Name: 荧光标记以可视化斑马鱼中的低表达蛋白质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 了解荧光蛋白标记技术用于斑马鱼低丰度蛋白质可视化研究。该方法简化了供体构建流程，优化了成像效率，为神经科学与蛋白质研究提供了可靠工具。

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我们感谢厦门大学卢周对本文稿的校对和编辑。本工作得到国家自然科学基金（项目编号 82388201，J.H.；项目编号 31801158，Y.Z.）和国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2020YFA0803500，J.H.）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（CIFMS）（2019-I2M-5-062，J.H.）；福建省中央引导地方科技发展专项（2022L3079，J.H.）；福厦泉自主创新示范区协同创新项目（3502ZCQXT2022003，J.H.）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策及稿件撰写过程中均未参与。

所有斑马鱼的饲养和实验均经过厦门大学实验动物管理与伦理委员会审查和批准，并严格遵守厦门大学实验动物中心规定的良好动物实验规范。本研究符合所有相关的动物使用伦理规定。
注意：所有成年及幼体斑马鱼均按照标准方案在厦门大学斑马鱼养殖系统中饲养，温度为 28.5 °C，光照周期为 13 小时光照/11 小时黑暗。胚胎置于胚胎缓冲液（表 1）中，在可控培养箱内培养（温度：28 ± 0.5 °C；光照：13 小时光照/11 小时黑暗周期）。所有斑马鱼的喂养和常规监测每日进行两次（上午 9 点和下午 4 点）。本研究使用的野生型（WT）品系为 Tübingen（Tü）。
1. 选择目的基因并设计向导RNA
<ol>
	<li>了解目标基因的相关信息。在数据库（https://zfin.org/）中进行检索，并确认已知该基因的变异体数量。确定要操作的变异体，并从 Ensembl（https://www.ensembl.org/）下载目标基因的信息，包括基因组序列、cDNA 序列和编码序列（CDS）。在序列中标注外显子、内含子、UTR 区域、起始密码子和终止密码子。</li>
	<li>选择目标基因终止密码子（TAA、TAG 或 TGA）上游不超过 200 bp 的 CDS 区域作为 sgRNA 靶向区域。 
	注意：最好通过 DNA 测序确认该区域无单核苷酸多态性（SNPs）。</li>
	<li>使用 CRISPRscan 网站（https://www.crisprscan.org/）在选定的靶向区域内设计候选 sgRNA，并预测其编辑效率。&#160;
	<ol>
		<li>将 DNA 序列输入设计框中。</li>
		<li>选择相应参数，包括物种、脱靶位点允许的最大错配数、核酸酶类型和启动子。本例中选择 斑马鱼- Danio rerio，不允许错配，Cas9-NGG，以及 体外 T7 启动子。</li>
		<li>点击 获取 sgRNA 以获得若干候选 sgRNA。从中选择 5–7 个 CRISPRscan 评分高且脱靶评分低的 sgRNA，用于后续的 体内 筛选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计位于 sgRNA 靶位点两侧的 PCR 引物，扩增产物长度约为 500 bp，用于后续的 PCR 扩增、酶切检测和测序，以验证 sgRNA/Cas9 显微注射后的基因敲除效率。上下游区域各选择约 20 bp 的序列，确保其 GC 含量约为 50%，Tm 值在 50–55°C 范围内。 
	注意：如需进行引物组合，可分别设计两条上游引物和两条下游引物。</li>
</ol>
2. sgRNA 的制备
注意：常用的sgRNA支架序列（图1）已克隆至质粒中（材料表）。
<ol>
	<li>使用所示引物和PCR混合物对T7启动子-sgRNA连接序列进行PCR扩增 表2 和 表3，分别进行。在PCR仪中运行PCR程序 表4. 进行凝胶电泳（琼脂糖凝胶，1.2% 琼脂糖溶于TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]; 200 V；约5分钟）取2 µL PCR产物进行电泳，以确认产物正确（分子量约为150 bp）。</li>
	<li>使用纯化试剂盒纯化PCR产物（材料表）或其他商业试剂盒，按照制造商说明书操作。 
	注意：此后应使用无RNase的试剂和材料，并需特别小心操作，以避免RNase污染（详见讨论部分）。
	<ol>
		<li>将结合缓冲液以5:1的体积比加入PCR产物中并混匀。将混合液加入置于2 mL收集管中的柱子中。在17,900 × g 在25 °C下孵育1分钟。弃去流出液，将柱子放回原来的收集管中。</li>
		<li>向柱中加入 750 µL 洗涤缓冲液，于 17,900 × g 在25 °C下孵育1分钟。弃去流出液，将柱子放回原来的收集管中。在17,900 × g 25 °C 下孵育 2 分钟。将柱置于干净的 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>向柱中加入 20 µL 无核酸酶水，于 17,900 × g 在25 °C下孵育2分钟，以洗脱DNA，并使用分光光度计测定其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用T7 RNA合成系统 材料表 或同等试剂盒 体外 转录250 ng纯化后的DNA。操作和条件需保持无RNase。
