经预处理肿瘤细胞异基因共培养体系中人类T细胞活性的分析

肿瘤细胞在治疗过程中会改变其免疫表型，这可能影响治疗效果，因此我们的研究旨在探讨T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，以更深入地理解这些相互作用。

通过将放射治疗与激酶抑制剂联合使用，增强放射敏感性，特别是针对放射抗性肿瘤。靶向DNA损伤应答目前是最新研究进展中的核心部分。三维细胞培养模型和共培养模型已在放射生物学领域得到建立，以提高体外与体内数据之间的可比性。

[旁白] 首先，获取适量D10培养基中的HSC4肿瘤细胞。在96孔板中，每种条件至少接种三个孔，每孔含15,000个细胞，培养液体积为200微升。指定一块板用于样本处理，包括仅含肿瘤细胞和仅含T细胞的对照孔，以及共培养当天用于细胞计数的各处理组孔。在第二天，用所需浓度的激酶抑制剂处理肿瘤细胞。在加入抑制剂后3至4小时，对其中一块板进行照射，另在24小时后对另一块板进行照射，均采用5 Gy剂量进行低分割放疗。对于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，将健康供体采集的EDTA抗凝血转移至两个50毫升离心管中。用含2% FBS的PBS将两管补至50毫升。接下来，准备六个带有塑料内衬的离心管用于PBMC分离。每管加入15毫升冷密度梯度介质。小心地将稀释后的血液12至15毫升叠加于密度梯度介质上层。以1,200 G离心10分钟，不启用减速。离心后，将上清液转移至四个新的50毫升离心管中，弃去已使用的离心管。用含2% FBS的PBS将新离心管补至50毫升，室温下以120 G离心10分钟。小心弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含2% FBS的1毫升PBS中，并将两个沉淀合并至同一离心管中。再次用含2% FBS的PBS将离心管补至50毫升。以300 G离心PBMCs 10分钟。小心弃去上清液。按每10^7个细胞加入80微升MACS Plus缓冲液，重悬细胞沉淀。按每10^7个细胞加入20微升CD8微珠，轻轻吹打混匀。在4摄氏度下孵育15分钟。孵育结束后，按每10^7个细胞加入2毫升MACS Plus缓冲液洗涤细胞。室温下以300 G离心10分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于1000微升MACS Plus缓冲液中。将两个MS柱置于磁铁上，并在下方放置两个15毫升离心管。用500微升MACS Plus缓冲液平衡柱子。然后将等体积的细胞悬液加入已准备好的MS柱中。用500微升MACS Plus缓冲液冲洗柱子三次。将最终收集的流穿液标记为“流穿”或“CD8阴性”，并合并至同一离心管中。另取一个标记为“CD8阳性T细胞”的15毫升离心管。用各1000微升MACS Plus缓冲液冲洗含有磁标记CD8阳性T细胞的两个柱子。在染色前，以300 G离心T细胞5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1000微升PBS中。再次以300 G离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于2000微升1微摩尔CFSE染色液中。在37摄氏度下孵育20分钟。接着，以300 G离心染色后的细胞5分钟。用PBS洗涤细胞后，将其重悬于T细胞培养基中。将细胞接种至经CD3和CD28包被的6孔板中并进行培养。在第四天，收集T细胞并重悬于相应的培养基中。计数指定孔后，按1:1比例将所需数量的T细胞加入肿瘤细胞孔中。在第七天，从培养箱中取出培养板，进行T细胞增殖的定量分析。洗涤细胞后，用所需抗体染色，并通过流式细胞术评估T细胞。根据前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）排除双联体，获得单细胞群体。绘制单细胞群体的FSC-A对侧向散射面积（SSC-A）图以识别T细胞。绘制CD3表达与SSC-A的关系图以区分T细胞。进一步通过绘制CD8信号与SSC-A的关系图识别CD8阳性T细胞。所有T细胞均应表达CD3和CD8。将所有CD8阳性T细胞的CFSE信号以直方图形式展示。完成设门步骤后，选择CD8阳性T细胞作为输入，通过绘制相应表面标志物荧光信号与SSC-A的关系，分析其CD25或HLA-DR同型表达。当与经照射的HSC4肿瘤细胞共培养时，增殖性T细胞的比例增加。与RT联合ATM抑制相比，放疗（RT）以及RT联合ATR抑制显著增强了T细胞增殖。在高度增殖的T细胞中，RT联合ATR抑制在促进增殖方面效果最为显著。与经RT处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，T细胞上的CD25表达下调。单独使用ATM抑制剂预处理肿瘤细胞相比ATR抑制剂显著降低了CD25表达。RT联合ATM抑制剂处理导致CD25表达升高，高于RT联合ATR抑制剂组。RT总体上上调了T细胞上的HLA-DR表达。与经RT联合ATR抑制剂预处理的HSC4细胞共培养进一步提高了HLA-DR表达，高于单独RT或RT联合ATM抑制剂组。