Name: 在预处理肿瘤细胞的同种异体共培养环境中分析人 T 细胞活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习体外分析人T细胞在同种异体共培养系统中与预处理肿瘤细胞的相互作用，使用流式细胞术评估T细胞增殖和表面标志物表达。该方法有助于深入理解放疗联合激酶抑制剂对免疫反应的影响机制。

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本研究部分由埃尔兰根临床研究跨学科中心（IZKF Erlangen）和巴伐利亚癌症研究中心（BZKF）资助。

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<li>Schnellhardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FOXP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+rectal+cancer+depends+on+immune+phenotypes+defined+by+CD8%2B+cytotoxic+T+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in rectal cancer depends on immune phenotypes defined by CD8+ cytotoxic T cell density.</a> Front Immunol. 13, 781222(2022).</li>
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作者声明无利益冲突。

本文所展示的实验方案提供了一种快速简便的方法，用于在与经预处理的肿瘤细胞共培养的条件下，分析T细胞的增殖能力及其活化状态。通过该方法可轻松筛选不同治疗方式（如放疗RT、化疗CT或靶向治疗TT）对T细胞活性和增殖的影响，为后续深入评估具有潜力的治疗策略奠定免疫学分析基础。本论文展示的代表性结果证实，该同种异体T细胞共培养实验体系性能良好。在与不同预处理的人源HSC4（头颈部鳞状细胞癌HNSCC）细胞共培养时，T细胞的增殖水平及活性均表现出显著差异（图4 和 图5）。研究发现，HSC4细胞经放疗RT单独处理或联合靶向治疗TT处理后，可促进T细胞的增殖，尤其是高增殖能力T细胞亚群的扩增（图4）。与增殖率的定量结果一致，不同处理方案对T细胞的活化状态也产生了差异性影响。总体而言，放疗RT的应用导致T细胞表面CD25表达显著下调，而HLA-DR的表达则上调。放疗会在受照射的肿瘤细胞中诱导DNA损伤，进而引发细胞应激反应，包括释放与应激和损伤相关的分子及细胞因子，并上调免疫调节性细胞表面配体的表达19。
