Name: 高效的逆转录病毒转导和竞争归巢，用于研究 GPCR 介导的 T 细胞在不同组织微环境中的定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习逆转录病毒转导和竞争归巢技术，用于研究GPCR介导的T细胞在不同组织微环境中的定位机制。该方法为免疫学基础研究及免疫相关疾病治疗策略的开发提供重要依据。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01 AI178113 和 R01 AI047822，Leona M. &amp; Harry B. Helmsley 慈善信托基金资助项目编号 1903-03787，以及加州烟草相关疾病研究计划（TRDRP）资助项目 T31IP1880 和 T33IR6609（授予 E.C.B.）；Y.B. 获克罗恩病与结肠炎基金会研究学者奖（835171）资助；B.O. 获拉蒙·阿雷塞斯基金会（西班牙马德里）博士后奖学金及克罗恩病与结肠炎基金会研究学者奖（574148）资助；A.A. 获加州再生医学研究所（CIRM）EDUC2-12677 项目资助。

本研究中所有小鼠均饲养于退伍军人事务部帕洛阿尔托医疗保健系统（VAPAHCS）的特定病原体阴性（SPF）设施中。B6/SJL Prprc Pep3BoyJ（CD45.1）、C57B6/J（CD45.2）和 Rag1-/- 小鼠购自杰克逊实验室。尽管我们使用PepBoy小鼠获取CD45.1细胞，但我们推荐使用JAXBoy（C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J）。JAXBoy是通过CRISPR技术而非传统回交方式构建的完全同源品系，具有更高的遗传一致性。以往使用非完全同源的PepBoy小鼠（CD45.1）进行CD45同种型标记研究时，通常需设置野生型（WT/WT）对照，以开展归巢和再循环实验，从而应对潜在的变异性。随着完全同源的JAXBoy小鼠现已可获得，这些额外的对照可能不再必要。研究人员仍应注意到CD45.1与CD45.2亚型之间的差异——例如它们作为蛋白酪氨酸磷酸酶的功能差异——可能会影响细胞行为和归巢模式。文中及下文所述所有实验方案均已获得批准，或符合退伍军人事务部帕洛阿尔托医疗保健系统（VAPAHCS）认证的实验动物医学科以及实验动物护理行政小组的指导方针&#160;。动物处死采用经批准的程序&#160;进行。实验中纳入了年龄为8–12周的雄性和雌性小鼠&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;。
1. MSCV 载体的制备
<ol>
	<li>购买带有小鼠目的基因（GOI）编码区或ORF_Stuffer（阴性ORF对照）的MSCV-IRES-Thy1.1逆转录病毒载体 
	注：该载体结构包含与目的GPCR基因共同表达的Thy1.1表面标记物。内部核糖体进入位点（IRES）连接序列可实现GPCR与Thy1.1的共表达，从而便于通过流式细胞术鉴定转导细胞，或通过磁珠进行纯化与分离。当缺乏针对GPCR的特异性抗体时（在研究较少的GPCR中常见），此方法尤为有用。</li>
	<li>获取以细菌形式保存的MSCV质粒，并通过接种含适当抗生素（根据质粒所携带的抗性基因选择，如氨苄青霉素、卡那霉素或氯霉素）的Luria-Bertani（LB）培养基进行培养。LB培养基的成分为胰蛋白胨（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）和NaCl（10 g/L），调节pH至7.0，经高压灭菌处理。将培养物置于37 °C摇床（220 RPM）中过夜培养。</li>
	<li>使用DNA提取试剂盒等标准分子生物学技术制备质粒储备液。</li>
	<li>DNA提取完成后，使用分光光度计测定DNA浓度，并将质粒工作液配制为1 µg/µL的浓度。将质粒储存于-20 °C以备后续使用。</li>
</ol>
2. 建立包装细胞系培养
注意：我们使用了来自 Cell Biolabs 的 Platinum E（Plat-E）细胞。Plat-E 细胞是一种基于 293T 的细胞系，含有 EF1α 启动子，可稳定且高效地表达逆转录病毒结构蛋白（gag、pol 和 env 基因），从而通过单质粒转染实现逆转录病毒的包装8。尽管其他细胞系（如 NIH-3T3 或 293T）也可能使用，但我们未测试这些替代方案。
<ol>
