确定）29,43），每次扫描262K个点，共32次复合扫描29,44 从 12 到 -2 ppm，总运行时间为 25 分钟。 
	注意：我们使用配备宽带优化探头和自动进样器的Bruker Neo 500 MHz核磁共振波谱仪，在300 K的恒定温度下进行实验。也可使用其他类似的波谱仪。若使用不同磁场强度的仪器，可根据PBAT和1,4-二甲氧基苯的T1弛豫时间，通过反转恢复实验计算相应的适当延迟时间。29,43.</li>
	<li>样品运行结束后，根据需要保存、传输或访问光谱数据。 
	检查光谱数据。确认用于定量的所有 PBAT 特征峰（若存在）均清晰可分辨。定量时使用 PBAT 的峰 5（8.10 ppm）、峰 6（4.44 ppm）、峰 6'（4.38 ppm）、峰 3'（4.15 ppm）和峰 3（4.09 ppm）（详见 表1）。使用DMB峰A（6.84 ppm）和峰B（3.77 ppm）进行定量分析（详见 表 2）。需特别注意PBAT的6、6'、3'和3峰，这些峰彼此非常接近，可能会发生重叠。</li>
	<li>如果某些峰未完全分离，则稀释样品。合并 100 &#181;L 样品和 500 &#181;L 在洁净的核磁管中加入氘代氯仿，并按照步骤3.7中定义的相同参数重新检测样品。</li>
</ol>
4. 利用核磁共振谱分析定量 PBAT
注意：采集后可随时进行光谱分析。建议在生成光谱的当天完成数据分析，以确保若出现问题时样本仍可用于重新检测。
<ol>
	<li>在核磁共振FID处理软件中打开光谱仪生成的FID文件（我们使用MestreLab公司的MestreNova软件，也可选用其他软件）。</li>
	<li>对谱图应用线宽展宽：在FID处理软件中，选择“处理”菜单下的处理模板，然后进入“加权”（Apodization）部分。选择指数模型，线宽参数设为0.5 Hz，第一点也设为0.5 Hz。</li>
	<li>点击“处理”菜单中的自动相位校正按钮进行自动相位校正。再点击自动基线校正按钮进行自动基线校正。</li>
	<li>使用峰解卷积拟合测得的谱峰：在谱图处理软件的“分析”选项卡中，进入“拟合”&#160;部分，点击新建拟合按钮。使用光标在谱图上从化学位移8.5 ppm处点击，拖动至3.0 ppm处后释放。</li>
	<li>在“拟合”部分点击谱线拟合表以查看所有拟合的峰。</li>
	<li>保留用于定量分析的峰，这些峰在表1和表2中已描述，并在图2中标注。定量时使用PBAT的峰5（8.10 ppm）、峰6（4.44 ppm）、峰6'（4.38 ppm）、峰3'（4.15 ppm）和峰3（4.09 ppm）（详见表1），以及DMB的峰A（6.84 ppm）和峰B（3.77 ppm）。表1和表2中列出的每个峰所对应的氢原子在图3的结构图中进行了标注，其中图3A显示了两种PBAT二聚体的结构，图3B展示了二聚体在聚合物中的位置如何影响来自1,4-丁二醇单体的氢原子的化学位移，图3C显示了DMB的结构。</li>
	<li>通过选中不需要的峰并点击删除峰，从拟合中删除所有其他峰。</li>
	<li>使用“拟合表”将每个峰的面积复制到电子表格软件中进行计算（我们选择使用电子表格）。</li>
	<li>要将峰面积复制到电子表格中，首先在“谱线拟合表”中选中所有峰的信息，然后右键单击并从弹出菜单中选择复制，再将数据粘贴至电子表格中。</li>
	<li>使用以下公式计算加入样品中DMB的摩尔数，nDMB： 
	<img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
	其中mDMB&#160;为加入样品的DMB质量（单位：克，建议为1.00 mg），MMDMB&#160;为DMB的摩尔质量（138.17 g/mol）。</li>
	<li>使用以下公式计算样品中PBAT对苯二甲酸丁二醇酯二聚体的摩尔数，nBT： 
	<img alt="公式2" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq02.jpg" style="margin: auto;" /> 
	其中A5&#160;为PBAT峰5的测量面积，AA为DMB峰A的测量面积，AB&#160;为DMB峰B的测量面积。光谱分析软件生成的面积单位为任意单位。</li>
	<li>使用以下公式计算样品中PBAT己二酸丁二醇酯二聚体的摩尔数，nBA： 
	<img alt="公式3" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq03.jpg" style="margin: auto;" /> 
	其中A3为PBAT峰3的测量面积，A3'为PBAT峰3'的测量面积，A6为PBAT峰6的测量面积，A6'为PBAT峰6'的测量面积。光谱分析软件生成的面积单位为任意单位。</li>
	<li>使用以下公式计算样品中PBAT的质量，mPBAT,recovered： 
	<img alt="公式4" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq04.jpg" style="margin: auto;" /> 
	其中MMBA为PBAT中BA二聚体的摩尔质量（200 g/mol），MMBT为PBAT中BT二聚体的摩尔质量（220 g/mol）。</li>
	<li>若样品中已知含有一定量的PBAT，则可根据以下公式计算样品的回收率百分比η，作为提取效率的衡量指标： 