	<ol>
		<li>在无RNase的PCR管中按以下步骤准备反应 表3，轻轻混匀。在金属浴中37 °C孵育2小时。</li>
		<li>加入0.5 µL DNase I（无RN酶），轻轻混匀。在金属浴中37 °C孵育15–20分钟。</li>
		<li>乙醇沉淀
		<ol>
			<li>向每种反应体系中加入无RN酶水，使最终体积达到20 µL，并将样品转移至1.5 mL离心管中。</li>
			<li>加入50 µL 100%乙醇（2.5倍体积，RNase-free），充分混匀，将混合物置于冰上10分钟，然后在21,000 × g 4 °C 下 15 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，用500 µL 75%乙醇（无RNase）洗涤沉淀，然后在21,000 × g 4 °C下离心5分钟。</li>
			<li>弃去上清液，将沉淀物置于金属浴中45 °C干燥，再用40 µL无RNase水溶解。 
			注意：对于敲入（KI），sgRNA需要进行LiCl沉淀（见下文），但对于敲除（KO）则无需此步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>运行琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶：1.2% 琼脂糖溶于TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]; 200 V；约5分钟）取1-2 µL RNA进行电泳以评估其质量，然后使用分光光度计测定浓度。 
		注意：sgRNA 可在 -20 °C 或 -80 °C 保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Cas9 mRNA 的制备
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用 XbaI 对 Cas9 质粒（材料表）进行酶切消化，时间超过 1.5 小时（反应体系见 表 3）。取 1 µL 进行琼脂糖凝胶电泳检测（琼脂糖凝胶：1.2% 琼脂糖溶于 TAE 缓冲液；TAE 缓冲液 [表 1]；200 V；约 10 分钟），以确认消化完全。</li>
	<li>以与 sgRNA PCR 产物相同的方法进行产物纯化（步骤 2.2.1–2.2.3）。自此步骤起，需使用无 RNase 的耗材并进行无 RNase 操作。</li>
	<li>使用 T3 体外转录试剂盒（材料表）或等效试剂盒进行 Cas9 mRNA 的 in vitro 转录。
	<ol>
		<li>根据 表 3 在无 RNase 的 PCR 管中配制反应体系，轻轻混匀。37 °C 孵育超过 2.5 小时。</li>
		<li>加入 1 µL 无 RNase 的 Turbo DNase，37 °C 孵育 15–20 分钟。</li>
		<li>LiCl 沉淀
		<ol>
			<li>将样品转移至 1.5 mL 离心管中，加入 30 µL LiCl（1.5 倍体积），轻轻混匀。</li>
			<li>置于 -20 °C 约 30 分钟，然后在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 30 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，用 500 µL 75% 乙醇（无 RNase）洗涤沉淀，在 4 °C 下以 21,000 × g 离心 5 分钟。</li>
			<li>弃去上清液，在 45 °C 下干燥沉淀，加入 40 µL 无 RNase 水溶解。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计测定 Cas9 mRNA 的浓度。取 1–2 µL RNA 进行琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶：1.2% 琼脂糖溶于 TAE 缓冲液；TAE 缓冲液 [表 1]；200 V；约 10 分钟），以检测浓度和质量。 
	注意：OD 260/280 比值应高于 2.0，浓度应达到或超过 1000 ng/µL。Cas9 mRNA 可储存于 -20 °C 或 -80 °C 以备后续使用。</li>
</ol>
4. 显微注射的准备工作
<ol>
	<li>准备斑马鱼：显微注射前一晚，将一条健康的雌性斑马鱼和两条健康的雄性斑马鱼放入交配缸中，使用隔板将雌雄分隔开，以准备交配。</li>
	<li>配制4%琼脂糖、裂解缓冲液和胚胎缓冲液（pH 8.0）（表1）。</li>
	<li>准备显微注射用毛细玻璃针（材料表）。</li>
	<li>制备显微注射用琼脂糖板：将35 mL熔化的4%琼脂糖倒入10 cm的培养皿中，轻轻放入塑料模具以形成楔形凹槽。通过轻敲模具避免产生气泡。待其凝固后，加入一些双蒸水（ddw），并将该培养皿置于4 °C保存备用。</li>
</ol>
5. 通过显微注射测试sgRNA效率
<ol>
	<li>显微注射当天，在无RNase环境中将显微注射混合液置于冰上配制，具体成分见表5。</li>