	<li>制备Plat-E细胞培养基：加入DMEM、10% FBS、1%青霉素/链霉素、杀稻瘟菌素（10 µg/mL）和嘌呤霉素（1 µg/mL）。在细胞维持期间使用杀稻瘟菌素和嘌呤霉素，但在转染期间及转染后 omit 这两种抗生素。</li>
	<li>将 Plat-E 细胞以 1.0 mL 冻存管形式运送 &#62;3 × 106 细胞/mL，DMEM，20% FBS，10% DMSO。在37 °C水浴中快速解冻。将所有解冻后的细胞转移至含有Plat-E培养基的15 mL锥形管中。</li>
	<li>450 x g 离心 g 4 °C下离心5分钟。用1 mL Plat-E培养基轻轻吹打细胞沉淀，重悬成单细胞悬液。</li>
	<li>向10 cm培养皿中加入9 mL Plat-E培养基，然后将1 mL重悬的细胞转移至培养皿中。通过将等体积的细胞悬液与台盼蓝混合，使用血细胞计数板或细胞计数仪计数活细胞（未染色）和死细胞（蓝色染色），以确认冻存细胞的活力，目标为 &#62;70% 存活率</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育细胞2最初3天内不要更换培养基；首次冻存细胞复苏时出现漂浮细胞和死亡细胞是正常现象。</li>
	<li>当细胞融合度达到85%–90%时，用DMEM/PBS Ca-/Mg-洗涤。加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/0.5 mM EDTA消化，37 °C孵育3分钟。加入8 mL Plat-E培养基终止消化，将细胞收集至15 mL锥形离心管中，450 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>以1:10或1:5的表面积比例进行传代（即用原培养皿总体积的1/10或1/5接种新培养皿）。用终体积10 mL的Plat-E培养基重悬细胞，于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中孵育2.</li>
	<li>将剩余细胞用含10% DMSO的1 mL FBS分装，于-80 °C冷冻，随后置于液氮中长期保存。 
	注意：当细胞融合度接近85%时，按上述方法处理细胞。为保持细胞最佳状态，应避免过度融合，并以每3天按1:10比例传代为宜。若细胞生长减缓，应使用新的分装样品。细胞性能通常随传代次数增加而下降。建议在第4至第15代之间进行转染实验，以获得最佳结果。</li>
</ol>
3. 转导细胞的制备
<ol>
	<li>第1天：接种Plat E细胞 
	注意：计算所需的Plat E细胞数量和培养板数量。我们采用24孔板，每孔加入1 mL病毒上清液，对细胞进行两次转染。通常情况下，每24孔板培养的T细胞需要使用约两个10 cm的Plat-E细胞转染培养皿。
	<ol>
		<li>首先，用5 mL浓度为50 µg/mL的聚-D-赖氨酸无菌水溶液对10 cm组织培养板进行包被。室温孵育45分钟。用无钙、无镁的无菌PBS洗涤2次，以确保无残留物。 
		注意：我们建议对培养板进行包被，因为Plat-E细胞在转染后容易脱落，导致细胞状态不佳和病毒滴度降低。</li>
		<li>按照步骤2.6所述方法消化Plat-E细胞，并进行台盼蓝排斥实验以检测细胞活力。取等体积的细胞悬液与台盼蓝混合，使用血细胞计数板或细胞计数仪计数活细胞（未染色）和死细胞（蓝色染色）的数量。将3 × 10⁶个活细胞接种至含无抗生素Plat-E培养基的10 cm组织培养培养皿中。 
		注意：接种后的培养板在第二天应达到85%–90%的融合度。若未达到此标准，建议更换细胞分装样品。根据接种时间调整接种密度；若为晚间接种，采用3.5 × 106 细胞可以使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：Plat-E细胞的转染以及使用抗CD3和抗CD28抗体包被T细胞培养板
	<ol>
		<li>将 Plat-E 细胞培养物的培养基更换为 6.5 mL 低血清培养基。</li>
		<li>根据Lipofectamine试剂的制造商说明书配制转染混合物（本研究使用的是Lipofectamine 2000）。</li>
		<li>每个培养板，取一支离心管加入45 µL Lipofectamine 2000和210 µL低血清培养基，另取一支离心管加入15 µg DNA和235 µL低血清培养基。用移液器将两管液体混合，吹打3至4次。</li>
