利用HeLa细胞和光学显微镜免疫细胞化学法检测抗MDA5自身抗体

以下实验的主要目的是利用免疫细胞化学方法检测抗MDA5抗体。该方法通过使用HeLa细胞，并将MDA5表达质粒转染至HeLa细胞中，使HeLa细胞表达MDA5蛋白，从而可被抗MDA5抗体结合。

加入表达MDA5构建体的HeLa细胞后，使用Triton试剂对HeLa细胞膜进行透化处理，以允许抗MDA5抗体进入细胞。随后加入含有抗MDA5抗体的患者血清，抗MDA5抗体将与HeLa细胞内的MDA5蛋白结合。

随后，将连接有辣根过氧化物酶的二抗加入细胞中，二抗会与抗MDA5抗体结合。最后，向细胞中加入显色底物，在辣根过氧化物酶标记的二抗存在下，显色底物被氧化，从而在光学显微镜下产生可见的颜色。阳性结果将呈现如上图所示的形态。

在今天的视频演示中，我们将深入探讨医学研究的一个关键领域——抗黑色素瘤分化相关基因5抗体（也称为抗MDA5抗体）的检测。这种自身抗体是间质性肺疾病患者的重要诊断指标，尤其对于快速进展型间质性肺疾病患者具有重要意义。本研究的重要性在于其对患者预后可能产生的深远影响。早期且准确地检测MDA5自身抗体，对于有效管理这一严重自身免疫性疾病至关重要。

我们所展示的方法相较于传统的抗MDA5自身抗体筛查方法的主要优势在于，其操作速度更快，与传统的放射性标记免疫沉淀法相比，能够节省大量时间和人力。这种更高的效率使我们能够处理更多的样本，并快速获得结果。此外，必须强调的是，与传统的免疫沉淀法相比，我们的方法不仅在效率上具有显著优势，而且在安全性和成本效益方面也表现更优。

现在，让我们来看一下具体操作。我的研究助理 Teo Kai Fa 将演示该实验流程。使用含 10% 胎牛血清和 1% 抗生素-抗真菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），在 37°C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养 HeLa 细胞。

每两到三天传代一次细胞，或当细胞融合度达到90%至100%时进行传代。在24孔板的每个孔中接种70,000个HeLa细胞。转染前24小时，将细胞接种至培养板，使其融合度约为90%。

将500纳克的纤溶酶和1.5微升转染试剂分别加入25微升低血清培养基中稀释。按1:1的比例将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂混合。充分混匀，室温孵育5分钟。

将混合物加入前一天接种的细胞中，并立即轻轻振荡以混匀DNA-脂质复合物。确认细胞融合度达到80%至90%。将细胞在37°C、含5% CO2的加湿培养箱中孵育40至4小时，随后进行免疫细胞化学检测。

我们使用一种市售的因子。更多详细信息请参见材料表。其转染效率为50%。转染成功及目标蛋白的表达可通过将细胞转染冻存的表达质粒后进行蛋白质印迹（western blot）来检测目标蛋白的表达情况进行确定。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，以去除残留的培养基。

可通过振荡平板或使用轨道摇床进行洗涤。用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞，注意：多聚甲醛具有毒性。

遵循适当的处理规范。将细胞在室温下放置15分钟。随后，妥善处理固定剂试剂。

用 PBS 清洗细胞两次。加入 Triton 试剂，然后在室温下孵育 10 分钟。我们使用的 Triton X-400 浓度为 0.3%，溶于 PBS 中。孵育 10 分钟后，弃去 Triton 试剂。

加入 PBS 洗涤细胞一次。下一步，使用含 10% 胎牛血清的 PBS 进行封闭，室温孵育细胞 1 小时。移除封闭液。然后，加入 PBS 洗涤细胞一次。

将稀释后的患者血浆加入细胞中。使用前务必用 PBS 将患者血浆按 1:5,000 的比例稀释。根据需要调整稀释比例，以增强信号或降低背景，确保结果无偏倚。

工作人员在进行检测时，对哪些样本来自患者、哪些来自健康个体均不知情。将样本在4°C下孵育12至16小时。孵育结束后，取出患者的样本，并用PBS洗涤细胞三次。

用 PBS 按 1:250 的比例稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人 IgG，加入细胞中进行孵育，在室温下放置 1 小时。1 小时后，弃去二抗。

用 PBS 冲洗三次。洗涤细胞后，每孔加入 300 微升 DAB 工作液进行染色。DAB 工作液的配制方法是按照生产商说明书，将 DAB 增强浓缩液与 DAB 稀释液混合而成。

染色细胞5分钟后，去除染液。去除染液后，用离子化蒸馏水冲洗并振荡5分钟。用稀释的伊红对细胞核进行复染。

我们使用血毒素，按10倍稀释比例加入。染色过程等待五分钟。五分钟后，弃去血毒素，然后用分析级蒸馏水洗涤两次，每次五分钟。

最后一步，在光学显微镜下观察染色结果。让我们解读抗MDA5自身抗体的免疫细胞化学检测结果：阳性结果。

真阳性结果显示表达MDA5的HeLa细胞内有明显的棕褐色染色，证实患者样本中存在抗MDA5自身抗体。阴性结果。

阴性结果表现为HeLa细胞无棕褐色染色，表明无抗MDA5自身抗体。假阳性结果中，无论MDA5表达情况如何，所有细胞均呈现广泛的棕褐色染色。

在各种自身免疫性疾病中观察到的这种非特异性染色必须与真正的阳性结果加以区分，以避免误诊。我们的方法提供了一种更快、更安全且更具成本效益的方式来检测抗MDA5器官特异性抗体，有望显著改善间质性肺病患者管理中的临床预后。

观看本视频后，您将学会如何进行免疫细胞化学实验操作，以及如何识别检测结果中具有临床意义的信息。