	<li>使用无RNase的移液枪头（材料表）将显微注射溶液吸入注射针中。注意避免产生气泡。</li>
	<li>将装有溶液的注射针安装至连接显微注射仪的显微操作器上。在显微镜下用尖头镊子剪断注射针尖端，轻轻夹住针尖使其断裂。然后调节注射压力，直至针尖能稳定喷出体积为1 nL的液滴，液滴体积通过载物台测微尺和毛细管进行定量。</li>
	<li>移除隔离板，让鱼类交配约6分钟。收集并转移单细胞期胚胎至含有胚胎缓冲液的培养皿中。
	<ol>
		<li>在光学显微镜下检查胚胎健康状况，去除未受精卵或碎片。另取20个健康胚胎作为未注射对照组，置于单独的培养皿中并做好标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用小刷子将健康的单细胞期胚胎转移并轻轻排列在已预温至室温（RT）的显微注射板的凹槽中。去除多余的缓冲液。</li>
	<li>所有后续操作均在体视显微镜下进行。用注射针尖轻轻调整胚胎位置，使动物极朝向注射针。向动物极注射1 nL混合溶液。</li>
	<li>每种sgRNA注射约100个胚胎即可满足实验需求。注射完成后，用胚胎缓冲液轻轻冲洗胚胎，转移至六孔板中，并将培养皿放入28.5 °C恒温培养箱。受精后约10小时（hpf），在体视显微镜下观察胚胎发育情况，去除死亡胚胎。</li>
	<li>在24 hpf时，将胚胎收集至1.5 mL离心管中用于基因型鉴定（每种sgRNA分3管，每管5个胚胎）。小心用移液器吸除多余液体，每管加入含蛋白酶K的裂解缓冲液100 µL（终浓度为0.5 mg/mL），56 °C孵育1小时，随后95 °C孵育15分钟。</li>
	<li>加入200 µL乙醇（2倍体积），充分混匀，于室温下以19,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀，于室温下以19,000 × g离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，室温下干燥沉淀，加入50 µL ddH₂O溶解。取1 µL提取物用于配制PCR反应体系（见表3）（PCR引物见步骤1.4）。</li>
	<li>取2 µL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（凝胶：1.2%琼脂糖TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]；200 V；约10分钟），以确认PCR扩增成功，随后进行酶切反应（表3）以评估sgRNA的编辑效率。轻轻混匀酶切反应体系，按照试剂生产商推荐的温度和时间进行孵育。</li>
	<li>对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（凝胶：1.2%琼脂糖TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]；200 V；约10分钟），同时以未酶切的PCR产物作为对照，以确认酶切是否发生。 
	注：Cas9切割位点位于PAM序列上游约3 bp处，因此限制性内切酶识别位点最好覆盖PAM上游6 bp区域。若sgRNA编辑效率高，切割后错配修复将导致插入或缺失（indels），限制性内切酶可能无法再识别切割位点；若sgRNA效率低，限制性内切酶识别位点保持完整，则可正常发生酶切。通过琼脂糖凝胶电泳可判断酶切是否发生。</li>
	<li>若无合适的限制性内切酶识别位点，可对PCR产物进行测序，并通过TIDE工具（https://tide.nki.nl/）分析sgRNA编辑效率。&#160;注意需同时对野生型（WT）基因组DNA进行PCR扩增和测序作为对照。
	<ol>
		<li>打开网站，点击Start TIDE。在Guide sequence框中输入sgRNA的引导序列。</li>
		<li>在Control Sample Chromatogram (.ab1 or .scf)下方点击Browse，上传野生型对照样本的测序结果；在Test Sample Chromatogram (.ab1 or .scf)下方点击Browse，上传编辑样本的测序结果。</li>
		<li>点击Update View。网站将显示两个序列之间的差异百分比，百分比越大表示sgRNA编辑效率越高。敲除效率高于80%的sgRNA适用于后续的KI实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用于荧光蛋白标记的供体质粒构建
<ol>
	<li>设计将首先克隆到质粒中，然后进一步插入鱼类基因组的序列，如图2所示：预测Cas9切割位点上游的25 bp序列设计为左同源臂，预测Cas9切割位点下游的25 bp序列作为右同源臂。将CDS引入供体质粒中sgRNA靶位点与终止密码子之间，以维持内源基因的完整性。 
	注意：互补的CDS（图2中的元件4）的5'端需要进行同义突变，以避免sgRNA/Cas9复合物对重组基因组产生二次切割。</li>
	<li>使用外切酶III（材料表）进行无缝克隆（LIC）14构建供体质粒。其他方法如Gibson组装也可行。克隆引物如图2所示。元件&#34;1&#34;、&#34;2&#34;、&#34;3&#34;和&#34;4&#34;由引物携带：
	<ol>
		<li>设计引物F1，其由与载体重叠的序列、元件&#34;1&#34;以及部分元件&#34;2&#34;组成。</li>
