高效逆转录病毒转导与竞争性归巢用于研究G蛋白偶联受体介导的T细胞在多种组织微环境中的定位

我们的研究探讨了 GPCR 如何影响免疫细胞在各种组织微环境中的运输和定位。使用该协议和其他补充协议，我们的实验室在非肠粘膜组织中确定了器官特异性化学引诱剂轴。所以现在，我们已经发现了淋巴细胞是如何成为胃、肺、气管和 GU 束的家园。我提出了一种有效且改进的方法来测试单个 GPCR 如何影响体内 T 细胞运动。我们已经开发出一种可靠的方法将这些受体引入 T 细胞，现在可以在竞争性归巢测定中直接并排比较。现在我们知道了 GPCR 如何在体内引导 T 细胞，研究人员可以更好地将受体表达与免疫功能联系起来。这将有助于基础免疫学以及治疗研究的研究人员。通过这种方法，我们现在可以询问鲜为人知或未表征的GPCR如何参与引导T细胞到特定组织。我们可以了解如何微调 GPCR 信号传导以治疗癌症或自身免疫。我们可以帮助 T 细胞在正确的时间到达正确的位置进行治疗方法。

[旁白]首先，在第一天，在10厘米的组织培养板上涂上5毫升每毫升50微克的聚D-赖氨酸溶液，这些溶液在无菌水中制备。将板在室温下孵育45分钟，然后用不含钙和镁的无菌PBS洗涤板两次，以确保没有残留物。接下来，使用两毫升0.05%胰蛋白酶和0.5毫摩尔EDTA在37摄氏度下分离Plat-E细胞三分钟。为使用台盼蓝排除测定确保细胞活力，请将等体积的细胞悬液与台盼蓝溶液混合。然后，在装有不含抗生素的Plat-E培养基的10厘米组织培养培养皿中接种300万个活细胞。在第二天，用 6.5 毫升还原血清培养基替换 Plat-E 细胞培养物上的培养基。根据制造商的说明制备转染混合物。对于每个板，在一个试管中混合 45 微升 Lipofectamine 2000 与 210 微升还原血清培养基，在另一个管中混合 15 微克 DNA 与 235 微升还原血清培养基。通过移液三到四次混合管的内容物，并在室温下孵育20分钟，以促进复合物的形成。现在，将混合物滴加到板中，并在 37 摄氏度下孵育 16 小时。接下来，在每孔 375 微升 PBS 中用抗小鼠 CD28 和 CD3 涂覆用于 T 细胞激活的 24 孔板。将板在4摄氏度下孵育过夜，或在设置为4摄氏度的培养箱中孵育三到四个小时。在第三天，使用注射器柱塞将分离的小鼠脾脏轻轻捣碎在放置在含有RPMI培养基的六孔板中的100微米尼龙网状细胞过滤器上。将细胞悬液通过40微米尼龙网细胞过滤器转移到50毫升锥形管中，以获得单细胞悬液。将溶液以 450g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后用不含钙和镁的PBS洗涤细胞。接下来，根据制造商的说明，使用小鼠 T 细胞 CD4 分离试剂盒进行磁性阴性选择。使用细胞计数器计数分离的 T 细胞。在一毫升RPMI 10培养基中以每孔1至150万个细胞的密度将T细胞接种在包被的T细胞激活孔中。将细胞与5%二氧化碳在37摄氏度下在加湿培养箱中孵育24至48小时。在第四天，将大约 12 毫升的病毒上清液从 10 厘米的板收集到锥形管中。用 10 毫升不含抗生素的 Plat-E 培养基替换 Plat-E 培养板中的培养基，以产生更多的病毒上清液，用于第二天的第二次转导。要过滤收集的病毒上清液，请将其通过 0.45 微米注射器过滤器。向过滤后的上清液中加入每毫升 8 微克 Polybrene 和 1 至 100 稀释的 HEPES 缓冲液。以950g旋转24孔T细胞板7分钟。然后，小心地收集并保存上清液，不要移位 T 细胞。要进行裂染，请向每个孔中加入一毫升病毒上清液。用保鲜膜密封板，在 32 摄氏度下以 1,150 克旋转板 4 小时。感染后，小心地用先前保存的 T 细胞上清液更换每个孔中的培养基。在第六天，将 T 细胞从板收集到锥形管中并离心。用含有钙和镁的PBS洗涤沉淀。将细胞转移到含有每毫升小鼠白细胞介素-2 130单位和每毫升小鼠白细胞介素-7 10 纳克的新培养板中。将细胞孵育至少两天，或直到它们根据注射所需的细胞数量达到所需的扩增水平。第八天，在4摄氏度下以450g离心5分钟，以沉淀细胞。在 15 毫升管中加入 5 毫升 Histopaque-1077。将 T 细胞沉淀重悬于五毫升含有钙和镁的 PBS 中。小心地将细胞悬液分层在离心管中的五毫升 Histopaque-1077 上。在室温下将样品以 400 至 500g 离心 20 分钟，确保离心机断裂或加速度设置为 0。离心后，观察不同细胞层的形成。使用移液器小心收集包含所需细胞的界面层，避免被其他层污染。GPR25转导的T细胞相对于填充物转导的对照表现出向hCXCL17和mCXCL17的迁移增强，验证了功能性受体表达。GPR25转导的细胞优先定位于非肠粘膜组织，如泌尿生殖道，胃和气管，在注射后7周观察到显着富集，但在注射后1周没有观察到。短期归巢实验表明，GPR25转导的T细胞优先归巢于富含Cxcl17的器官，如气管、胃、舌头、胆囊和子宫黏膜，而未能在Cxcl17缺陷小鼠中积累。GPR25 转导的细胞主要位于支气管，而对照细胞更常见于静脉附近。