Name: 使用 HeLa 细胞和免疫细胞化学与光学显微镜检测抗 MDA5 自身抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T14:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习使用HeLa细胞和免疫细胞化学技术检测抗MDA5自身抗体的方法。该方法通过转染、固定、透化和显色步骤，为诊断肌炎相关间质性肺病提供快速可靠的检测手段。

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本研究得到了中国台湾国家科学与技术委员会授予许哲林的资助（项目编号：NSTC 114-2320-B-039-038 和 NSTC 113-2320-B-039-032）。本研究还部分得到了中国医药大学及附属医院授予许哲林的资助（项目编号：CMU113-MF-89 和 C1110812016-12）。

1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养HeLa细胞。</li>
	<li>每2–3天传代一次，或当细胞融合度达到90%–100%时进行传代。</li>
	<li>转染前24小时，将7 × 104个HeLa细胞接种至24孔板的每孔中（每孔面积1.9 cm2），使细胞在转染时融合度约为90%。</li>
	<li>分别用25 µL低血清培养基稀释500 ng质粒（pENTER-MDA5）和1.5 µL转染试剂。</li>
	<li>将稀释后的DNA加入稀释后的转染试剂中（体积比1:1），充分混匀，室温孵育5分钟。</li>
	<li>将上述混合物加入前一日接种的细胞中，并立即轻轻振荡混匀，使DNA-脂质复合物均匀分布。确认细胞融合度为80%–90%。</li>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中继续孵育24小时，随后进行免疫细胞化学染色（ICC）。
	 
	注：本实验使用市售载体（pEnter-MDA5）；更多详细信息见材料表。转染效率约为50%。
	 
	转染成功及目标蛋白表达情况可通过转染表达荧光蛋白的质粒并进行Western blot检测目标蛋白表达水平来确认。</li>
</ol>
2. 细胞固定
<ol>
	<li>孵育后，用 PBS 洗涤细胞 2 次，以去除残留的培养基。 
	注意：可通过在旋转摇床上轻轻震荡培养板进行洗涤。</li>
	<li>用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞，在室温下孵育 15 分钟。 
	注意：多聚甲醛具有毒性，请遵循适当的处理规范。</li>
	<li>吸除固定液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。</li>
</ol>
3. 细胞通透化
<ol>
	<li>加入 Triton X-100 试剂（PBS 中含 0.3%），室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>10 分钟后，弃去去垢剂。</li>
	<li>加入 PBS 洗涤细胞一次。</li>
</ol>
4. 细胞封闭
<ol>
	<li>使用含10%胎牛血清的PBS（1×）进行封闭，在室温下孵育细胞1小时。</li>
	<li>移除封闭剂，然后加入PBS洗涤细胞一次。</li>
</ol>
5. 患者抗体的杂交
<ol>
	<li>将稀释后的患者血浆加入细胞中。使用前务必用 PBS 将患者样本稀释（1:5,000，溶于 PBS）。 
	注意：可根据需要调整稀释比例以增强信号或降低背景。为确保结果无偏倚，进行检测的工作人员对样本来源（患者或健康个体）不知情。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育样本 12–16 小时（过夜）。</li>
	<li>孵育结束后，移除患者样本，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。</li>
</ol>
6. 二抗杂交
<ol>
	<li>用稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG（以PBS按1:250稀释）处理细胞，并于室温孵育1小时。</li>
	<li>1小时后，弃去二抗溶液。</li>
	<li>用PBS洗涤3次。</li>
</ol>
7. 细胞染色
<ol>
	<li>洗涤细胞后，每孔加入 300 µL DAB 工作液对细胞进行染色。 
	注意：该溶液是根据制造商说明书将 DAB 染色原浓缩液与 DAB 稀释液混合配制而成。</li>
	<li>染色 5 分钟后，移除染液，用去离子蒸馏水冲洗，并振荡 5 分钟。</li>
</ol>
8. 细胞复染
<ol>
	<li>用稀释的苏木精对细胞核进行复染。 
	注：我们使用10倍稀释的苏木精Gill II，染色过程持续5分钟。</li>
	<li>5分钟后，弃去苏木精溶液，然后用去离子蒸馏水洗涤2次，每次5分钟。</li>
</ol>
9. 观察
<ol>
	<li>使用光学显微镜观察染色结果。 
	注意：真阳性结果显示表达 MDA5 的 HeLa 细胞内有明显的棕褐色染色；这证实患者样本中存在抗 MDA5 自身抗体。阴性结果表现为 HeLa 细胞无棕褐色染色，表明无抗 MDA5 自身抗体。假阳性结果表现为无论是否表达 MDA5，所有细胞均出现广泛的棕褐色染色。这种非特异性染色可见于其他自身免疫性疾病，必须与真阳性结果加以区分，以避免误诊。</li>
</ol>