将放疗（RT）与以DNA修复抑制剂形式存在的靶向治疗（TT）相结合，可进一步增强并维持这些效应，因为肿瘤细胞无法有效修复放疗引起的DNA损伤。这可能进一步促进并维持免疫原性因子的分泌以及免疫原性细胞表面配体的表达20。与此一致，我们先前已证明，使用放疗联合DNA损伤抑制剂处理肿瘤细胞（HNSCC）可改变肿瘤细胞表面的免疫表型。免疫表型的调控包括免疫刺激分子ICOS-L以及免疫抑制分子PD-L1的调节11。作为对肿瘤细胞免疫表型改变的响应，T细胞也可能调节其细胞表面活化标志物的表达。此外，放疗已被广泛证实可刺激促炎性细胞因子（如IFNγ或IL-6）的释放，这些细胞因子反过来影响T细胞的增殖和活性21。T细胞表面活化标志物的表达是一个高度动态的过程。Zimmerman等人的研究数据22显示，CD25在刺激后24小时高度表达，但在刺激后96小时再次下调。这一结果与我们的发现一致。相比之下，HLA-DR是一种晚期活化标志物，通常出现在CD25和CD69表达升高之后23。值得注意的是，与RT + ATMi相比，RT + ATRi组合可显著上调T细胞上的HLA-DR表达。该发现与Dillion等人的研究结果一致，后者证明了ATRi与RT联用在诱导炎性肿瘤微环境（TME）方面具有协同作用24。仅使用激酶抑制剂处理肿瘤细胞对T细胞活性和增殖的调节作用较弱（图5）。这可能是因为DNA修复抑制剂ATMi和ATRi主要作为放疗诱导的DNA损伤的增强剂发挥作用，因此在单药治疗时免疫原性较弱。我们此前已证实单独使用ATMi或ATRi的毒性极低11。综上所述，这些结果证实了放疗（以及联合DNA损伤抑制剂的靶向治疗）具有免疫原性潜力，并进一步表明该实验体系适用于筛选不同治疗方式在人头颈部肿瘤细胞中的免疫刺激能力。
尽管本文介绍的方法简便且可靠，但在实验方案中仍有一些关键步骤需要预先考虑。在T细胞分离过程以及流式细胞术分析过程中，必须保持较高浓度的EDTA。因此，建议将供体血液采集至含EDTA的抗凝采血管中，并使用添加了10 mM EDTA的MACS缓冲液，以确保高效地分离T细胞，并获得均一的单细胞悬液用于流式细胞术检测。此外，T细胞培养基的成分对T细胞的增殖能力至关重要。在测试了多种培养基配方后发现，低浓度L-精氨酸和L-赖氨酸的培养基可获得最佳的T细胞增殖信号，因为L-精氨酸对T细胞的代谢和存活具有关键作用，需以适宜的浓度提供25,26。然而需要注意的是，L-精氨酸和L-赖氨酸溶液长期不稳定，应在3个月内使用完毕。为了达到最佳刺激效果，每次T细胞培养实验均需新鲜配制添加氨基酸的T细胞培养基。此外，T细胞和肿瘤细胞的细胞数量也是影响实验结果读出的关键因素，必须予以充分考虑。
对于肿瘤细胞，一方面，共培养实验结束时，希望细胞融合度达到70%至80%。肿瘤细胞过度生长可能导致分泌抑制细胞生长的因子，从而影响T细胞的增殖速率。由于肿瘤细胞的生长高度依赖于特定的细胞系，我们建议在不同孔板中以及不同处理条件下，充分测试相应肿瘤细胞系的生长行为。此外，肿瘤细胞与T细胞应以1:1的比例进行共培养。因此，必须为每种处理条件额外接种一孔肿瘤细胞，用于在共培养开始当天测定细胞数量，从而确保为不同处理条件接种适当数量的T细胞。关于T细胞的数量，需注意从健康供体中分离得到的T细胞数量存在较大的个体差异。T细胞约占健康供体外周血单个核细胞（PBMCs）的45%至70%27。因此，在采血时就应大致估算所需T细胞的数量。此外，T细胞的密度对其活化效率和存活至关重要。因此，在共培养开始前的初始刺激阶段，应将T细胞以每6孔板孔3 mL T细胞培养基中至少接种150万个细胞的浓度进行培养。允许使用更高的T细胞密度，但应避免更低的密度。T细胞的活化情况也可通过显微镜下形态学观察进行评估，因为活化的T细胞倾向于形成细胞簇。
