荧光标记法用于可视化斑马鱼中低表达蛋白

该产品经过优化，可用于平衡带有荧光蛋白标签的蛋白质，并可视化斑马鱼实验室个体中目标蛋白的定位与表达情况。它特别适用于对低丰度表达的蛋白质进行成像。我们的方法简化并加速了供体质粒的构建过程。

除CDS外，这些组分均预先整合至载体骨架中。供体质粒也经过优化以提高效率。该递送筛选流程以最低的时间和劳动成本富集可遗传的细胞核。

斑马鱼是感染与免疫研究中广泛使用的模式生物。我们尤其关注脓毒症背后的机制。由于现在能够通过我们的方案轻松实现荧光标记，我们将尝试对斑马鱼中的图像、脓毒症相关蛋白和细胞进行标记。

首先，将一条健康的雌性斑马鱼和两条健康的雄性斑马鱼放入交配缸中。使用隔板将雄鱼与雌鱼分隔开，以准备交配。在显微注射当天，于RNase-free环境中将显微注射混合液置于冰上配制。

使用无 RNase 的移液器吸头，将显微注射溶液吸入针头中。将装有溶液的针头放入连接至显微注射仪的显微操作器中。在显微镜下，用尖头镊子轻轻夹住针头尖端，使其断裂，从而切断针头末端。

调节注射压力，直至针头持续喷出一纳升的液滴。接着，从交配缸中移除隔板，让鱼类交配六分钟。收集并转移单细胞期胚胎至含有胚胎缓冲液的培养皿中。

在光学显微镜下检查胚胎的健康状况，并移除未受精的卵子或碎片。将20个健康的胚胎置于另一个培养皿中作为未注射对照组，并标记该培养皿。使用小刷子将健康的一细胞期胚胎转移至已预热至室温的显微注射板的凹槽中，并轻轻排列整齐。

从培养板中移除多余的缓冲液。借助针尖，轻轻调整每个胚胎的位置，使动物极朝向针尖。将一纳升混合溶液注入动物极。

注射后，用胚胎缓冲液将胚胎轻轻冲洗至6孔板中。将6孔板放入28.5°C恒温培养箱中。受精后10小时，在体视显微镜下观察胚胎发育情况，并移除死亡胚胎。

受精后24小时，将胚胎收集到1.5毫升离心管中用于基因分型，并小心弃去多余的水。每管加入含有蛋白酶K的100微升裂解缓冲液。先在56摄氏度孵育1小时，然后在95摄氏度孵育15分钟。

孵育后，加入 200 微升乙醇并充分混匀。将离心管在 19,000 G 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，然后用 500 微升 70% 乙醇重悬沉淀。再次离心后，将沉淀空气干燥，再溶于 50 微升双蒸水中。

使用一微升提取物制备PCR反应体系。PCR反应完成后，取两微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增是否成功。通过酶切消化反应评估sgRNA的效率。

轻轻混匀消化液，并在室温下孵育，具体操作遵循制造商说明书。将消化产物与未消化的PCR对照样品一同进行琼脂糖凝胶电泳，以确认消化效果。为分析sgRNA效率，请打开TIDE网站并点击“Start TIDE”。

将sgRNA的引导序列输入至引导序列框中。单击“浏览”按钮，将野生型对照的测序结果上传至对照样本色谱图字段。同样，将编辑后样本的测序结果上传至测试样本色谱图字段。

单击“更新视图”以分析结果。首先，使用不依赖连接酶的克隆方法（LIC）结合核酸外切酶III构建供体质粒。设计引物F1，使其包含与载体元件1重叠的序列以及部分元件2的序列。

使用元件1、元件2和元件3的一部分设计引物R2。设计引物F2，使其包含元件3和元件4，以及sgRNA靶位点下游CDS的5'端序列。设计引物R1，使其包含包被序列的3'端序列以及一段与载体重叠的序列。

以斑马鱼cDNA为模板，使用设计好的引物进行PCR扩增。通过乙醇沉淀法纯化PCR产物。用限制性内切酶（如pCI和Acc65I）消化供体质粒，并纯化消化后的供体质粒。

使用DNA凝胶电泳定量纯化的PCR片段和经消化的供体质粒。接着，将纯化的供体质粒与LIC反应液混合，冰上孵育60分钟。加入1微升0.5摩尔的EDTA以终止反应。

用移液器上下吹打以混匀溶液。将反应混合物在60摄氏度孵育5分钟。将LIC产物置于冰上冷却。

然后，使用LIC产物转化DH5-Alpha感受态细胞。将转化后的细胞接种于含有氨苄青霉素的Luria-Bertani平板上，培养16小时。孵育后，从LIC平板上挑取单菌落，进行酶切分析和DNA测序。

使用纯化试剂盒提取并纯化正确的供体质粒。向斑马鱼胚胎显微注射基因敲入用混合液，在显微注射后12至48小时，于体视荧光显微镜下观察斑马鱼幼鱼的荧光信号。采用已建立的筛选方法，挑选出具有荧光的幼鱼并进行单独饲养。

在满一个月时，从每条已麻醉的斑马鱼身上采集一小段尾鳍组织，放入带有标签的PCR管中。将相应编号的已麻醉斑马鱼置于六孔板中，孔板内盛有经紫外灭菌的过滤水，水的编号与PCR管标签相对应。采用碱裂解法提取基因组DNA。

在左侧同源臂上游设计一条正向引物，并在插入片段上设计一条反向引物。进行PCR扩增，以靶向序列的5'端连接区。通过将筛选获得的F代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，获得F1代胚胎，观察其GFP表达模式。

使用连接PCR对F1代胚胎进行基因型鉴定。在所有F1代子代的肌肉中均观察到可遗传的特异性荧光，表明connexon 39.9已成功标记GFP。在所有F2代子代的晶状体中均检测到可遗传的特异性荧光，提示connexon 44.1已成功标记mCherry。

通过连接聚合酶链式反应验证了连接蛋白39.9和44.1的正确敲入。