<ol><li>Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+managing+anti-MDA5+dermatomyositis%2C+including+potential+COVID-19+mimicry%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Int%22%5BJournal%5D)">Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry.</a> Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).</li>
<li>Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+juvenile+dermatomyositis%3A+are+the+distinct+clinical+features+explained+by+our+current+understanding+of+serological+subgroups+and+pathogenic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms.</a> Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).</li>
<li>Fujisawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+myositis-associated+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Management of myositis-associated interstitial lung disease.</a> Medicina. 57 (4), 347(2021).</li>
<li>Sasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+initiation+of+plasma+exchange+therapy+for+a+patient+with+anti-MDA5+autoantibody-positive+dermatomyositis+developing+rapidly+progressive+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Rheumatol+Case+Rep%22%5BJournal%5D)">Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease.</a> Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).</li>
<li>Go, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+benefit+associated+with+early+cyclosporine+treatment+for+dermatomyositis-associated+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatol+Int%22%5BJournal%5D)">Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease.</a> Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).</li>
<li>Tsuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+study+of+the+efficacy+and+safety+of+combined+immunosuppressive+therapy+with+high-dose+glucocorticoid%2C+tacrolimus%2C+and+cyclophosphamide+in+interstitial+lung+diseases+accompanied+by+anti-melanoma+differentiation-associated+gene+5-positive+dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis.</a> Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).</li>
<li>Hozumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+myositis-specific+autoantibodies+in+polymyositis%2Fdermatomyositis-associated+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease.</a> Respir Med. 122, 1-8 (2016).</li>
<li>Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+new+detection+system+of+autoantibodies+in+myositis+with+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease.</a> Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).</li>
<li>Koga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+utility+of+anti-melanoma+differentiation-associated+gene+5+antibody+testing+for+predicting+the+prognosis+of+Japanese+patients+with+DM%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM.</a> Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).</li>
<li>Fuzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MDA5+dermatomyositis%3A+an+update+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside.</a> Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+a+140-kd+polypeptide%2C+CADM-140%2C+in+Japanese+patients+with+clinically+amyopathic+dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis.</a> Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).</li>
<li>Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reliability+of+immunoassays+to+detect+autoantibodies+in+patients+with+myositis+is+dependent+on+autoantibody+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity.</a> Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).</li>
<li>Chen, Y. L., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+predictive+value+of+myositis+antibody+line+blot+testing+in+patients+with+suspected+idiopathic+inflammatory+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy.</a> Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).</li>
<li>Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+performance+of+an+indirect+immunofluorescence+assay+for+the+detection+of+anti-MDA5+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies.</a> Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).</li>
<li>Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+new+detection+system+of+autoantibodies+in+myositis+with+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease.</a> Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+a+140-kd+polypeptide%2C+CADM-140%2C+in+Japanese+patients+with+clinically+amyopathic+dermatomyositis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis.</a> Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).</li>
<li>Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+predictive+value+of+myositis+antibody+line+blot+testing+in+patients+with+suspected+idiopathic+inflammatory+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy.</a> Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。
本手稿的部分内容在 OpenAI 的 GPT-4 协助下完成。作者对内容进行了审阅和修改，以确保其准确性和原创性。