由于该方法是一种用于研究不同肿瘤细胞系及治疗方式免疫刺激能力的简化实验体系，因此存在一些需要考虑的局限性。首先，该检测基于异基因系统，即供体T细胞与相应的肿瘤细胞系之间的人类白细胞抗原（HLA）不匹配。因此，这种HLA不匹配本身可能已足以诱导T细胞活化，进而引起T细胞增殖，而无需肿瘤细胞经处理后提供额外的刺激信号。28为量化这一非预期效应，将分离的T细胞与HSC4细胞系共培养，但未预先使用CD28和CD3抗体进行刺激。结果发现，在此条件下几乎未诱导T细胞增殖，表明在该特定实验体系中，HLA不匹配对T细胞活化的影响较小。此外，尽管处于同种异体环境下，仍观察到不同肿瘤细胞处理方式所导致的T细胞增殖与活化存在显著差异。然而，在建立该检测方法时，应在实验初期对T细胞可能由同种异体反应诱导的增殖进行测试与定量。推荐设置“仅T细胞”和“仅肿瘤细胞”对照组，以实现充分的设门分析，且此类对照在每次实验重复中均为必需。但需注意，同种异体共培养系统缺乏对肿瘤特异性抗原的识别，因此该体系可能无法准确反映体内实际发生的特异性抗肿瘤免疫应答 体内 在患者中29,30为进一步改进，可采用更复杂的自体共培养方法。在此方法中，需培养患者来源的肿瘤活检组织，并将其与来自同一患者外周血分离的T细胞进行共培养。28然而，这种实验方法不仅在原代肿瘤细胞的培养方面可能存在挑战，而且在患者来源生物材料的可获得性方面也存在困难。另一个需要考虑的局限性是共培养体系中肿瘤细胞与T细胞的比例。由于推荐的细胞比例为1:1，该比例并不能反映患者肿瘤微环境（TME）中的生理状况。31然而，这一局限性必须被接受，因为当T细胞数量较低时，增殖率和活化状态的变化无法被量化。 
在肿瘤免疫学领域，该检测方法提供了一种简便快速的实验手段，可用于筛选不同治疗方式的免疫原性 体外 因此，不仅可以通过对免疫原性方面最有前景的方法进行预筛选来节省时间，而且还可以 体内 实验。由于只有前景良好的治疗方案才会在动物模型中进一步研究，以反映机体整体的免疫系统，因此可减少动物模型的使用。此外，由于该检测基于人原代细胞和人癌细胞系，其结果相较于基于其他模型系统和物种的检测，可能更易于转化为临床应用。 
未来，该检测方法可进行调整和优化，以回答更具体的研究问题。例如，可对T细胞进行处理，以更贴近患者体内的治疗情境。由于肿瘤反应性T细胞主要存在于肿瘤微环境（TME）中，它们同样会受到放射治疗（RT）等局部治疗的影响，也可能受到化疗（CT）或靶向治疗（TT）等全身性治疗的影响。32进一步改进该检测方法是将T细胞与肿瘤细胞系来源的肿瘤球体共培养，甚至与患者来源的肿瘤类器官共培养。这些三维培养模型在结构上更接近患者体内的肿瘤组织。28最后，实验的读出结果 通过 流式细胞术可轻松地进行调整，以进一步研究T细胞表面的其他分子，或通过分析肿瘤细胞上免疫检查点分子的表达情况。除了确定T细胞的免疫表型外，还可以利用共培养实验中的细胞培养上清液，定量检测分泌的细胞因子或趋化因子，从而更深入地了解T细胞的活性。总之，本方案提供了一种全面、稳健且简便的T细胞与肿瘤细胞共培养检测方法，可用于筛选不同癌症治疗方式的免疫原性。由于该检测方法可根据特定的研究问题进行调整，因此非常适用于肿瘤免疫学这一广泛领域的研究应用。