	<img alt="公式5" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq05.jpg" style="margin: auto;" /></li>
	<li>使用以下公式计算样品中PBAT的浓度，CPBAT： 
	<img alt="公式6" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq06.jpg" style="margin: auto;" /> 
	其中mdry soil为用于制备提取物的干土质量（0.1 kg），Vsolvent recovered为步骤2.4中从土壤中回收的溶剂体积，Vsovlent added为初始加入土壤样品的溶剂体积（100 mL）。</li>
</ol>
5. 针对特定土壤中PBAT定量分析的标准曲线制备
注意：基于已知添加量的 PBAT 土壤样品建立的校准曲线，可提供有关 PBAT 从特定土壤中提取和回收情况的重要信息。不同土壤或不同形态的 PBAT 其提取效果并不相同。我们推测提取效率与土壤的黏粒和有机质含量有关33，建议针对每种目标土壤系列和土层分别建立校准曲线。该校准曲线可在未知样品采用本方法处理之前或之后建立。
<ol>
	<li>按照步骤 1.1–1.3 所述方法收集并制备相当于 2.5 kg 干土的样品。</li>
	<li>确定校准曲线需覆盖的范围；校准曲线中使用的 PBAT 最大浓度应高于未知样品中最高的 PBAT 浓度。</li>
	<li>准备或获取足量的 PBAT 塑料，用于制备 5 个加标土壤样品（每个 100 g），其加标浓度分别为最大浓度的 0%、25%、50%、75% 和 100%（共 25 个样品）。例如，若目标最大浓度为 40 mg/kg，则共需 50 mg PBAT 用于制备加标样品。</li>
	<li>制备 25 个土壤样品，每个 100 g。通过称量 PBAT 基塑料并按预定比例加入土壤样品中进行加标。例如，若目标最大浓度为 40 mg/kg PBAT，则制备 5 个不含 PBAT 的样品、5 个含 1 mg PBAT 的样品、5 个含 2 mg PBAT 的样品、5 个含 3 mg PBAT 的样品和 5 个含 4 mg PBAT 的样品。将 PBAT 加入土壤后充分混匀。</li>
	<li>从这 25 个加标样品中提取 PBAT，然后按照步骤 2.1 至 4.16 所述方法收集提取物的核磁共振（NMR）谱图并对谱图进行分析。</li>
	<li>使用统计分析工具，对每个加标样品中测得的 PBAT 量与实际添加的 PBAT 量进行线性回归，从而确定该土壤中 PBAT 的校准曲线方程。我们使用了电子表格软件。若在未添加 PBAT 的加标样品中未检测到 PBAT，则在线性回归中强制截距 b = 0。 
	注：线性回归检验用于评估两个连续数值变量 x 和 y 之间线性关系的强度，其关系式为 y = mx + b。该检验可计算出最符合数据的 m 和 b 值。回归检验的 r2 系数用于描述两个变量之间的相关程度。</li>
	<li>使用统计分析工具检验提取效率与 PBAT 浓度之间是否存在显著关系。根据以下公式计算加标样品中 PBAT 的提取效率： 
	<img alt="公式 7" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq07.jpg" style="margin: auto;" /></li>
	<li>使用统计分析工具计算观测数据在无提取效率与 PBAT 浓度相关性的情况下随机出现的概率。若该 p 值大于预设的显著性阈值 α，则无法拒绝“两个变量之间无关系”的零假设。若如此，则可认为在测试浓度范围内，PBAT 的提取效率为恒定值。若零假设被拒绝，则此处描述的线性模型可能并非建模该数据的最佳方式。</li>
	<li>利用校准曲线的线性回归方程，估算采用本方法处理的未知样品中 PBAT 的含量。若回归中 x 变量为校准曲线加标样品中实际的 PBAT 量，y 变量为测得的 PBAT 量，且 b 设为 0，则： 
	<img alt="公式 8" src="/files/ftp_upload/67471/67471eq08.jpg" style="margin: auto;" /> 
	注：使用校准曲线方程估算重复样品中的 PBAT 含量，可用于生成特定土壤中 PBAT 含量的置信区间；或者，若可计算重复提取物中 PBAT 浓度的均值和置信区间，则可应用校准曲线估算土壤中 PBAT 的浓度。两种操作顺序所得土壤 PBAT 含量的置信区间相同。例如，假设有 10 个重复样品的提取物中 PBAT 浓度分别为 10、5、2、4、10、11、2、6、8 和 5 mg/kg，校准曲线方程为 y（提取物中测得的 PBAT） = 0.75 x（土壤中真实的 PBAT）。则每个重复样品中土壤 PBAT 浓度可估算为 13、7、3、5、13、15、3、8、11 和 7 mg/kg，土壤中 PBAT 的平均浓度估算为 8.4 mg/kg，标准差为 4.4 mg/kg。若先对提取物中 PBAT 浓度（10、5、2、4、10、11、2、6、8 和 5 mg/kg）计算均值和标准差，则得到均值 6.3 mg/kg，标准差 3.3 mg/kg。随后可将校准曲线应用于均值和标准差，以估算土壤中 PBAT 浓度：均值为 8.4 mg/kg，标准差为 4.4 mg/kg。</li>
</ol>