		<li>设计引物R2，其由部分元件&#34;1&#34;、元件&#34;2&#34;以及元件&#34;3&#34;组成。</li>
		<li>设计引物F2，其由元件&#34;3&#34;、&#34;4&#34;以及sgRNA靶位点后CDS的5'序列组成。</li>
		<li>设计引物R1，其由基因CDS的3'序列以及与载体重叠的序列组成。</li>
		<li>以斑马鱼cDNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。 
		注意：建议引物之间或引物与载体之间的重叠区域为15–20 bp。本实验中cx39.9和cx44.1基因的引物示例见表2。该设计此前已有成功应用13。详细的质粒图谱见补充文件1和补充文件2。cx39.9和cx44.1的DNA及蛋白序列设计见补充文件3。</li>
		<li>以与sgRNA PCR产物相同的方法纯化PCR产物（步骤2.2.1–2.2.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的限制性内切酶对供体载体（图3和表6）进行酶切。本示例中使用的酶为PciI和Acc65I（材料表）。按照制造商说明书操作（表3）。以与sgRNA PCR产物相同的方法纯化酶切后的供体载体（步骤2.2.1–2.2.3）。</li>
	<li>通过DNA凝胶电泳（DNA凝胶：1.2%琼脂糖TAE缓冲液；TAE缓冲液[表1]；200 V；约10分钟）对纯化的PCR片段和酶切供体载体进行定量。根据表3配制LIC反应体系。 
	注意：所有离心管和反应组分均应置于冰上，反应及所有操作均需在冰上进行。将1 µL Exo III（20单位）作为最后一个组分加入反应体系，立即用移液器吹打混匀。请务必设置一个不含PCR片段的反应体系作为对照，以检测酶切载体自退火的可能性。</li>
	<li>立即将反应体系置于冰上，孵育60分钟。</li>
	<li>加入1 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）终止反应，吹打混匀，随后在60 °C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。</li>
	<li>使用LIC产物转化感受态细胞（如DH5α），并在含适当抗生素（本例中为氨苄青霉素）的LB平板（材料表和表1）上培养细菌16小时。</li>
	<li>确保含PCR片段的平板上的菌落数量级显著高于对照平板。从LIC平板上挑取单克隆进行酶切分析和DNA测序。</li>
	<li>使用纯化试剂盒以与sgRNA PCR产物相同的方法提取并纯化正确的供体质粒（步骤2.2.1–2.2.3）。确保最终浓度高于300 ng/µL。</li>
</ol>
7. 斑马鱼胚胎基因敲入的显微注射
<ol>
	<li>执行上述所有显微注射操作，但显微注射溶液的制备需根据表7进行。</li>
</ol>
8. 筛选与鉴定荧光蛋白标记的子代
<ol>
	<li>显微注射后12-48小时，在体视荧光显微镜下观察荧光。</li>
	<li>采用新建立的筛选方法13。若观察到明显荧光，则挑选出荧光幼鱼并进行培育；若仅观察到微量荧光甚至无荧光，则将所有注射后的幼鱼均进行培育。</li>
	<li>在1月龄时，使用0.02%三卡因对显微注射的斑马鱼进行麻醉（表1）。对每条斑马鱼，取其尾鳍一小片组织放入标记好的PCR管中，并将对应编号的麻醉后斑马鱼保留在六孔板的一个孔中，孔内含经紫外灭菌的过滤水（pH 7.2），且标签一致。</li>
	<li>采用碱裂解法（裂解缓冲液见表1）15提取基因组DNA，随后进行5'-连接PCR。在左侧同源臂上游设计正向引物，在插入片段上设计反向引物（图4）。PCR产物大小约为500 bp。引物设计示例见表2。 
	注意：对于具有荧光的斑马鱼，该PCR用于验证敲入（KI）的准确性，因此PCR产物需进行测序；对于无荧光的斑马鱼，该PCR用于验证是否发生敲入。挑选出PCR阳性个体，并将其培育至性成熟，作为F0代。</li>
	<li>通过交配筛选获得的F0代与野生型（WT）斑马鱼，获得F1胚胎，观察其GFP表达模式，并通过连接PCR进行基因型鉴定。 
	注意：若在F1代中检测到目标插入（无论是否完全准确），则将对应的F0代定义为可遗传的F0代，其PCR产物需进一步测序。若插入准确，则将该F0代定义为理想的F0代。</li>
	<li>当获得理想的F0代后，利用其子代进行成像，以观察和追踪目标蛋白。</li>
</ol>
9. 成像与数据处理
<ol>
	<li>确定需要成像的发育阶段，提前准备好斑马鱼。如有必要，向鱼液中加入稀释的1-苯基-2-硫脲（PTU；0.003%，材料表）以去除色素。 
	注意：若在24小时后（hpf）再添加PTU，其效果会降低。本示例中，PTU在24 hpf前已加入胚胎缓冲液中，并持续保留在缓冲液中直至48 hpf，即斑马鱼幼鱼进行成像处理时。</li>
	<li>将2 mL融化的4%琼脂糖（表1）加入35 mm培养皿中，静置使其凝固。将斑马鱼转移至含有0.02%三卡因（表1）的胚胎缓冲液中。</li>
	<li>将200 µL融化的4%琼脂糖加入1 mL去离子水中稀释。当琼脂糖冷却时，用1 mL移液器将麻醉后的斑马鱼转移至稀释的琼脂糖溶液中。轻轻混匀后，将用于固定斑马鱼的稀释琼脂糖转移至步骤9.2中已制备好的、含有凝固4%琼脂糖凝胶的培养皿中。</li>
	<li>调整斑马鱼的位置，使待观察区域朝上。</li>
	<li>按照制造商说明，使用直立式共聚焦荧光显微镜进行成像和数据处理（材料表）。</li>
</ol>