我们基于免疫细胞化学（ICC）的抗MDA5自身抗体检测技术相较于传统的条带印迹分析和放射免疫分析具有显著优势。此前，Nombel等通过比较MDA5转染细胞的间接免疫荧光（IIF）与ELISA，在23例抗MDA5阳性皮肌炎患者和22例抗MDA5阴性对照组成的队列中报道了该方法的敏感性和特异性分别为96%和100%14。然而，该ELISA试剂盒并未商业化，仅限研究用途。在上述研究基础上，本研究重点在于开发并展示基于ICC的检测方案。与放射免疫分析不同，我们的ICC方法不使用放射性物质，因此更安全且更环保。此外，ICC方案相较于放射性标记检测显著缩短了检测周期，从而提高了样本处理效率，并有助于加快临床决策进程。这些特点使我们的方法成为检测抗MDA5自身抗体的一种可靠替代方案，尤其适用于特发性炎症性肌病（IIM）和快速进展性间质性肺病（RP-ILD）的诊断。
我们的免疫细胞化学技术的成功依赖于多个关键步骤。首先，高效的转染至关重要，因为表达水平不理想可能导致结果不一致。其次，固定过程必须严格控制，以保持细胞形态和抗原性。第三，与患者血浆的孵育...

特发性炎症性肌病（IIM），通常称为肌炎，是一组异质性的自身免疫性疾病，其特征为慢性肌肉炎症、临床表现多样以及治疗效果各异。常见症状包括肌肉无力、耐力下降和肌痛1。IIM 的主要亚型包括多发性肌炎（PM）和皮肌炎（DM），而临床无肌病性皮肌炎（CADM）则以类似于 DM 的特征性皮肤皮疹为表现，但无明显或仅有轻微肌肉受累。PM、DM 和 CADM 的主要并发症之一是间质性肺病（ILD），约影响 40% 的患者，且与死亡率升高相关2。
特发性炎性肌病（IIM）中间质性肺病（ILD）的临床病程和预后差异显著。与多发性肌炎（PM）相关的ILD相比，皮肌炎（DM）和临床无肌病性皮肌炎（CADM）相关的ILD（DM-/CADM-ILD）往往对治疗反应较差，预后更差。其中，急性或亚急性ILD在三个月内迅速进展3，病情尤为严重，其五年生存率仅为52%，而进展缓慢或保持稳定的慢性ILD五年生存率为87%。快速进展性ILD（RP-ILD）是急性/亚急性ILD的一种亚型，其特征为呼吸困难迅速发作，并在胸部影像学上可见广泛的肺泡损伤。RP-ILD是一种危及生命的疾病，预后不良，凸显了早期诊断和及时干预以改善患者预后的紧迫性4,5,6。
肌炎特异性自身抗体（MSAs）已成为肌炎相关性间质性肺病（ILD）中的关键生物标志物，其中抗MDA5自身抗体具有尤为重要的意义。这些自身抗体常在多发性肌炎（PM）/皮肌炎（DM）/临床 amyopathic 皮肌炎（CADM）相关ILD患者中被检出，并可作为快速进展性ILD（RP-ILD）的重要预后指标7,8,9。MDA5（黑色素瘤分化相关基因5）是一种由干扰素诱导型基因编码的胞质模式识别受体，能够识别病毒和线粒体来源的双链RNA，从而启动干扰素介导的免疫应答10。尽管其确切的致病机制尚不明确，但目前认为抗MDA5自身抗体可干扰MDA5的正常功能，进而参与自身免疫性疾病的发病过程。
及时检测抗MDA5自身抗体对于快速识别和管理RP-ILD至关重要。传统上，使用35S-甲硫氨酸标记的K562细胞提取物进行放射性免疫沉淀（IP）被认为是检测抗MDA5自身抗体的金标准11。然而，由于该方法成本高昂，依赖专业设备和经过培训的技术人员，受到严格的放射性废物处理法规限制，且放射性标记试剂的有效期较短，因此在常规临床实践中难以推广应用。在临床实践中，印迹法常被用作替代方法；但该方法对抗MDA5自身抗体的检测存在较高的假阳性率12,13，引发人们对诊断准确性的担忧。因此，迫切需要一种可靠、非放射性的确证性检测方法，以验证阳性结果并提高诊断可信度。
为弥补这一不足，我们提出将免疫细胞化学（ICC）作为抗MDA5自身抗体的补充确证检测方法。该方法包括用MDA5质粒转染HeLa细胞，将细胞与患者血浆孵育，然后使用酶标记的二抗（例如辣根过氧化物酶）结合显色底物，通过光学显微镜观察结合的抗MDA5自身抗体。ICC提供了一种非放射性、高灵敏度且标准化的平台，可用于可视化细胞内不同区室中的抗MDA5自身抗体。通过将ICC与印迹实验相结合，该方法旨在降低假阳性率，提高诊断准确性，从而最终改善患者的临床管理和治疗效果。
本研究的目的是建立一种稳健且非放射性的抗MDA5自身抗体检测方案，以克服现有检测方法的局限性，为临床医生提供一种实用且可靠的工具，用于对多发性肌炎（PM）、皮肌炎（DM）和临床无肌病性皮肌炎（CADM）患者中的快速进展性间质性肺病（RP-ILD）进行早期诊断。在配套视频解说中，这种危及生命的病程被通俗地描述为“快速死亡”；从科学角度而言，其对应的是快速进展性间质性肺病（RP-ILD）。本研究基于已有证据，有望显著改善临床实践中的预后评估和治疗决策。