		<li>室温孵育混合物5-20分钟，使Lipofectamine/DNA复合物形成，然后逐滴加入培养板中。将培养板于37 °C孵育16小时。</li>
		<li>T细胞激活孔：在第3天，将24孔板每孔加入375 µL PBS，分别加入终浓度为5 µg/mL的抗小鼠CD28（37.51）和10 µg/mL的抗小鼠CD3（145-2c11），4 °C过夜包被，或37 °C孵育箱中孵育3–4小时。 
		&#8203;注意：若需过夜孵育，应将培养板用透明薄膜包裹，以防止蒸发。Dynabeads 小鼠激活剂 CD3/CD28 可作为替代方案，获得相当的结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：更换Plat-E培养基，并分离和激活T细胞
	<ol>
		<li>早晨将Plat-E转染培养基更换为14 mL完全DMEM培养基。通过添加以下成分制备T细胞培养基：RPMI-10，即含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基，10% FBS，1%青霉素/链霉素，1× MEM非必需氨基酸，1 mM丙酮酸钠，50 µM β-巯基乙醇和1 mM HEPES。</li>
		<li>使用 CO₂ 处死 JAXBoy（CD45.1）和 C57B6/J（CD45.2）小鼠2吸入麻醉后行颈椎脱位处死。在无菌条件下分离脾脏和淋巴结。</li>
		<li>使用注射器活塞在6孔板中用RPMI培养基将脾脏轻轻碾压通过100 µm尼龙网细胞筛。</li>
		<li>将溶液通过40 µm尼龙网细胞筛过滤，获得单细胞悬液，收集至50 mL锥形管中。以450 x g 4 °C 下离心 5 分钟，并用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 洗涤。</li>
		<li>使用小鼠 T 细胞/CD4+ 分离试剂盒（Mouse T/T CD4 Isolation Kit）按照制造商说明书进行磁性阴性筛选，或 alternatively 使用无菌 FACS 分选细胞</li>
		<li>使用细胞计数器对T细胞进行计数，并将其以1-1.5 × 10⁶个细胞/孔的密度接种至T细胞活化孔中6 每孔加入1 mL RPMI-10培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育。根据显微镜下观察结果判断细胞活化情况，按照下文备注中的说明，孵育24–48小时以实现充分活化。 
		注意：在此实验设置中，CD3 和 CD28 的交联可有效激活 T 细胞。一只小鼠脾脏通常可获得约 1 x 108 脾细胞。CD4+ T细胞通常约占总脾细胞群体的10%。因此，为制备每孔含1-1.5 × 10⁶个细胞的24孔板，6 每孔约需 CD4+ T 细胞，估计 2-3 只小鼠的细胞量即可满足。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天：转导
	<ol>
		<li>24 小时后在显微镜下观察 T 细胞。转导前需确认 T 细胞处于活化增殖状态（因活化而形成簇集且体积增大）。处于增殖状态的 T 细胞可确保其处于分裂期，这对 MSCV 转导至关重要9.</li>
		<li>从10 cm培养皿中收集约10 mL病毒上清液至锥形管中。将Plat-E细胞培养皿中的培养基更换为10 mL不含抗生素的Plat-E培养基，以确保有足够的培养基用于次日进行第二次转导。根据T细胞数量调整Plat-E培养皿中的培养基体积。&#160;需要在第二天进行转染的孔。 
		注意：&#160;转导效率提高了2倍。</li>
		<li>将病毒上清液通过0.45 µm注射器滤器过滤。加入8 µg/mL的polybrene和1:100的HEPES。</li>
		<li>将24孔T细胞板在950 × g条件下离心7分钟 g小心收集上清液并妥善保存，避免扰动细胞。此上清液含有T细胞激活后分泌的细胞因子及其他因子，在离心转导（spinfection）后用该上清液替换原有培养基，以维持细胞因子和分泌因子的谱型，支持T细胞的增殖与生长。</li>
		<li>通过将1 mL病毒上清液加入每孔中，并在1,150 x g条件下离心进行旋转感染 g 在32 °C下孵育4小时。离心感染期间用塑料膜密封培养板。</li>