Fluorescent Protein Tagging in Zebrafish Larvae Using CRISPR/Cas9 Knock-In

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</ol>

所有作者声明本文不存在利益冲突。

为了顺利且成功地进行本实验，应更加关注一些重要方面。斑马鱼注射的最佳发育阶段应为单细胞期。在此阶段内完成注射，可确保后续分裂产生的所有细胞均含有实现定点插入（KI）所需的组分，从而提高所有细胞同时发生KI的概率，并提升KI的整体成功率。降低环境温度会减缓斑马鱼胚胎的发育速度18。然而，胚胎长时间暴露于低温环境会增加死亡率。因此，我们强调不应将胚胎直接放置在冰上或冷金属台上，也不应使其长时间处于低温环境中。相反，我们维持相对较低的环境温度（16 °C），以适度减缓胚胎发育速度，从而为注射争取充足时间，注射操作应尽可能快速完成。通常情况下，约100枚胚胎的注射可在30分钟内完成。之后，应立即将胚胎转移至28.5 °C的恒温培养箱中，以最大程度地保证其存活能力。
注射到胚胎中的液体体积应严格控制在约 1 nL。体积过低会降低敲入效率，而体积过高则会导致胚胎死亡。根据我们的观察，健康的斑马鱼胚胎能够耐受 1 nL 的注射体积，且不影响胚胎的存活和发育。因此，我们选择 1 nL 以确保较高的敲入效率和存活率。
<p class="jov...

作为一种被广泛接受的模式生物，斑马鱼（Danio rerio在发育、再生、肿瘤发生、感染和免疫等领域的科学研究中被广泛应用1,2,3,4,5斑马鱼特别适用于 体内 使用PTU（1-苯基-2-硫脲）处理后进行活体成像，PTU是一种抑制黑色素生成的有毒化合物，可使斑马鱼幼鱼在相对较长时间内保持透明状态6. 经基因改造的透明斑马鱼品系，例如 casper7 和晶体8，也可用于实现活体可视化及谱系追踪直至成年。除了这些旨在克服成年鱼类色素干扰以改善活体成像效果的努力外，我们的研究还致力于开发高效的基因编辑策略，以提高荧光蛋白标记的效率并减少人为干预。
基于CRISPR/Cas9介导的微同源末端连接（MMEJ）的基因敲入技术由于具有相对较高的敲入效率，现已被广泛应用于包括斑马鱼在内的多种生物体的遗传修饰中9,10,11,12. 为实现成功 体内 成像过程中需要解决两个挑战：一是重组过程引入的插入缺失突变（indels）或疤痕；二是某些目标基因内源性表达水平较低，导致共表达的荧光标签信号微弱，从而无法成功检测 体内 检测。为了实现高效且准确的蛋白质标记，并尽量减少对内源性基因表达水平的干扰，近期一项研究报道了一种优化策略，该策略结合了荧光信号放大技术 &#34;VH&#34; 标记方法与优化的生殖系筛选流程13，该方法通过优化供体质粒骨架并结合聚合酶链式反应（PCR）与荧光验证，更适用于低表达基因的荧光标记，在实现生殖系筛选时比以往方法更高效，且耗时和工作量成本最低。本文提供了该报道方法的详细分步操作流程，包括胚胎制备与斑马鱼饲养、sgRNA设计等步骤， 体外 sgRNA的转录 体外 Cas9 mRNA转录，斑马鱼胚胎显微注射 体内 筛选效率最高的sgRNA，供体质粒的设计与构建，定点整合斑马鱼的基因分型，定点整合生殖系筛选，以及定点整合斑马鱼的成像与表型分析。该一体化实验方案提供了一种前沿的荧光标记方法，无疑将推动斑马鱼在各个科学领域的研究应用，并使来自不同学术背景的读者受益。