<table><tbody><tr><td>24孔板（每孔1.9 cm&amp;sup2;）</td><td>Corning</td><td>354541</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>PYREX</td><td>1000-600</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（15 mL）</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>锥形管（50 mL）</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>去离子蒸馏水</td><td></td><td></td><td>我们的去离子蒸馏水使用Milli-Q系统自制（柱1：Quantum TEX，序列号：F4EB53476；柱2：Prepak，序列号：F1CB11442）</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清</td><td>Cytiva</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>量筒（50 mL）</td><td>VITLAB</td><td>64804</td><td></td></tr><tr><td>Gill II 型苏木精染液</td><td>Leica</td><td>3801522</td><td></td></tr><tr><td>含高糖的Hyclone Dulbecco&amp;rsquo;s 改良Eagle培养基</td><td>Cytiva</td><td>SH30243.02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>MDA-5 (D74E4) 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5321</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（1.5 mL Eppendorf管）</td><td>AXYGEN</td><td>142503</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床（可选）</td><td>FIRSTEK</td><td>S300R</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>1×PBS中配制成4%</td></tr><tr><td>PBS缓冲液</td><td>PRO TECH</td><td>ME222605</td><td></td></tr><tr><td>pENTER-MDA5</td><td>Vigene Biosciences Inc.</td><td>CH863586</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的AffiniPure山羊抗人IgG（H+L）</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-003</td><td></td></tr><tr><td>移液器控制器</td><td>Thermo Scientific</td><td>130165</td><td></td></tr><tr><td>移液器&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器及吸头（10 &amp;micro;L）</td><td>QSP</td><td>104-Q</td><td></td></tr><tr><td>移液器及吸头（200 &amp;micro;L）</td><td>QSP</td><td>T090-Q</td><td></td></tr><tr><td>移液器及吸头（1000 &amp;micro;L）</td><td>QSP</td><td>111-Q</td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管（5 mL）</td><td>SPL</td><td>91005</td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管（10 mL）</td><td>SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>血清学移液管（25 mL）</td><td>SPL</td><td>91025</td><td></td></tr><tr><td>SignalStain DAB底物试剂盒</td><td>Cellsignaling</td><td>8059</td><td>PBS中配制成0.3%</td></tr></tbody></table>

利用hela细胞和光学显微镜免疫细胞化学法检测抗mda5自身抗体

Detection of Anti-MDA5 Autoantibodies Using HeLa Cells and Immunocytochemistry with Light Microscopy