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为影响了本文所报告的工作。

我们提出一种结合溶剂萃取与1H-NMR技术从土壤中萃取并定量PBAT的方法。该萃取过程的关键要素包括萃取技术与设备、所用萃取溶剂以及所需时间。相较于Nelson等人33所采用的索氏萃取和加速溶剂萃取（ASE）方法，我们选择了一种所需设备相对简单且成本较低的萃取技术（玻璃瓶、玻璃珠和摇床）。该方法的目标是能够并行处理多个样品，从而加快大批量土壤样品的处理速度。这种简单溶剂振荡萃取的另一优势在于，与索氏萃取或ASE方法相比，可处理更大体积的土壤样品，从而更便于处理具有环境代表性的样品13,36。我们选用氯仿-甲醇溶剂体系，依据是Nelson等人33报告的成功结果，以及氘代氯仿作为1H-NMR溶剂的可获得性。我们对比了超声处理溶剂-基质混合物（参照Nelson等人33所述方案）与简单的溶剂振荡方法，发现两种方法在PBAT回收率上无显著差异。研...

测量土壤中微塑料污染的方法对于了解全球土壤中塑料污染的范围1、塑料污染的来源2以及潜在解决方案3至关重要。农业土壤尤其容易受到塑料污染的影响：截至2021年，每年农业用途中使用的塑料超过1500万吨4，其中包括250万吨塑料地膜5。塑料地膜与土壤直接接触，每年需重新铺设一次或多次6，且在其使用寿命结束后往往难以从土壤中完全清除7。微塑料检测方法的一个关键应用领域是评估可生物降解塑料产品（如用于蔬菜种植系统的可生物降解塑料地膜）的使用效果8。
在土壤中可生物降解的塑料产品有望成为传统农用塑料的替代品，因为如果其性能符合预期，便可消除地膜覆盖造成的土壤塑料污染。2022年，全球生物可降解塑料产量不足100万吨，但该行业预计将迎来快速增长9。目前四种最常见的可生物降解聚合物——聚乳酸（PLA）、聚合淀粉、聚羟基脂肪酸酯（PHA）和聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）——均已作为农用可降解地膜在商业或实验中应用10。尽管前景广阔，这些可生物降解塑料产品在田间条件下的降解效果仍存在较大差异11。虽然一些关于可降解地膜田间降解的研究主要关注宏观塑料碎片11，但要评估塑料材料的完全降解情况，必须具备从土壤中回收微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）的能力。此外，从土壤中定量检测微塑料对于评估微塑料污染对土壤生态系统潜在负面影响也具有重要意义12。
一些常用于微塑料鉴定与定量的技术包括目视分析、显微傅里叶变换红外光谱法（&#181;傅里叶变换红外光谱（FTIR）、显微拉曼光谱（micro-Raman spectroscopy）&#181;拉曼光谱（Raman）、气相色谱-质谱联用技术（GCMS，包括热裂解GCMS和热萃取-脱附GCMS）、热重分析13其他正在发展的技术包括用于近红外光谱法 原位 土壤中微塑料的测量14脂肪酸甲酯化提取用于气相色谱-质谱分析15，以及核磁共振波谱法16多达90%的土壤微塑料定量研究采用视觉分析法（单独使用或与其他技术联用）来鉴定塑料颗粒，而77%的研究使用了傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱或气相色谱-质谱联用（GCMS）等光谱技术。