<table><tbody><tr><td>1000 &amp;micro;L&amp;nbsp; 吸头</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于所有操作</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于各种溶液的储存和离心</td></tr><tr><td>1.5 mL 无RNase离心管</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于无RNase溶液的储存和离心</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 吸头</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于所有操作</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 无RNase吸头</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于无RNase操作</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L&amp;nbsp; 无RNase吸头</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于无RNase操作</td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>用于抑制黑色素生成，保持幼鱼透明</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于所有操作</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 无RNase吸头</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于无RNase操作</td></tr><tr><td>2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)</td><td>Vazyme</td><td>P213-03</td><td>用于sgRNA效率检测的PCR</td></tr><tr><td>35-mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>用于成像</td></tr><tr><td>6孔板</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于斑马鱼个体饲养和临时培养</td></tr><tr><td>Acc65I</td><td>NEB</td><td>R0599S</td><td>用于酶切消化</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td>用于TAE缓冲液配制</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Biofroxx</td><td>8211GR500</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sangon</td><td>A610028</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>用于胚胎缓冲液配制</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0016</td><td>用于制备显微注射针头</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>任意品牌</td><td>内径（ID）= 0.1 mm</td><td>用于定量1-nL液滴</td></tr><tr><td>CRISPRscan</td><td>CRISPRscan</td><td>&amp;nbsp;http://www.crisprscan.org/</td><td>用于sgRNA设计</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td>用于转化</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>用于裂解缓冲液和TAE缓冲液配制</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>Ensembl</td><td>&amp;nbsp;https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index</td><td>用于查找基因信息</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>HUSHI</td><td>64-17-5</td><td>用于DNA纯化和提取</td></tr><tr><td>外切酶III</td><td>Takara</td><td>2170A</td><td>LIC</td></tr><tr><td>气动显微注射仪</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>凝胶电泳系统</td><td>WIX</td><td>WIX-EP3000</td><td>用于凝胶电泳</td></tr><tr><td>手套</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于所有操作</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>sgdbio</td><td>10010518</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sangon</td><td>A501745</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>gRNA-pMD19-T</td><td>中国斑马鱼资源中心（CZRC）</td><td>CZP3</td><td>含sgRNA骨架的sgRNA质粒</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>用于胚胎缓冲液配制</td></tr><tr><td>氯化锂沉淀溶液</td><td>Thermofisher</td><td>AM9480</td><td>用于sgRNA沉淀，无RNase</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Sangon</td><td>A600015</td><td>用于制备4%琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>sgdbio</td><td>20025118</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>金属浴</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于恒温孵育</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>用于胚胎缓冲液配制</td></tr><tr><td>显微注射模具</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>用于在显微注射过程中固定胚胎的沟槽制作</td></tr><tr><td>微量加样器，用于填充Femtotips及其他玻璃毛细管，无菌，0.5 &amp;ndash; 20 &amp;micro;L，100 mm，浅灰色，192个（2架 &amp;times; 96个）</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>用于将显微注射溶液装入注射针头，无RNase</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>用于制备注射针头</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>用于所有操作</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于制备注射板和琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>MinElute PCR纯化试剂盒（50）</td><td>QIAGEN</td><td>28004</td><td>用于纯化PCR产物和酶切产物，无RNase</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1348</td><td>用于Cas9 mRNA的体外转录，无RNase</td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>用于胚胎缓冲液和裂解缓冲液配制</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>用于胚胎缓冲液配制</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sangon</td><td>A100173</td><td>用于TAE缓冲液配制</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermofisher</td><td>R0581</td><td>用于RNA相关操作，无RNase</td></tr><tr><td>PciI</td><td>NEB</td><td>R0655S</td><td>用于酶切消化</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>PCR条形管</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于PCR</td></tr><tr><td>PCR管</td><td>FEITONGKANG</td><td>blp-200</td><td>用于PCR</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于斑马鱼幼体饲养等</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>用于显微注射，无RNase</td></tr><tr><td>移液器支架</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-PH1</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>PrimeStar（预混液）</td><td>Takara</td><td>DR040A</td><td>用于分子克隆</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Merck</td><td>539480</td><td>用于基因组DNA提取</td></tr><tr><td>pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)</td><td>中国斑马鱼资源中心（CZRC）</td><td>CZP11</td><td>Cas9质粒模板</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于RNA相关离心</td></tr><tr><td>天平</td><td>Sartorius</td><td>BCE124-1CCN</td><td>用于制备注射板和琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于剪取成年鱼尾鳍</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sangon</td><td>A600485</td><td>用于裂解缓冲液配制</td></tr><tr><td>小毛刷</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于在显微注射板上轻柔移动胚胎</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermofisher</td><td>NanoDrop 2000</td><td>用于DNA/RNA浓度测定</td></tr><tr><td>台式显微尺</td><td>任意品牌</td><td>分度值（DIV）= 0.01 mm</td><td>用于定量1-nL液滴</td></tr><tr><td>立体荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>用于基因表达观察</td></tr><tr><td>立体显微镜</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>用于观察和显微注射</td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express 大规模RNA生产系统</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>用于sgRNA的体外转录，无RNase</td></tr><tr><td>温控培养箱</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于胚胎培养</td></tr><tr><td>TIDE</td><td>TIDE</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td>用于sgRNA效率分析&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>用于三卡因溶液配制</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A600194</td><td>用于三卡因溶液、裂解缓冲液和TAE缓冲液配制</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>镊子</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于切割注射针头</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td>用于酶切消化</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>用于LB平板</td></tr><tr><td>斑马鱼养殖系统</td><td>ESEN</td><td>ESEN-AW-S1</td><td>用于成年鱼养殖</td></tr><tr><td>斑马鱼交配缸（带隔板）</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td>用于鱼类交配</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 900+Airyscan2</td><td>ZEISS</td><td>Zeiss LSM900</td><td>用于荧光标记鱼的共聚焦成像和数据分析</td></tr><tr><td>ZFIN网站</td><td>ZFIN</td><td>http://zfin.org/</td><td>用于查找基因信息</td></tr></tbody></table>

荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9介导的敲入（KI）技术可实现斑马鱼中更便捷的荧光蛋白标记Danio rerio），一种优选的模式生物 体内 由于其在早期发育阶段具有透明性，斑马鱼适用于活体成像。本文提供了一套详细的实验方案，用于在斑马鱼幼鱼中实现高效荧光基因敲入（KI）、快速筛选KI founder个体以及低丰度蛋白的示踪，为后续开展斑马鱼生理与病理生理学研究奠定关键基础。本方案涵盖了针对目标基因的sgRNA设计、sgRNA体外转录、Cas9 mRNA合成、显微注射条件优化、突变体筛选及阳性后代鉴定等完整步骤。 体外 转录，Cas9 mRNA 体外 转录， 体内 sgRNA筛选效率最高的个体，供体质粒的设计与构建，斑马鱼幼体的显微注射，KI founder的筛选及斑马鱼活体成像。本文包含并讨论了该方案的关键步骤、故障排除建议、质量控制方法以及优势与应用。该方案成本低、结果快速且准确，已通过多次实验验证。

由称为连接蛋白（connexins）的聚合蛋白组成的间隙连接，对于相邻细胞之间低分子量代谢物和离子的交换至关重要。上述荧光蛋白标记方法分别用于标记connexin 39.9（图5A）和connexin 44.1（图5B）。通过连接PCR验证了正确的基因敲入（KI）（图6）。与已发表的数据一致16，在所有F1子代的肌肉中均观察到可遗传的特异性荧光，表明connexin 39.9的GFP标记成功（图5A）。与先前报道一致17，在所有F2子代的晶状体中检测到可遗传的特异性荧光，提示connexin 44.1的mCherry标记成功；在此情况下，F0代未观察到荧光，但在按照本实验...

在此，我们介绍一种在斑马鱼幼鱼中用荧光蛋白标签标记蛋白质的实验方案，该方案为新近开发并经过改进的方法 体内 该系统特别适用于可视化斑马鱼中低丰度蛋白。

CRISPR/Cas9介导的敲入（KI）技术使得在斑马鱼（Danio rerio）中更便捷地进行荧光蛋白标记成为可能，斑马鱼是活体成像研究中首选的模式生物。

该产品经过优化，可用于平衡带有荧光蛋白标签的蛋白质，并可视化斑马鱼实验室个体中目标蛋白的定位与表达情况。它特别适用于对低丰度表达的蛋白质进行成像。我们的方法简化并加速了供体质粒的构建过程。除CDS外，这些组分均预先整合至载体骨架中。供体质粒也经过优化以提高效率。该递送筛选流程以最低的时间和劳动成本富集可遗传的细胞核。斑马鱼是感染与免疫研究中广泛使用的模式生物。我们尤其关注脓毒症背后的机制。由于现在能够通过我们的方案轻松实现荧光标记，我们将尝试对斑马鱼中的图像、脓毒症相关蛋白和细胞进行标记。首先，将一条健康的雌性斑马鱼和两条健康的雄性斑马鱼放入交配缸中。使用隔板将雄鱼与雌鱼分隔开，以准备交配。在显微注射当天，于RNase-free环境中将显微注射混合液置于冰上配制。使用无 RNase 的移液器吸头，将显微注射溶液吸入针头中。将装有溶液的针头放入连接至显微注射仪的显微操作器中。在显微镜下，用尖头镊子轻轻夹住针头尖端，使其断裂，从而切断针头末端。调节注射压力，直至针头持续喷出一纳升的液滴。接着，从交配缸中移除隔板，让鱼类交配六分钟。收集并转移单细胞期胚胎至含有胚胎缓冲液的培养皿中。在光学显微镜下检查胚胎的健康状况，并移除未受精的卵子或碎片。将20个健康的胚胎置于另一个培养皿中作为未注射对照组，并标记该培养皿。使用小刷子将健康的一细胞期胚胎转移至已预热至室温的显微注射板的凹槽中，并轻轻排列整齐。从培养板中移除多余的缓冲液。借助针尖，轻轻调整每个胚胎的位置，使动物极朝向针尖。将一纳升混合溶液注入动物极。注射后，用胚胎缓冲液将胚胎轻轻冲洗至6孔板中。将6孔板放入28.5°C恒温培养箱中。受精后10小时，在体视显微镜下观察胚胎发育情况，并移除死亡胚胎。受精后24小时，将胚胎收集到1.5毫升离心管中用于基因分型，并小心弃去多余的水。每管加入含有蛋白酶K的100微升裂解缓冲液。先在56摄氏度孵育1小时，然后在95摄氏度孵育15分钟。孵育后，加入 200 微升乙醇并充分混匀。将离心管在 19,000 G 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，然后用 500 微升 70% 乙醇重悬沉淀。再次离心后，将沉淀空气干燥，再溶于 50 微升双蒸水中。使用一微升提取物制备PCR反应体系。PCR反应完成后，取两微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增是否成功。通过酶切消化反应评估sgRNA的效率。轻轻混匀消化液，并在室温下孵育，具体操作遵循制造商说明书。将消化产物与未消化的PCR对照样品一同进行琼脂糖凝胶电泳，以确认消化效果。为分析sgRNA效率，请打开TIDE网站并点击“Start TIDE”。将sgRNA的引导序列输入至引导序列框中。单击“浏览”按钮，将野生型对照的测序结果上传至对照样本色谱图字段。同样，将编辑后样本的测序结果上传至测试样本色谱图字段。单击“更新视图”以分析结果。首先，使用不依赖连接酶的克隆方法（LIC）结合核酸外切酶III构建供体质粒。设计引物F1，使其包含与载体元件1重叠的序列以及部分元件2的序列。使用元件1、元件2和元件3的一部分设计引物R2。设计引物F2，使其包含元件3和元件4，以及sgRNA靶位点下游CDS的5'端序列。设计引物R1，使其包含包被序列的3'端序列以及一段与载体重叠的序列。以斑马鱼cDNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增。通过乙醇沉淀法纯化PCR产物。用限制性内切酶（如pCI和Acc65I）消化供体质粒，并纯化消化后的供体质粒。使用DNA凝胶电泳定量纯化的PCR片段和经消化的供体质粒。接着，将纯化的供体质粒与LIC反应液混合，冰上孵育60分钟。加入1微升0.5摩尔的EDTA以终止反应。用移液器上下吹打以混匀溶液。将反应混合物在60摄氏度孵育5分钟。将LIC产物置于冰上冷却。然后，使用LIC产物转化DH5-Alpha感受态细胞。将转化后的细胞接种于含有氨苄青霉素的Luria-Bertani平板上，培养16小时。孵育后，从LIC平板上挑取单菌落，进行酶切分析和DNA测序。使用纯化试剂盒提取并纯化正确的供体质粒。向斑马鱼胚胎显微注射基因敲入用混合液，在显微注射后12至48小时，于体视荧光显微镜下观察斑马鱼幼鱼的荧光信号。采用已建立的筛选方法，挑选出具有荧光的幼鱼并进行单独饲养。在满一个月时，从每条已麻醉的斑马鱼身上采集一小段尾鳍组织，放入带有标签的PCR管中。将相应编号的已麻醉斑马鱼置于六孔板中，孔板内盛有经紫外灭菌的过滤水，水的编号与PCR管标签相对应。采用碱裂解法提取基因组DNA。在左侧同源臂上游设计一条正向引物，并在插入片段上设计一条反向引物。进行PCR扩增，以靶向序列的5'端连接区。通过将筛选获得的F代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，获得F1代胚胎，观察其GFP表达模式。使用连接PCR对F1代胚胎进行基因型鉴定。在所有F1代子代的肌肉中均观察到可遗传的特异性荧光，表明connexon 39.9已成功标记GFP。在所有F2代子代的晶状体中均检测到可遗传的特异性荧光，提示connexon 44.1已成功标记mCherry。通过连接聚合酶链式反应验证了连接蛋白39.9和44.1的正确敲入。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