		<li>离心感染后，小心地将培养基更换为先前保存的T细胞上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天：重复转导
	<ol>
		<li>按照第4天所述方法重复转染。可选步骤：若培养基显示耗尽，可将步骤3.4.3中保存的初始激活T细胞的上清液与新鲜培养基按1:1比例混合使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第6天：洗涤细胞并扩增
	<ol>
		<li>用含钙镁的 PBS 洗涤细胞，然后将细胞转移至新的培养板中，加入终浓度为 130 U/mL 的小鼠 IL2 和 10 ng/mL 的小鼠 IL7。根据注射所需细胞数量，将细胞培养至少 2 天，或培养至达到所需的扩增水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第8天：收获与纯化
	<ol>
		<li>收集细胞，并用密度为1.077的Histopaque梯度离心法进行纯化。 
		注意：该技术有助于从死亡细胞或碎片中分离出活细胞（如淋巴细胞或其他免疫细胞）。死亡细胞密度较高，会沉降至管底，而活细胞通常保留在界面层。</li>
		<li>加入5 mL Histopaque 1.077至15 mL离心管中。以450 x g离心收集细胞 g 在4 °C下离心5分钟以沉淀细胞。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于5 mL PBS Ca+/Mg+中。在离心管中，小心地将细胞悬液铺加在5 mL Histopaque 1.077溶液上方。</li>
		<li>在 400-500 x g 条件下离心 g 室温下离心20分钟，确保离心机的刹车/加速度设置为零。</li>
		<li>离心后，细胞会根据密度分离成不同的层。目标细胞通常位于Histopaque与上层培养基之间的界面层，而死细胞则沉降至底部。使用移液器小心收集界面层的细胞，避免混入其他层的成分。所收集的细胞现已准备好，可直接用于注射。</li>
		<li>通过Thy1.1染色和流式细胞术分析评估转导效率。参见设门策略 图1. 
		注意：转导后，可将细胞用于趋化性实验，通过与对照载体细胞比较其向特定趋化因子的迁移能力，以功能性验证其活性 体外 在进行注射之前。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>长期 体内 定位实验
	<ol>
		<li>对于长期归巢实验，使用 CD45.1 标记表达目标小鼠 GPCR 的细胞，CD45.2 标记空载体对照（或 反之亦然) 转导细胞。将两种细胞群体按1:1比例混合。</li>
		<li>静脉注射 20-30 x 106 每个的总细胞数 Rag1-/- 成年受体小鼠中持续 1 周的嗜性及 5 x 106 为期7周的嗜性实验。我们使用淋巴细胞缺陷型 Rag1-/- 受体以减少与内源性 T 细胞的竞争。</li>
		<li>1至7周后（根据研究而定），在收获小鼠前5分钟，通过静脉注射抗CD45抗体以标记血液来源的细胞。</li>
		<li>使用 CO2 吸入麻醉后行颈椎脱位处死。 
		注意：已开展为期1周和7周的研究；更长时间的研究可能可行，但尚未经过测试。</li>
		<li>从目标器官和对照器官中收获细胞。根据各器官的标准淋巴细胞分离方案对组织进行消化处理10,11.</li>
		<li>使用单克隆抗体（mAbs）对收集的细胞进行染色，用于流式细胞术分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>短期竞争性归巢：T细胞定位与成像
	<ol>
		<li>我们建议使用 C57B6/J 小鼠作为供体，因为我们将对细胞进行荧光标记。然而，对于持续数小时的短期归巢实验，可使用任何品系的小鼠。</li>
		<li>在培养第8天，按照制造商说明书，使用CD90.1磁珠磁分离转导成功的（Thy1.1+）细胞12.</li>
		<li>仅维持转导的细胞（&#62;在上述条件下，在 IL2 和 IL7 中继续培养 2 天，使细胞扩增。磁珠可生物降解，48 小时后不会影响细胞正常功能。</li>
		<li>第11天，使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE，一种荧光细胞染料）标记表达目标G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞。对于Stuffer细胞，使用黄色荧光染料，反之亦可。可根据需要选用其他染料。