17开发并协调多种微塑料定量技术，有助于拓展科学界回答多样化微塑料研究问题的能力。18. 目前存在三种用于制备土壤样品以定量微塑料的通用方法：1）从土壤中分离出未改变的单个微塑料颗粒（例如通过密度分离），2）提取已转化的塑料或聚合物材料（例如通过溶解），3）分析整体土壤。两者 &#181;FTIR 和 &#181;拉曼光谱技术要求在对微塑料进行化学鉴定之前，先将其从土壤中分离出来19 而热解-气相色谱-质谱法（pyro-GCMS）可在从土壤中分离出的单一塑料颗粒或整体土壤上进行20从土壤中分离可生物降解的微塑料可能较为困难，因为用于去除土壤有机质的某些消解方法可能会降解或以其他方式化学改变可生物降解聚合物（包括PBAT）。21微拉曼和 &#181;傅里叶变换红外光谱法也存在空间分辨率限制：颗粒必须大于10-20 &#181;米 &#181;FTIR 和 1 &#181;米 &#181;拉曼光谱（如果能够制备出可供分析的如此微小的单个颗粒）19,22这些技术可对微塑料聚合物进行化学鉴定，且可采用光谱成像来测量微塑料的尺寸。22所有类型的热解-气相色谱-质谱联用技术（pyro-GCMS）均存在局限性，即样品在分析过程中会被破坏。
核磁共振（NMR）已成功用于表征土壤组分和污染物23，定量微塑料（MPs）16,24,25,26，以及评估聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯（PBAT）和另一种聚合物聚苯乙烯的降解情况27,28。在定量参数条件下运行时，1H-NMR 波谱产生的谱图中，每个谱峰的面积与样品中相应氢原子的数量成正比；这使得能够对样品中的各组分进行定量分析29。NMR 是一种有价值的分析技术，可用于土壤中某些微塑料（包括 PBAT）的定量，因为它可同时实现组分的定量与鉴定，适用于复杂且不纯净的混合物，并且不需要化学性质完全相同的参比标准品30,31。对溶剂提取物进行 NMR 波谱分析，可定量那些尺寸小于适用于 µFTIR、µRaman 或 GCMS 定量的微塑料或纳米塑料。尽管具有上述优势，定量 NMR 方法的灵敏度仍低于基于破坏性质谱分析的方法32。
所提出的方法，如图所示 图1，描述了一种用于处理和分析含有PBAT（包括纳米级PBAT塑料）土壤样品的工作流程。在该方法中，通过将土壤与氯仿和甲醇的混合液振荡，从土壤样品中提取PBAT聚合物。含有PBAT的溶剂提取物经干燥后，加入内标物1,4-二甲氧基苯，并重新溶解于氘代氯仿中。随后，采用定量参数对提取物进行核磁共振波谱分析。通过比较PBAT分子和内标物分子中氢原子对应的拟合峰面积，对PBAT含量进行定量分析。该方法结合了溶剂提取与质子核磁共振波谱法（1H-NMR 方法（由 Nelson 等人展示）33目标是采用一种适合处理环境规模样品（约100克土壤）的方法，并能够在无需专用提取设备的情况下平行处理多个样品。