如今，肿瘤的发生与进展在很大程度上依赖于对宿主免疫系统的有效操控和抑制，这一观点正变得越来越明确。即使在健康的机体中，每天也会产生转化细胞。然而，形成肉眼可见的肿瘤却是一种相对罕见的事件，因为新出现的转化细胞会被机体高效地清除。在清除恶性细胞的过程中，多种免疫细胞类型发挥作用，例如细胞毒性T细胞、自然杀伤（NK）T细胞、NK细胞或巨噬细胞1,2,3。尽管如此，有时仍会出现某些转化细胞克隆，它们与宿主免疫系统处于一种平衡状态，这种状态以肿瘤细胞克隆采用多种免疫抑制策略为特征4。最终，部分转化细胞获得进一步功能，使肿瘤细胞能够主动抑制免疫应答，从而导致肿瘤的生长和扩散。这种免疫抑制由多种机制介导，包括肿瘤细胞表面表达免疫抑制性配体，或主动招募或激活免疫调节性或免疫抑制性免疫细胞群体。这种所谓的免疫编辑概念，揭示了免疫调节在肿瘤形成与生长过程中的关键作用5。
因此，免疫系统如今不仅是癌症治疗的主要关注点，而且在许多肿瘤类型和治疗背景下也成为预测性和预后性因素，这一点并不令人意外。近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs）已成为多种实体瘤（如头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）或非小细胞肺癌（NSCLC））中颇具前景的治疗选择，其目标是调控肿瘤微环境（TME），以增强抗肿瘤免疫应答效率，并降低肿瘤细胞的免疫抑制作用6。免疫检查点抑制剂旨在通过靶向程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体1（PD1/PD-L1）通路等免疫检查点分子，增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用。这一事实凸显了T细胞在抗肿瘤免疫中的关键作用。例如，在HNSCC中，ICIs已成功获批用于复发性和转移性HNSCC的一线治疗7。与此一致的是，TME中细胞毒性T细胞的存在，以及肿瘤细胞和T细胞上相应表达的PD1和PD-L1，可作为HNSCC中的预测性生物标志物8,9,10。
尽管T细胞在肿瘤免疫学和肿瘤治疗中具有关键作用，但关于T细胞与肿瘤之间相互作用的许多问题仍有待阐明。目前公认，肿瘤免疫应答是一个动态过程，且肿瘤的免疫原性可在疾病进展及治疗过程中发生变化。多种治疗方式，如化疗（CT）、放疗（RT）或靶向治疗（TT），均被广泛证实可调节肿瘤细胞的免疫表型。放疗可诱导肿瘤组织中免疫检查点分子的上调，并改变肿瘤浸润细胞的频率11,12。另一方面，靶向治疗亦可通过直接调控适应性免疫应答，在肿瘤及肿瘤微环境（TME）中促进有利的改变13,14,15,16。然而，在患者中研究这些调节作用具有挑战性，因为这需要在治疗过程中反复获取肿瘤组织进行检测。因此，迫切需要建立可靠的实验模型系统，以研究肿瘤细胞和T细胞动态的免疫表型，更重要的是，研究它们之间的相互作用。
因此，为了分析T细胞活性以及肿瘤细胞与T细胞之间的相互作用，一个全面的 离体 共培养实验需要基于简单的细胞培养操作和常用的流式细胞术分析，便于在任何实验室中实施。根据现有文献，目前尚未发表任何关于T细胞与肿瘤细胞共培养的简便且广泛应用的实验方案。尽管近期已发表若干T细胞与肿瘤类器官共培养的实验方法，但三维细胞培养技术目前仍未在所有实验室中成为常规技术。因此，我们提供了一种适用于二维细胞培养的实验方案，未来亦可拓展应用于三维细胞培养。其他已有的二维共培养方案往往更为复杂，例如需要将肿瘤细胞转导表达荧光素酶17 或仅适用于血液系统恶性肿瘤（将不匹配的T细胞与白血病细胞共培养）18在本实验方案中，从正常健康供体的外周血中分离T细胞，并用抗CD3和抗CD28抗体进行刺激。随后，将T细胞与经（预）处理的肿瘤细胞共培养，以分析T细胞的增殖能力及其活性 通过 流式细胞术。借此，可轻松筛选不同治疗方式（如放疗、化疗或靶向治疗）对肿瘤细胞免疫表型的影响，而这些影响又会进一步作用于T细胞的活性与增殖，从而为深入的机制分析及后续选定的临床前研究提供基础。 体内 分析。本文所述的检测方法操作简便，无需使用非常规设备、技术或材料。此外，该检测方法可轻松适用于不同的肿瘤细胞系或特定的T细胞亚群（例如CD4+ T细胞）。采用此技术可实现高度的标准化和可重复性。