		<ol>
			<li>制备浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的细胞悬液6 细胞/mL，加入终浓度为5 µM的染料，在37 °C水浴中轻柔振荡孵育20分钟。为确保结果可比性，应在不同实验中交替使用染料分配方案。或者，可使用单一染料标记一种共有的细胞类型作为内部标准，将实验组和对照组细胞分别置于不同受体中。</li>
			<li>将标记的细胞洗涤后按1:1比例混合。使用细胞计数仪估算细胞浓度。注射15-30 × 106 将细胞通过静脉注射到受体小鼠（根据实验目的选择野生型或转基因受体小鼠）体内。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>约10-12小时后，向小鼠注射抗CD31抗体（例如，DyLight 633标记，克隆号390），注射时间应在处死小鼠前10-15分钟，以标记血管结构，并区分血管内与外渗的细胞。</li>
		<li>使用 CO2 吸入后行颈椎脱位处死。通过流式细胞术分析细胞悬液中的细胞定位，方法如上文步骤3.8所述；或使用共聚焦显微镜对目标器官进行组织全层成像分析，方法如步骤3.9.8或步骤3.9.7所述。</li>
		<li>对于气管、子宫角或淋巴结等较薄的器官，制备压片标本。将组织置于载玻片上，载玻片两侧贴有双面胶，加入数滴Fluoromount-G封片液，盖上盖玻片，再用另一张载玻片或其他平整物体轻轻且均匀地按压，使盖玻片固定于双面胶上。</li>
		<li>对于冰冻切片，将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。对于肺组织，包埋前需用50% OCT/PBS灌注。</li>
		<li>使用流式细胞术检测外周淋巴结（PLN）、脾脏或血液等对照器官，以评估转导效率（% Thy1.1+），如下所示。 图1 并标准化结果。使用共聚焦显微镜通过压片法或切片观察PLN。利用共聚焦显微镜结合Imaris软件进行细胞计数。</li>
		<li>确定GPCR转导细胞与对照（Stuffer转导）细胞在完整器官或特定器官区室中的比例。通过流式细胞术（FACS）测定的输入比例进行归一化，或相对于已知或推测GPCR无关的对照器官中回收的比例进行归一化。</li>
		<li>使用 Imaris 软件测量细胞与组织学标志物（如支气管基底膜或静脉）之间的距离，以分析肺部微环境中的定位。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Alawar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solution+for+highly+efficient+electroporation+of+primary+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A solution for highly efficient electroporation of primary cytotoxic T lymphocytes.</a> BMC Biotechnol. 24 (1), 16(2024).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中所述的内对照归巢实验是一种全面的方法，用于检测G蛋白偶联受体介导的T细胞在不同器官和组织微环境中的迁移与定位。该方法整合了多项关键优化，以提高实验的可重复性、准确性和效率。
本方案的一个关键环节是利用MSCV逆转录病毒载体高效转导T细胞，这一过程通过使用Plat-E细胞进行病毒生产而得以实现。关键优化措施包括：保持Plat-E细胞在适当的汇合度，使用聚-D-赖氨酸包被的培养板以增强病毒转染效率，以及采用双重转导策略以最大化GPCR的表达。由于MSCV载体需要细胞处于活跃分裂状态才能有效整合至基因组，因此通过T细胞活化诱导其进入细胞周期可显著提高逆转录病毒的转导效率。高浓度的抗CD3和CD28抗体对于确保T细胞的活化和母细胞化至关重要，我们的研究发现，这种方法比文献中报道的较低浓度更为有效14。我们还发现，在培养基中添加细胞因子IL-2和IL-7对于维持T细胞存活并促进其扩增至关重要，从而确保获得足够数量且状态良好的转导T细胞，以支持准确的迁移与归巢研究。
除了优化逆转录病...