<table><tbody><tr><td>1,4-二甲氧基苯</td><td>Arcos Organics 99%+</td><td>AC115411000&amp;nbsp;</td><td>每样品 1 mg</td></tr><tr><td>琥珀色玻璃瓶，带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖（1 L）</td><td>Kimble</td><td>5223253C-26</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>氯仿；三氯甲烷</td><td>费舍尔化学（Fisher Chemical）</td><td>AA43685M6&amp;nbsp;</td><td>每样品 90 mL；Fisher Optima</td></tr><tr><td>氘代氯仿；三氯（氘代）甲烷</td><td>西格玛-奥德里奇（Sigma Aldrich）</td><td>1034200025</td><td>每样品 1 mL；氘代率不低于 99.8%；银稳定化</td></tr><tr><td>玻璃珠（3 mm 直径）</td><td>Propper Manufacturing</td><td>3000600</td><td>每样品 20 个</td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫瓶盖的玻璃提取瓶（约 250 mL 容积）</td><td>Kimble</td><td>5510858B</td><td>每样品 2 个，可重复使用</td></tr><tr><td>量筒，1 L，聚丙烯材质</td><td>Nalgene</td><td>3662-1000</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>量筒，500 mL，聚丙烯材质</td><td>Nalgene</td><td>3662-0500</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>费舍尔化学（Fisher Chemical）</td><td>A412-4&amp;nbsp;</td><td>每样品 20 mL；符合 ACS 认证标准</td></tr><tr><td>移液器，量程 0.5 - 1 mL</td><td>费舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>3123000063</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪（NMR spectrometer）</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td>500 MHz 仪器</td></tr><tr><td>NMR 样品管（7 英寸高，高通量）</td><td>Wilmad</td><td>WG-1000-7</td><td>每样品 1 支</td></tr><tr><td>平台摇床</td><td>Eppendorf, Excella E5&amp;nbsp;</td><td>M1355-0000</td><td>可重复使用</td></tr><tr><td>聚乙烯移液管吸头（10 mL 容积）</td><td>Eppendorf</td><td>22492098</td><td>每样品 1 个，一次性使用</td></tr><tr><td>聚丙烯微量移液器吸头（1 mL 容积）</td><td>费舍尔科技（Fisher Scientific）</td><td>02-707-510</td><td>每样品 3 个，一次性使用</td></tr><tr><td>半微量电子天平</td><td>梅特勒-托利多（Mettler Toledo）</td><td>30532226</td><td>可重复使用</td></tr></tbody></table>

利用质子核磁共振波谱法定量土壤中基于对苯二甲酸/己二酸丁二醇酯的微纳米塑料

Quantification of Polybutylene Adipate Terephthalate-based Micro- and Nano-plastics from Soil Using Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

为了准确评估可生物降解塑料产品的降解程度及其对环境的影响，亟需一种能够回收并定量土壤中生物降解过程中形成的微塑料和纳米塑料（MPs 和 NPs）的方法。微塑料和纳米塑料在土壤中的存在可能改变土壤性质，例如团聚行为，或对土壤生物产生毒性效应。现有的微塑料回收方法并不总是适用于测量聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）等可生物降解聚合物；一些常用的酸或氧化剂消化处理可能会破坏基于 PBAT 的可生物降解微塑料。鉴定方法如显微傅里叶变换红外光谱（micro-FTIR）和显微拉曼光谱也受限于可回收和分析的颗粒最小尺寸。因此，本方法旨在从土壤中提取并定量 PBAT，以评估土壤中 MPs 和 NPs 的质量分数，且不引起 PBAT 的化学结构变化。在本实验方案中，采用氯仿-甲醇溶液选择性地从土壤中提取 PBAT。将提取液中的溶剂蒸发后，残余物重新溶解于氘代氯仿中。随后在定量条件下通过质子核磁共振波谱（1H-QNMR）分析提取物，以定量各样品中 PBAT 的含量。PBAT 在不同土壤中的溶剂提取效率介于 76%（阴蔽壤土）至 45%（埃尔克霍恩砂质壤土）之间。与原始材料相比，光氧化后的材料 PBAT 回收率可能降低，且在高黏粒含量的土壤中回收率也可能下降。在测试浓度范围内，提取效率不依赖于 PBAT 的浓度，但纳米塑料（NPs）的提取效率低于微塑料（MPs）。PBAT 定量结果与通过实验室培养实验测定土壤累计呼吸量来评估塑料降解程度的结果具有可比性。

为了评估该方法在定量土壤中PBAT聚合物方面的有效性，通过提取三种不同土壤制成的加标样品中的PBAT，构建了标准曲线。对于这三种土壤（详见表3），土壤经2 mm筛筛分后风干。通过向100 g干燥土壤中分别添加0、9、18、27或36 mg的基于PBAT的微塑料（MP）制备加标样品（每组5个重复）。这相当于PBAT聚合物含量为0、63、126、189或252 mg/kg。微塑料由塑料地膜制备，其中PBAT质量占比为70%，厚度为50 µm，根据Astner等45描述的研磨程序处理，粒径小于840 µm。为建立每条标准曲线，按照上述定义的程序从每个加标样品中提取PBAT，然后将测得的PBAT回收量与各样品中添加的PBAT量进行比较。此外，在一种土壤（遮荫壤土，Shady loam）中测试了纳米塑料（NP）的PBAT回收率与定量效果（平均直径780 nm，多分散指数0.77，制备方法依据Astner等45）。
对于所有土壤样品，未添加PBAT的样本中均未检测到...

