基于 LED 的体外 筛选用于评估细菌光动力灭活中的光激活分子

我的研究重点是探索天然和合成黄酮化合物家族的不同分子，其核心兴趣是研究它们在紫外线光保护背景下的生物活性，并评估它们作为光动力治疗应用的光敏剂的潜力。我们研究小组最近的研究结果证明了氨基类黄酮染料的光活化特性，使其成为一类有前途的新型光敏剂。这些化合物显示出进一步探索的巨大潜力，为该领域的创新应用铺平了道路。

使用 96 孔微孔板和光板系统，我们可以在受控环境中获得光敏剂的高通量筛选，从而简化光动力疗法不同候选者之间的识别和比较。首先，从终止培养物中引入 Mueller-Hinton 琼脂平板上的金黄色葡萄球菌。将板在 37 摄氏度下孵育 24 小时以获得新鲜培养物。

从琼脂平板中收集 2 到 3 个新鲜菌落，并在 pH 值为 7.4 的 6 毫升预热无菌过滤 PBS 中稀释它们。以每分钟 1， 200 转的速度涡旋接种物 3 到 4 个循环，以使样品均质化，并将 3 毫升均质接种物抽入一次性比色皿中。测量 600 纳米的光密度后，使用 PBS 稀释样品以匹配 0.1 的光密度。

在适当的溶剂（如 DMSO 或 PBS）中制备光敏剂化合物的储备溶液。在 PBS 中稀释储备溶液以产生工作溶液，确保细菌培养基成分不会干扰光吸收。涡旋工作溶液以确保完全均质化。

首先，准备金黄色葡萄球菌悬浮液和光敏剂化合物工作溶液。准备两个单独的 96 孔板，一个用于光照，另一个用于黑暗控制。在每个板中，分液 100 微升光敏剂溶液和细菌悬浮液。

用移液管将溶液混合 5 至 10 次。将板在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，让光敏剂与细菌细胞相互作用。孵育后，从培养箱中取出板。

保持其中一个板免受光照作为暗对照。将另一个 96 孔板放在矩形 50 瓦 LED 面板上方。在 LED 表面上标记板的边缘，以确保在协议重复中放置一致。

将板暴露在 LED 灯下约 15 分钟。使用另一个 96 孔板制备样品的连续稀释液，包括对照、未辐照和辐照孔。根据样品数量，向每个孔中加入 180 微升 PBS。

从辐照板和非辐照板中的每个孔中分装 20 微升到填充 PBS 板的第一列中。使用多通道微量移液器，从孔 1 到 6 进行简单的连续稀释。将琼脂平板分成六个相等的部分，每个部分对应于其中一个稀释液。

从每个孔中分装 10 μL 到琼脂板的相应部分。将板孵育 18 至 20 小时。从培养箱中取出琼脂板，并确定适合菌落计数的区域。

在螺旋板的每个部分内，计算菌落形成单位的数量。可见光范围光谱显示了 400 到 700 纳米之间的三个不同峰值。在黑暗条件下，所有测试的黄酮化合物均未显示出细胞毒性作用。

相比之下，在光照后，测试化合物导致金黄色葡萄球菌活力的剂量依赖性降低，在 6 和 12 微摩尔浓度下观察到显着影响。