抗MDA5自身抗体是皮肌炎（DM）、临床无肌病性皮肌炎（CADM）和多发性肌炎（PM）的关键生物标志物，尤其在识别快速进展性间质性肺病（RP-ILD）高风险患者方面具有重要意义。早期检测这些自身抗体对于改善患者预后至关重要，因为诊断延迟常导致不良结局。目前，放射免疫分析法是检测抗MDA5抗体的金标准，但其应用受限于高昂的成本、耗时的流程以及对专业技术的依赖。此外，印迹试验作为一种广泛使用的临床工具，在检测MDA5自身抗体时假阳性率较高，可能影响诊断准确性。为克服这些局限性，我们提出一种非放射性、高灵敏度且标准化的免疫细胞化学（ICC）确证检测方法。该方案包括：用MDA5质粒转染HeLa细胞，使用Triton X-100对细胞进行通透处理，以促进抗MDA5自身抗体与靶抗原的结合，并利用酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶）结合DAB显色剂，通过显微镜成像检测结合的抗体。ICC方法可在细胞结构内直观显示抗MDA5自身抗体，具有操作简便、成本低廉和高灵敏度的优势。本研究旨在将ICC作为补充确证手段，提高抗MDA5抗体检测的可靠性，从而优化DM、CADM和PM患者RP-ILD的诊断与预后评估策略。

进行检测的人员对样本的身份信息（包括样本来源的具体患者）设盲，以尽量减少评估过程中的潜在偏倚。然而，尽管健康对照样本未实施设盲，其结果始终清晰且明确。
图1A 显示了转染pENTER-MDA5质粒的HeLa细胞中MDA5的成功表达。为验证转染效率，使用商业化的抗MDA5抗体进行了免疫细胞化学（ICC）检测。约50%的转染细胞中观察到明显的棕褐色胞质染色，表明MDA5蛋白高效表达。相比之下，在相同条件下处理的未转染细胞未显示胞质染色，证实了抗体的特异性以及内源性MDA5表达的缺失。
根据ICC方案，通过放射性免疫沉淀法确认的抗MDA5阳性患者的代表性样本在表达MDA5的HeLa细胞中显示出清晰的棕色胞质染色，而非转染细胞则未被染色（图...

我们提供一种用于检测抗MDA5抗体的逐步免疫细胞化学（ICC）方法。该方法包括细胞固定、通透化、抗体孵育和成像技术，可准确检测抗MDA5自身抗体，有助于诊断肌炎患者中快速进展的间质性肺病。