G蛋白偶联受体（GPCRs）在调控多种细胞过程（包括信号转导、神经传递、激素调节和免疫细胞迁移）中起着基础性作用1。它们在淋巴细胞迁移和定位的时空调控中发挥关键作用2。在免疫应答的启动阶段，局部微环境和细胞间相互作用促使T淋巴细胞表达一组独特的黏附分子和趋化因子受体，即归巢受体。这种适应性使经历过抗原刺激的T细胞能够与器官特异性的内皮细胞（ECs）相互作用，并迁移至特定靶组织。T细胞获得组织趋向性的能力对于有效的再次免疫应答至关重要，尤其是在同一器官反复发生感染的情况下3,4。
G蛋白偶联受体（GPCRs）引导免疫细胞迁移至特定组织和器官，在这些部位执行关键功能——例如，引导CD8+ T细胞和NK细胞归巢至肿瘤部位以发挥细胞毒性作用，或协助CD4+ T细胞通过促进其他免疫细胞的活化来协调免疫应答。深入理解GPCRs如何精确引导T细胞定位，对于推动靶向免疫治疗的发展至关重要5,6然而，挑战在于对这些复杂的相互作用进行建模 体外因为同时复制空间受限的信号和方向性趋化信号具有较大难度。
阐明特定白细胞受体的功能通常具有挑战性，原因在于这些受体在内源性细胞群体中的表达频率较低，且这些受体通常分布于不同的细胞类型上。这种复杂性使得难以将特定受体的功能与其它细胞亚群特异性机制区分开来。理想的方法应比较彼此相似的细胞群体，仅在目标受体上存在差异，从而提供清晰的结论。
为克服这些挑战，我们采用了一种竞争性归巢检测方法，该方法利用重组 MSCV 逆转录病毒转导在 T 细胞中高效表达 GPCR。MSCV 逆转录病毒载体结合了基于骨髓增殖性肉瘤病毒（PCMV）的 MESV 载体和基于莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的 LN 载体的元件，并引入了源自 LN 载体的扩展杂合包装信号7该修饰提高了基因递送效率，能够实现对T细胞定位的短期和长期研究 体内通过使用高滴度逆转录病毒颗粒和共聚焦显微镜，该方法可实现对T细胞在复杂组织环境中定位及相互作用的精确可视化。本文提供了逆转录病毒转导归巢受体以及开展内部对照（即竞争性）归巢实验的详细操作流程，以研究受体介导的器官特异性和微环境特异性淋巴细胞定位。该方法的总体目标是深入揭示免疫细胞迁移机制，并为今后的基础研究与治疗开发提供有力工具。

<table><tbody><tr><td>AF647 抗小鼠 CD90.1-Thy1.1 (OX-7)</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>202507</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD31 (DyLight 633，克隆 390)</td><td>InvivoMab&amp;nbsp;</td><td>BE0377</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD28 37.51</td><td>eBiosciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 145-2c11</td><td>eBiosciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APCCy7 抗小鼠 CD3 (145-2c11)</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100329</td><td></td></tr><tr><td>BV421 抗小鼠 CD8b&amp;nbsp;(Ly-3)</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>126629</td><td></td></tr><tr><td>BV711 抗小鼠 CD4 (RM4-5)&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>100549</td><td></td></tr><tr><td>CD90.1 磁珠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi&amp;nbsp;</td><td>130-121-273</td><td></td></tr><tr><td>CFSE&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific&amp;nbsp;</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素 (FITC) 抗小鼠 CD45.2 (104)</td><td>BD</td><td>AB_395041</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL2&amp;nbsp;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-02-50UG</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL7&amp;nbsp;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;217-17-10UG</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 T 细胞 CD4 分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL technologies&amp;nbsp;</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MSCV-IRES-Thy1.1 GPR25</td><td>Vectorbuilder&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSCV-IRES-Thy1.1 空载体</td><td>Vectorbuilder&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-CD45 (30-F11) 抗体&amp;nbsp;</td><td>Biolegend&amp;nbsp;</td><td>103105</td><td></td></tr><tr><td>PECy7 抗小鼠 TCRβ&amp;nbsp;(H57-597)</td><td>Tonbo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PercpCy5.5 抗小鼠 CD45.1 (A20)</td><td>eBiosciences&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E (Plat-E)&amp;nbsp;</td><td>cell Biolabs. Inc&amp;nbsp;</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>黄色荧光染料&amp;nbsp;</td><td>Thermoscientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高效逆转录病毒转导与竞争性归巢用于研究g蛋白偶联受体介导的t细胞在多种组织微环境中的定位

Efficient Retroviral Transduction and Competitive Homing for Investigating GPCR-Mediated T-Cell Localization in Diverse Tissue Microenvironments

了解G蛋白偶联受体（GPCR）表达如何影响细胞在不同组织微环境中的定位，对于阐明免疫细胞迁移机制至关重要。本文介绍了一种竞争性归巢实验方法，可用于研究由GPCR介导的T细胞向表达相应趋化因子配体的器官的定位，适用于短期和长期研究。该方法包括改进的重组小鼠干细胞病毒（MSCV）转导T细胞的实验流程，以表达目标GPCR或对照结构，随后将细胞输入受体小鼠进行竞争性归巢实验。通过流式细胞术和/或共聚焦显微镜分析细胞在不同器官中的分布情况。在短期实验（10–12小时）中，共聚焦显微镜揭示了明显的细胞定位模式，包括肺部的肺泡、支气管黏膜下层、静脉部位和间质，以及气管、胃和子宫角上皮层。在长期研究（1–7周）中，流式细胞术揭示了细胞在组织中优先富集的动态变化，以及随时间推移可能发生的成熟或重新定位过程。这种竞争性归巢实验是研究GPCR介导的细胞定位的有力工具，可为组织特异性分布提供重要见解，并在免疫学和治疗研究中具有潜在应用价值。

本研究中，我们提供了一种详细方案，用于探究特定受体在体内引导T细胞定位的能力。作为该方案的应用示例，我们使用了GPR2513通过流式细胞术检测Thy1.1染色评估，采用本方案可实现30%–40%的转导效率。我们进行了 体外 使用GPR25转导细胞及空载体对照细胞进行基于transwell的趋化迁移实验，检测其向hCXCL17、mCXCL17以及作为阳性对照的CXCL12的迁移能力。与空载体转导细胞相比，GPR25转导的T细胞对CXCL17表现出显著迁移活性，证实了转导成功及受体的功能性表达（图2).
长期归巢 
图1 展示了分析不同器官中T细胞的设门策略。在组织收获前5分钟注射抗CD45抗体，以排除血管内细胞的干扰。仅纳入TCRβ+ CD4+ Thy1.1+细胞，该表型提示转导成功。计算每个器官中表达GPCR的细胞与携带空载体...