本文描述了一种利用核磁共振波谱法测定土壤中源自聚己二酸丁二醇对苯二甲酸酯的微塑料和纳米塑料含量的方法。该技术改进了现有方法，因为它可扩展用于纳米塑料的定量分析，并且能够轻松适应大规模环境样品的处理。

一种用于回收并定量土壤中生物降解过程中形成的微塑料和纳米塑料（MPs 和 NPs）的方法，对于准确评估……至关重要

我们开发此方法的目的是为了更深入地了解可生物降解塑料在土壤中的降解过程。可生物降解塑料制品在设计上应能在埋入土壤后完全降解，但我们亟需一种能够检测可能残留在土壤中的微小塑料碎片的方法。近年来，微塑料定量技术发展迅速，但不同研究团队之间尚未建立统一的标准方法。已采用多种不同技术对土壤中的微塑料进行了定量分析。我们认为，开发核磁共振（NMR）波谱法对于拓展微塑料定量技术的可及性具有重要意义。此前，NMR已被用于定量土壤中塑料产品中的聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯（PBAT）。我们创建并共享了该方案，旨在将此技术转化为环境科学家及其他研究人员可用于并行快速定量大量土壤样品中PBAT的工具，从而实现大范围的环境监测。本方案包括在溶剂中回收PBAT聚合物。由于该方法不侧重于分离单个塑料颗粒，因此不受微塑料或纳米塑料尺寸的限制。尽管存在一些权衡，但这使我们能够深入了解纳米塑料在土壤中的生物降解过程。现在我们已经能够定量检测土壤中的微米和纳米级塑料，接下来希望进一步研究纳米塑料与土壤组分（如有机质和土壤矿物）之间的相互作用。这些相互作用可能是一个重要因素，能够保护塑料免受微生物酶的降解作用。首先，在提取之前收集并制备土壤样品。在通风橱中，为每个待提取样品配制 100 毫升体积比为 90:10 的氯仿-甲醇混合溶液。向玻璃提取瓶中加入 100 克干燥土壤、100 毫升氯仿-甲醇溶液以及 20 颗玻璃珠。使用带聚四氟乙烯（PTFE）衬垫的瓶盖将罐子紧密密封，以防止溶剂蒸气逸出。将提取罐置于摇床平台上，以每分钟200转的速度振荡八小时。振荡结束后，静置提取罐中的土壤至少四小时，使其充分沉降。现在，在通风橱中打开一个提取瓶的盖子。使用移液器将液体提取物加载到孔径为11微米的定性滤纸上，并将滤液收集到已标记的洁净玻璃瓶中。记录回收溶剂的体积。将土壤中的提取物置于通风橱中完全干燥，可能需要长达24小时。随后，安全丢弃干燥后的土壤。提取物干燥后，盖紧样品瓶盖，将其储存在阴凉、避光、干燥的地方，以备后续使用。首先，获取含有聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）的干燥土壤提取物。向每个含有干燥提取物的样品瓶中加入1毫克内标物1,4-二甲氧基苯。在通风橱中，用500微升氘代氯仿重新悬浮样品。盖上瓶盖，轻轻将瓶子在手心或实验台面上每侧敲击约10次。然后，使用干净的移液枪头将溶解的样品转移至核磁管中。再用500微升氘代氯仿重复重悬步骤，并吸取样品。盖上核磁共振（NMR）管，存放三天后再采集核磁共振谱图。在阴蔽壤土中添加63毫克/千克PBAT后的谱图清晰地显示出全部五个特征性PBAT峰。校准曲线显示，在阴蔽壤土、麋角砂质壤土和洛斯奥索斯壤土中，添加的PBAT量与检测到的量之间具有强相关性，其中阴蔽壤土的提取效率最高，达到76%；阴蔽壤土中微塑料的PBAT提取效率高于纳米塑料。

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了解如何使用质子核磁共振波谱技术定量检测土壤中的PBAT微塑料和纳米塑料。该方法支持大规模环境样本的并行处理，为评估可生物降解塑料的环境降解过程提供可靠的量化分析工具。

利用质子核磁共振波谱法定量土壤中基于对苯二甲酸/己二酸丁二醇酯的微纳米塑料

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