荧光标记以可视化斑马鱼中的低表达蛋白质

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

斑马鱼全胚胎高分辨率双荧光标记 原位 杂交

理解塑造早期胚胎的形态发生过程的关键在于能够以高分辨率对细胞进行成像。本文介绍一种在完整斑马鱼胚胎中利用膜定位的绿色荧光蛋白对单个细胞或少量细胞簇进行标记的技术。...

斑马鱼后脑中细胞的标记与成像

本方案阐述了一种利用紫外光解笼释放荧光素的方法，对斑马鱼胚胎中少量细胞进行标记并追踪其命运，随后通过整体免疫标记放大光解后荧光素的信号。...

使用激光解笼荧光素葡聚糖对斑马鱼细胞进行谱系标记

濒死细胞通过邻近细胞的协同收缩从上皮组织中被挤出，而不会破坏其屏障功能。斑马鱼发育过程中具有良好的光学通透性，为在活体上皮中可视化观察细胞挤出提供了优良的实验系统。本文中，我们描述了在幼年斑马鱼表皮中诱导并以细胞分辨率成像细胞挤出的方法。...

活体成像观察斑马鱼发育过程中表皮细胞的挤出

本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。...

斑马鱼单细胞命运图谱绘制

本文介绍了一种对斑马鱼胚胎中组织特异性荧光进行半自动化成像的实验方案。...

斑马鱼胚胎中组织特异性荧光的半自动化成像

斑马鱼胚胎是发育生物学研究的理想模型。在胚胎发育过程中，斑马鱼胚胎带有卵黄团，给样本的观察与分析带来了三维结构上的挑战。本实验方案描述了如何制备整体样本的二维平面封片 原位 经 (WISH)...

用于整体染色斑马鱼胚胎标本观察与分析的平铺制备 原位 杂交

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

对单个细胞进行靶向操作以引发定向应激或死亡，一直以来较难实现。本文介绍一种基于标准共聚焦紫外激光的单细胞分辨率消融方法，可在细胞培养体系及活体动物中选择性地对单个细胞施加应激并诱导其死亡。...

使用常规紫外激光共聚焦显微镜诱导细胞应激与死亡

本方案展示了在早期斑马鱼胚胎冷冻切片上进行连续免疫荧光和免疫组织化学染色的方法，从而实现对特定细胞群体中蛋白共定位的精确分析。...

石蜡切片斑马鱼胚胎的连续免疫荧光与免疫组织化学染色

了解荧光蛋白标记技术用于斑马鱼低丰度蛋白质可视化研究。该方法简化了供体构建流程，优化了成像效率，为神经科学与蛋白质研究提供了可靠工具。

荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

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