利用HeLa细胞和光学显微镜免疫细胞化学法检测抗MDA5自身抗体

抗MDA5自身抗体是皮肌炎（DM）、临床无肌病性皮肌炎（CADM）和多发性肌炎（PM）的重要生物标志物，尤其在……

以下实验的主要目的是利用免疫细胞化学方法检测抗MDA5抗体。该方法通过使用HeLa细胞，并将MDA5表达质粒转染至HeLa细胞中，使HeLa细胞表达MDA5蛋白，从而可被抗MDA5抗体结合。加入表达MDA5构建体的HeLa细胞后，使用Triton试剂对HeLa细胞膜进行透化处理，以允许抗MDA5抗体进入细胞。随后加入含有抗MDA5抗体的患者血清，抗MDA5抗体将与HeLa细胞内的MDA5蛋白结合。随后，将连接有辣根过氧化物酶的二抗加入细胞中，二抗会与抗MDA5抗体结合。最后，向细胞中加入显色底物，在辣根过氧化物酶标记的二抗存在下，显色底物被氧化，从而在光学显微镜下产生可见的颜色。阳性结果将呈现如上图所示的形态。在今天的视频演示中，我们将深入探讨医学研究的一个关键领域——抗黑色素瘤分化相关基因5抗体（也称为抗MDA5抗体）的检测。这种自身抗体是间质性肺疾病患者的重要诊断指标，尤其对于快速进展型间质性肺疾病患者具有重要意义。本研究的重要性在于其对患者预后可能产生的深远影响。早期且准确地检测MDA5自身抗体，对于有效管理这一严重自身免疫性疾病至关重要。我们所展示的方法相较于传统的抗MDA5自身抗体筛查方法的主要优势在于，其操作速度更快，与传统的放射性标记免疫沉淀法相比，能够节省大量时间和人力。这种更高的效率使我们能够处理更多的样本，并快速获得结果。此外，必须强调的是，与传统的免疫沉淀法相比，我们的方法不仅在效率上具有显著优势，而且在安全性和成本效益方面也表现更优。现在，让我们来看一下具体操作。我的研究助理 Teo Kai Fa 将演示该实验流程。使用含 10% 胎牛血清和 1% 抗生素-抗真菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养 HeLa 细胞。每两到三天传代一次细胞，或当细胞融合度达到90%至100%时进行传代。在24孔板的每个孔中接种70,000个HeLa细胞。转染前24小时，将细胞接种至培养板，使其融合度约为90%。将500纳克的纤溶酶和1.5微升转染试剂分别加入25微升低血清培养基中稀释。按1:1的比例将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂混合。充分混匀，室温孵育5分钟。将混合物加入前一天接种的细胞中，并立即轻轻振荡以混匀DNA-脂质复合物。确认细胞融合度达到80%至90%。将细胞在37°C、含5% CO2的加湿培养箱中孵育40至4小时，随后进行免疫细胞化学检测。我们使用一种市售的因子。更多详细信息请参见材料表。其转染效率为50%。转染成功及目标蛋白的表达可通过将细胞转染冻存的表达质粒后进行蛋白质印迹（western blot）来检测目标蛋白的表达情况进行确定。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，以去除残留的培养基。可通过振荡平板或使用轨道摇床进行洗涤。用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞，注意：多聚甲醛具有毒性。遵循适当的处理规范。将细胞在室温下放置15分钟。随后，妥善处理固定剂试剂。用 PBS 清洗细胞两次。加入 Triton 试剂，然后在室温下孵育 10 分钟。我们使用的 Triton X-400 浓度为 0.3%，溶于 PBS 中。孵育 10 分钟后，弃去 Triton 试剂。加入 PBS 洗涤细胞一次。下一步，使用含 10% 胎牛血清的 PBS 进行封闭，室温孵育细胞 1 小时。移除封闭液。然后，加入 PBS 洗涤细胞一次。将稀释后的患者血浆加入细胞中。使用前务必用 PBS 将患者血浆按 1:5,000 的比例稀释。根据需要调整稀释比例，以增强信号或降低背景，确保结果无偏倚。工作人员在进行检测时，对哪些样本来自患者、哪些来自健康个体均不知情。将样本在4°C下孵育12至16小时。孵育结束后，取出患者的样本，并用PBS洗涤细胞三次。用 PBS 按 1:250 的比例稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人 IgG，加入细胞中进行孵育，在室温下放置 1 小时。1 小时后，弃去二抗。用 PBS 冲洗三次。洗涤细胞后，每孔加入 300 微升 DAB 工作液进行染色。DAB 工作液的配制方法是按照生产商说明书，将 DAB 增强浓缩液与 DAB 稀释液混合而成。染色细胞5分钟后，去除染液。去除染液后，用离子化蒸馏水冲洗并振荡5分钟。用稀释的伊红对细胞核进行复染。我们使用血毒素，按10倍稀释比例加入。染色过程等待五分钟。五分钟后，弃去血毒素，然后用分析级蒸馏水洗涤两次，每次五分钟。最后一步，在光学显微镜下观察染色结果。让我们解读抗MDA5自身抗体的免疫细胞化学检测结果：阳性结果。真阳性结果显示表达MDA5的HeLa细胞内有明显的棕褐色染色，证实患者样本中存在抗MDA5自身抗体。阴性结果。阴性结果表现为HeLa细胞无棕褐色染色，表明无抗MDA5自身抗体。假阳性结果中，无论MDA5表达情况如何，所有细胞均呈现广泛的棕褐色染色。在各种自身免疫性疾病中观察到的这种非特异性染色必须与真正的阳性结果加以区分，以避免误诊。我们的方法提供了一种更快、更安全且更具成本效益的方式来检测抗MDA5器官特异性抗体，有望显著改善间质性肺病患者管理中的临床预后。观看本视频后，您将学会如何进行免疫细胞化学实验操作，以及如何识别检测结果中具有临床意义的信息。

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使用 HeLa 细胞和免疫细胞化学与光学显微镜检测抗 MDA5 自身抗体

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