<table><tbody><tr><td>15 mL Cellstar 离心管</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cellstar 离心管</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板，无菌，带盖</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96 孔细胞培养板，无菌，F 型底，带盖</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>AZD0156</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S8375</td><td></td></tr><tr><td>Berzosertib (VE-822)</td><td>Selleck Chemicals GmbH</td><td>S7102</td><td></td></tr><tr><td>CASYcups</td><td>OMNI Life Science GmbH &amp;amp; Co KG&amp;nbsp;</td><td>5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYton</td><td>OMNI Life Science GmbH &amp;amp; Co KG&amp;nbsp;</td><td>5651808</td><td></td></tr><tr><td>CD25a, PE-Dazzle594, 小鼠 IgG1</td><td>Biolegend</td><td>356126</td><td></td></tr><tr><td>CD28-UNLB</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>IM1376</td><td></td></tr><tr><td>CD3a, Krome Orange, 小鼠 IgG1</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>B00068</td><td></td></tr><tr><td>CD3e 单克隆抗体</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>MA1-10176</td><td></td></tr><tr><td>CD4, APC, 抗人小鼠 IgG1</td><td>BD Pharmingen</td><td>555349</td><td></td></tr><tr><td>CD8 MicroBeads，人源</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-045-201</td><td></td></tr><tr><td>CD8a, PerCP-Cy5.5, 小鼠 IgG1</td><td>Biolegend</td><td>300924</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red 染料</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>C34565</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>&amp;nbsp;Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco&amp;acute;s 改良 Eagle&amp;acute;s 培养基）</td><td>PAN-Biotech GmbH</td><td>P04-02500</td><td></td></tr><tr><td>DxFlex 流式细胞仪（带自动进样器）</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>C44326, C02846</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>S0615-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS superior&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Merck KGaA (Sigma-Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>S0615-100ML</td><td>用于制备热灭活 FBS。56 &amp;deg;C 下加热 30 分钟并混匀，以灭活补体蛋白。</td></tr><tr><td>Graph Pad Prism（版本号 9）</td><td>GraphPad Software</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR、DP、DQ 抗体，抗人，APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-123-550</td><td></td></tr><tr><td>Kaluza（版本号 2.1）</td><td>Beckmann Coulter, Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸单盐酸盐</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>L5626-100G</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA 储存液</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>改良 Neubauer 计数板</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp;amp; Co. KG&amp;nbsp;</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>D8537-500mL</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>1514-122</td><td></td></tr><tr><td>ROTISep 1077</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>R1790</td><td></td></tr><tr><td>SepMate 50 mL 离心管</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Merck KGaA (Sigma-Aldrich)</td><td>T6146-25G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo-Fisher Scientific, Inc.</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

