使用 HeLa 细胞和免疫细胞化学与光学显微镜检测抗 MDA5 自身抗体

我们提供用于检测抗 MDA5 的分步免疫细胞化学 （ICC） 方法。该方法涉及细胞固定、透化、抗体孵育和成像技术，可以准确检测抗MDA5自身抗体，有助于诊断肌炎患者快速进展的间质性肺病。

以下实验的主要目的是利用免疫细胞化学筛选抗MDA5抗体。这是通过使用 HeLa 细胞，然后用 MDA5 构建体转染 HeLa 细胞来完成的。因此，HeLa 细胞将产生可以通过 MDA5 抗体附着的 MDA5 蛋白。

在将 HeLa 细胞与 MDA5 构建体结合后，Triton 试剂用于透化 HeLa 细胞的膜，这将使抗 MDA5 抗体通过。之后，加入含有抗 MDA5 抗体的患者血清。然后抗 MDA5 抗体将附着在 HeLa 细胞内的 MDA5 蛋白上。

之后，将辣根过氧化物酶附着的二抗部署到细胞中，然后二抗将附着在抗 MDA5 抗体上。最后，将色素原添加到细胞中并在辣根过氧化物酶偶联二抗存在下氧化，在光学显微镜下产生可见的颜色。阳性站立结果将显示如上图所示。

在今天的视频演示中，我们进入了医学研究的一个关键领域，即检测抗黑色素瘤分化相关基因五抗体，也称为抗 MDA5 抗体。这些自身抗体对间质性肺病患者，尤其是进展迅速的患者，起着至关重要的简单诊断指标，本研究的意义在于其对患者预后的潜在影响。早期准确检测 MDA5 自身抗体对于有效管理这种严重的自身免疫性疾病至关重要。

与筛选抗 MDA5 自身抗体的黄金方法相比，我们展示的方法的主要优势在于，与传统的放射性标记免疫访问测定相比，它可以更快地完成并节省时间和精力。效率的提高使我们能够处理更多样品并快速生成结果。此外，值得注意的是，与过渡免疫沉淀测定相比，我们的方法不仅具有卓越的效率，而且在安全性和成本效益方面也具有更高的安全性。

现在，让我们看看它是如何完成的。我的研究助理 Teo Kai Fa 将领导该程序。在加湿的 5%CO2 气氛中，用含有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素抗真菌剂的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基在 37 摄氏度下维持 HeLa 细胞。

每两到三天传代一次细胞，或当细胞达到 90% 至 100% 汇合度时传代。将 70， 000 个 HeLa 细胞放在 24 孔板的每个孔上。转染前 24 小时，并净化细胞，汇合率约为 90%。

在 25 微升还原血清培养基中稀释 500 纳克纤溶酶和 1.5 微升转染试剂。加入稀释的DNA，以一比一的比例做稀释的转染试剂。充分混合并孵育五分钟。

将混合物添加到一天前就位的细胞中，并搅拌以立即混合DNA脂质复合物。确认细胞汇合度为 80% 至 90%。将细胞在 37 摄氏度的加湿 5%CO2 半球中孵育 40 至 4 小时，然后进行免疫细胞化学。

我们使用市售因子。更多信息可以在材料表中找到。它们的转染效率为50%可以通过用表达质粒的冷冻蛋白转染细胞并传导西方血液来可视化靶蛋白的表达来确定转染的成功和靶蛋白的表达孵育后，用PBS洗涤细胞两次以去除任何残留的培养基。

可以通过摇动板或轨道振动器来进行洗涤。用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞注意。多聚甲醛有毒。

使用适当的处理指南。将细胞在室温下放置 15 分钟。接下来，处理固定试剂。

使用PBS洗涤细胞两次。应用 Triton 试剂，然后让细胞在室温下静置 10 分钟。我们使用浓度为 0.3% 的 PBS 中的 Triton X 400 10 分钟后，处理 Triton 试剂。

加入PBS洗涤细胞一次。下一步，用PBS中的10%胎牛血清进行封闭，并将细胞在室温下放置一个小时，取出封闭试剂。然后，加入PBS洗涤细胞一次。

将稀释的患者血浆添加到细胞中。使用前确保在 PBS 中以 1 比 5， 000 稀释的比例稀释患者血浆。根据需要调整稀释度以增强信号或减少背景，以确保结果无偏。

工作人员进行了测试，不知道哪些样本属于患者，哪些样本来自健康人。将样品在 4 摄氏度下孵育 12 至 16 小时。孵育期结束后，取出患者的样本并用PBS洗涤细胞三次。

用稀释的辣根过氧化物酶偶联山羊，抗人IgG在PBS中以1比250的比例稀释处理细胞。将细胞在室温下放置一个小时。一小时后，处理二抗。

用PBS冲洗三次。洗涤细胞后，每孔用300微升DAB工作溶液对细胞进行染色。DAB 工作溶液是按照制造商的说明通过缺少 DAB 促进浓缩液和 DAB 稀释剂制备的。

将细胞染色五分钟后，去除染料。去除染料后，用离子蒸馏水冲洗并摇晃五分钟。用稀释的血毒素复染细胞核。

我们用血毒素在喜欢a，在10倍稀释。等待五分钟进行染色过程。五分钟后，处理血毒素，然后用分析的蒸馏水洗涤两次，每次五分钟。

最后一步，在光学显微镜下观察染色结果。让我们来解释一下抗 MDA5 自身抗体的免疫细胞化学检测结果。一个积极的结果。

真阳性显示表达 MDA5 的 HeLa 内部有强烈的棕色染色。这证实了患者样本中的抗 MDA5 自身抗体。一个阴性结果。

阴性结果显示HeLa细胞没有棕色染色，表明没有抗MDA5自身抗体。假阳性结果。至关重要的是，假阳性显示所有细胞中都有广泛的棕色染色，无论MDA5s的表达如何。

这种非特异性染色必须将自身免疫性疾病与真阳性区分开来，以避免误诊。我们的方法提供了一种更快、更安全、更具成本效益的方法来检测抗 MDA5 器官抗体。这有可能显着影响患者在间质性肺病管理中的预后。

观看此视频后，您应该已经学会了如何执行免疫细胞化学程序以及如何识别测试结果中的临床相关性。