经预处理肿瘤细胞异基因共培养体系中人类t细胞活性的分析

Analysis of Human T Cell Activity in an Allogeneic Co-Culture Setting of Pre-Treated Tumor Cells

细胞毒性T细胞在清除肿瘤细胞中发挥关键作用，因此在肿瘤免疫学研究中受到广泛关注。肿瘤组织及其肿瘤微环境（TME）中细胞毒性T细胞的频率和活性现已被确立为多种肿瘤类型的预后和预测性生物标志物。然而，众所周知，包括放疗、化疗、免疫治疗和靶向治疗在内的多种肿瘤治疗方式，不仅影响肿瘤本身的免疫原性，也对免疫系统本身产生调节作用。因此，为了全面理解T细胞在肿瘤治疗过程中的复杂作用，需要在不同治疗背景下更深入地研究肿瘤细胞与T细胞之间的相互作用。为满足这一需求，已建立一种实验方案，用于分析经预处理的肿瘤细胞共培养条件下人源细胞毒性（CD8+）T细胞的活性及增殖能力。具体而言，来自健康供体的CD8+ T细胞使用无毒增殖标记物羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行染色，并通过CD3/CD28包被的培养板进行刺激。随后，将T细胞与经预处理的肿瘤细胞进行共培养。通过检测CFSE信号分布以及表面活化标志物的表达水平，定量评估T细胞的增殖情况。

关键词：细胞毒性T细胞，CD8+ T细胞，肿瘤微环境，TME，CFSE，CD3/CD28刺激，共培养，增殖检测，肿瘤免疫，免疫治疗 通过 流式细胞术。此外，还可通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞因子的释放。该方法有助于评估治疗诱导的肿瘤细胞与T细胞相互作用的变化，为深入分析肿瘤治疗方式及其在人体内的免疫原性奠定基础 离体 环境。此外，它还有助于减少临床前 体内 分析。

将来源于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的HSC4肿瘤细胞接种并过夜培养。24小时后，用激酶抑制剂处理细胞。3小时后，施加前两剂每次5 Gy的照射。再过24小时后，施加第二剂照射，细胞再次过夜培养。与此同时，在共培养开始前48小时，从健康供体的血液中分离T细胞。首先，使用密度梯度离心管和无菌分离介质分离外周血单个核细胞（PBMCs）。使用细胞计数板对PBMCs进行计数，并利用CD8+ T细胞分离试剂盒分离CD8+ T细胞。分离得到的CD8+ T细胞随后用CFSE（1 µM）染色并再次计数。将T细胞以1.5 × 106 个细胞/3 mL的密度接种于CD3/CD28预包被的培养板中。刺激培养48小时后，收集T细胞，进行计数，并重悬于10,000 个细胞/10 µL的密度。此外，收集部分接种的肿瘤细胞培养孔进行计数，并为所有剩余孔更换培养基。按1:1的比例将T细胞加入肿瘤细胞中。共培养96小时后，收集共培养体系，上清液储存于-20 °C，细胞则经染色后通过流式细胞术检测（图1）。
通过排阻体积及CD3/CD8阳性来鉴定T细胞。CD3+/CD8+阳性细胞的CFSE信号显示了非增殖性T细胞（高CFSE信号）以及不同亚群的增殖性T细胞（CFSE信号强度降低）的分布情况。以HSC4头颈部鳞状细胞癌细胞系为例测量了增殖性T细胞的比例（图4A）。所有至少经历一次分裂的T细胞被定义为“增殖性”T细胞；经历超过3次分裂的T细胞被定义为“高度增殖性”T细胞（图4B）。对于HPV阴性的HSC4细胞系，当T细胞与经照射的肿瘤细胞共培养时，其增殖率略有升高。与经放疗联合ATM抑制处理的HSC4细胞和T细胞共培养组相比，放疗联合ATR抑制处理的HSC4细胞与T细胞共培养可显著增强T细胞的连续增殖。在T细胞的“高度增殖性”亚群中，HSC4细胞经放疗联合ATR抑制预处理后，对T细胞增殖的刺激作用最为显著（图4B）。
<img alt="HSC4 T细胞增殖柱状图；显示ATM、ATR抑制效应；标注统计学显著性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：CFSE标记T细胞的增殖情况，用于分析HSC4处理依赖性的T细胞增殖变化。（A）与预处理的HPV阴性HSC4肿瘤细胞共培养96小时后，增殖T细胞的比例。与经RT+ATMi处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，T细胞增殖显著低于单独RT处理或RT联合ATRi处理组。（B）HSC4肿瘤细胞接受RT处理后，导致更高比例的高增殖活性T细胞（超过三次细胞分裂）。在与经RT+ATRi预处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，高增殖活性T细胞的比例最高。柱状图显示了四次独立实验的数据，T细胞来自四位独立的健康供体（n = 4；均值 ± 标准差）。(*p≤ 0.05, **p≤ 0.01, ***p≤ 0.001, ****p≤ 0.0001；采用双尾Mann-Whitney-U检验对所有实验条件进行两两比较，适用于非正态分布数据)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
基于增殖的CFSE信号减弱可用于量化T细胞的增殖速率。此外，已有多种细胞表面标志物被描述为与T细胞活性相关，例如CD25和HLA-DR。因此，通过流式细胞术分析了所有CD3+和CD8+ T细胞表面CD25和HLA-DR的表达情况（图5）。如果能够检测到明显的CD25high或HLA-DRhigh亚群，则可通过设门圈选这些高表达细胞来定量其表达水平（图3B）。若无法检测到明显的亚群，则可测量整个细胞群的平均荧光强度（MFI），并量化不同实验条件下MFI的变化（图3C）。
以CD25和HLA-DR的MFI所确定的表达水平为例，在与经预处理的HSC4肿瘤细胞共培养96小时后进行了分析（图5）。T细胞与经放疗（RT）处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，T细胞上CD25的表达显著下调。值得注意的是，与ATRi预处理相比，仅用ATMi对肿瘤细胞进行预处理可导致CD25表达明显降低。在与RT联合的情况下，尽管RT本身导致T细胞上CD25表达下降，但RT联合ATMi时CD25的表达高于RT联合ATRi（图5A）。关于T细胞上HLA-DR的表达，RT总体上引起HLA-DR上调，但当RT与ATMi或ATRi联合时，观察到不同的表达模式（图5B）。与仅经RT处理或RT+ATMi处理的HSC4细胞共培养的T细胞相比，与经RT+ATRi预处理的HSC4细胞共培养的T细胞表现出更高的HLA-DR表达水平。
<img alt="比较T细胞上HLA-DR和CD25表达的箱线图；共培养肿瘤细胞中的MFI分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67643/67643fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：T细胞与预处理的HSC4肿瘤细胞共培养96小时后，其表面激活标志物CD25和HLA-DR的表达情况。 CD25和HLA-DR的表达水平通过分析整个T细胞群体MFI的偏移来确定。HSC4的放疗（RT）导致T细胞上CD25表达降低，而HLA-DR表达升高。与放疗联合ATR抑制剂（ATRi）相比，放疗联合ATM抑制剂（ATMi）产生了显著不同的表达模式。箱线图展示了四次独立实验的数据，T细胞来自四位独立的健康供体（n = 4；均值 ± 标准差）。采用双尾Mann-Whitney-U检验对非正态分布数据进行分析，比较所有实验条件之间的差异（*p≤ 0.050）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67643/67643fig05largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
这些数据示例性地表明，对肿瘤细胞（本例中为 HSC4 HNSCC 细胞）的处理会影响肿瘤细胞的免疫原性。可通过将肿瘤细胞与预先刺激的 T 细胞共培养来监测这一影响，根据所采用的肿瘤细胞处理方案，人 T 细胞会表现出多样化的增殖行为以及激活标志物的表达。

本实验方案描述了一种实验工作流程，可实现 离体 经预处理肿瘤细胞与异基因共培养体系中人T细胞刺激的分析

经预处理肿瘤细胞异基因共培养体系中人类T细胞活性的分析

细胞毒性T细胞在清除肿瘤细胞中发挥关键作用，因此在肿瘤免疫学中被广泛深入研究。其频率和……

肿瘤细胞在治疗过程中会改变其免疫表型，这可能影响治疗效果，因此我们的研究旨在探讨T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，以更深入地理解这些相互作用。通过将放射治疗与激酶抑制剂联合使用，增强放射敏感性，特别是针对放射抗性肿瘤。靶向DNA损伤应答目前是最新研究进展中的核心部分。三维细胞培养模型和共培养模型已在放射生物学领域得到建立，以提高体外与体内数据之间的可比性。[旁白] 首先，获取适量D10培养基中的HSC4肿瘤细胞。在96孔板中，每种条件至少接种三个孔，每孔含15,000个细胞，培养液体积为200微升。指定一块板用于样本处理，包括仅含肿瘤细胞和仅含T细胞的对照孔，以及共培养当天用于细胞计数的各处理组孔。在第二天，用所需浓度的激酶抑制剂处理肿瘤细胞。在加入抑制剂后3至4小时，对其中一块板进行照射，另在24小时后对另一块板进行照射，均采用5 Gy剂量进行低分割放疗。对于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，将健康供体采集的EDTA抗凝血转移至两个50毫升离心管中。用含2% FBS的PBS将两管补至50毫升。接下来，准备六个带有塑料内衬的离心管用于PBMC分离。每管加入15毫升冷密度梯度介质。小心地将稀释后的血液12至15毫升叠加于密度梯度介质上层。以1,200 G离心10分钟，不启用减速。离心后，将上清液转移至四个新的50毫升离心管中，弃去已使用的离心管。用含2% FBS的PBS将新离心管补至50毫升，室温下以120 G离心10分钟。小心弃去上清液。将细胞沉淀重悬于含2% FBS的1毫升PBS中，并将两个沉淀合并至同一离心管中。再次用含2% FBS的PBS将离心管补至50毫升。以300 G离心PBMCs 10分钟。小心弃去上清液。按每10^7个细胞加入80微升MACS Plus缓冲液，重悬细胞沉淀。按每10^7个细胞加入20微升CD8微珠，轻轻吹打混匀。在4摄氏度下孵育15分钟。孵育结束后，按每10^7个细胞加入2毫升MACS Plus缓冲液洗涤细胞。室温下以300 G离心10分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于1000微升MACS Plus缓冲液中。将两个MS柱置于磁铁上，并在下方放置两个15毫升离心管。用500微升MACS Plus缓冲液平衡柱子。然后将等体积的细胞悬液加入已准备好的MS柱中。用500微升MACS Plus缓冲液冲洗柱子三次。将最终收集的流穿液标记为“流穿”或“CD8阴性”，并合并至同一离心管中。另取一个标记为“CD8阳性T细胞”的15毫升离心管。用各1000微升MACS Plus缓冲液冲洗含有磁标记CD8阳性T细胞的两个柱子。在染色前，以300 G离心T细胞5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1000微升PBS中。再次以300 G离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于2000微升1微摩尔CFSE染色液中。在37摄氏度下孵育20分钟。接着，以300 G离心染色后的细胞5分钟。用PBS洗涤细胞后，将其重悬于T细胞培养基中。将细胞接种至经CD3和CD28包被的6孔板中并进行培养。在第四天，收集T细胞并重悬于相应的培养基中。计数指定孔后，按1:1比例将所需数量的T细胞加入肿瘤细胞孔中。在第七天，从培养箱中取出培养板，进行T细胞增殖的定量分析。洗涤细胞后，用所需抗体染色，并通过流式细胞术评估T细胞。根据前向散射面积（FSC-A）与前向散射高度（FSC-H）排除双联体，获得单细胞群体。绘制单细胞群体的FSC-A对侧向散射面积（SSC-A）图以识别T细胞。绘制CD3表达与SSC-A的关系图以区分T细胞。进一步通过绘制CD8信号与SSC-A的关系图识别CD8阳性T细胞。所有T细胞均应表达CD3和CD8。将所有CD8阳性T细胞的CFSE信号以直方图形式展示。完成设门步骤后，选择CD8阳性T细胞作为输入，通过绘制相应表面标志物荧光信号与SSC-A的关系，分析其CD25或HLA-DR同型表达。当与经照射的HSC4肿瘤细胞共培养时，增殖性T细胞的比例增加。与RT联合ATM抑制相比，放疗（RT）以及RT联合ATR抑制显著增强了T细胞增殖。在高度增殖的T细胞中，RT联合ATR抑制在促进增殖方面效果最为显著。与经RT处理的HSC4肿瘤细胞共培养后，T细胞上的CD25表达下调。单独使用ATM抑制剂预处理肿瘤细胞相比ATR抑制剂显著降低了CD25表达。RT联合ATM抑制剂处理导致CD25表达升高，高于RT联合ATR抑制剂组。RT总体上上调了T细胞上的HLA-DR表达。与经RT联合ATR抑制剂预处理的HSC4细胞共培养进一步提高了HLA-DR表达，高于单独RT或RT联合ATM抑制剂组。

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