我们提出了改进的逆转录病毒转导技术，用于研究受体介导的淋巴细胞在器官和特定微环境中的定位，结合竞争性归巢实验分析。该方法可深入揭示免疫细胞迁移机制，并在未来的基础研究和治疗研究中具有广阔的应用前景。

高效逆转录病毒转导与竞争性归巢用于研究G蛋白偶联受体介导的T细胞在多种组织微环境中的定位

理解G蛋白偶联受体（GPCR）表达如何影响细胞在多种组织微环境中的定位，对于……至关重要

我们的研究探讨了 GPCR 如何影响免疫细胞在各种组织微环境中的运输和定位。使用该协议和其他补充协议，我们的实验室在非肠粘膜组织中确定了器官特异性化学引诱剂轴。所以现在，我们已经发现了淋巴细胞是如何成为胃、肺、气管和 GU 束的家园。我提出了一种有效且改进的方法来测试单个 GPCR 如何影响体内 T 细胞运动。我们已经开发出一种可靠的方法将这些受体引入 T 细胞，现在可以在竞争性归巢测定中直接并排比较。现在我们知道了 GPCR 如何在体内引导 T 细胞，研究人员可以更好地将受体表达与免疫功能联系起来。这将有助于基础免疫学以及治疗研究的研究人员。通过这种方法，我们现在可以询问鲜为人知或未表征的GPCR如何参与引导T细胞到特定组织。我们可以了解如何微调 GPCR 信号传导以治疗癌症或自身免疫。我们可以帮助 T 细胞在正确的时间到达正确的位置进行治疗方法。[旁白]首先，在第一天，在10厘米的组织培养板上涂上5毫升每毫升50微克的聚D-赖氨酸溶液，这些溶液在无菌水中制备。将板在室温下孵育45分钟，然后用不含钙和镁的无菌PBS洗涤板两次，以确保没有残留物。接下来，使用两毫升0.05%胰蛋白酶和0.5毫摩尔EDTA在37摄氏度下分离Plat-E细胞三分钟。为使用台盼蓝排除测定确保细胞活力，请将等体积的细胞悬液与台盼蓝溶液混合。然后，在装有不含抗生素的Plat-E培养基的10厘米组织培养培养皿中接种300万个活细胞。在第二天，用 6.5 毫升还原血清培养基替换 Plat-E 细胞培养物上的培养基。根据制造商的说明制备转染混合物。对于每个板，在一个试管中混合 45 微升 Lipofectamine 2000 与 210 微升还原血清培养基，在另一个管中混合 15 微克 DNA 与 235 微升还原血清培养基。通过移液三到四次混合管的内容物，并在室温下孵育20分钟，以促进复合物的形成。现在，将混合物滴加到板中，并在 37 摄氏度下孵育 16 小时。接下来，在每孔 375 微升 PBS 中用抗小鼠 CD28 和 CD3 涂覆用于 T 细胞激活的 24 孔板。将板在4摄氏度下孵育过夜，或在设置为4摄氏度的培养箱中孵育三到四个小时。在第三天，使用注射器柱塞将分离的小鼠脾脏轻轻捣碎在放置在含有RPMI培养基的六孔板中的100微米尼龙网状细胞过滤器上。将细胞悬液通过40微米尼龙网细胞过滤器转移到50毫升锥形管中，以获得单细胞悬液。将溶液以 450g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后用不含钙和镁的PBS洗涤细胞。接下来，根据制造商的说明，使用小鼠 T 细胞 CD4 分离试剂盒进行磁性阴性选择。使用细胞计数器计数分离的 T 细胞。在一毫升RPMI 10培养基中以每孔1至150万个细胞的密度将T细胞接种在包被的T细胞激活孔中。将细胞与5%二氧化碳在37摄氏度下在加湿培养箱中孵育24至48小时。在第四天，将大约 12 毫升的病毒上清液从 10 厘米的板收集到锥形管中。用 10 毫升不含抗生素的 Plat-E 培养基替换 Plat-E 培养板中的培养基，以产生更多的病毒上清液，用于第二天的第二次转导。要过滤收集的病毒上清液，请将其通过 0.45 微米注射器过滤器。向过滤后的上清液中加入每毫升 8 微克 Polybrene 和 1 至 100 稀释的 HEPES 缓冲液。以950g旋转24孔T细胞板7分钟。然后，小心地收集并保存上清液，不要移位 T 细胞。要进行裂染，请向每个孔中加入一毫升病毒上清液。用保鲜膜密封板，在 32 摄氏度下以 1,150 克旋转板 4 小时。感染后，小心地用先前保存的 T 细胞上清液更换每个孔中的培养基。在第六天，将 T 细胞从板收集到锥形管中并离心。用含有钙和镁的PBS洗涤沉淀。将细胞转移到含有每毫升小鼠白细胞介素-2 130单位和每毫升小鼠白细胞介素-7 10 纳克的新培养板中。将细胞孵育至少两天，或直到它们根据注射所需的细胞数量达到所需的扩增水平。第八天，在4摄氏度下以450g离心5分钟，以沉淀细胞。在 15 毫升管中加入 5 毫升 Histopaque-1077。将 T 细胞沉淀重悬于五毫升含有钙和镁的 PBS 中。小心地将细胞悬液分层在离心管中的五毫升 Histopaque-1077 上。在室温下将样品以 400 至 500g 离心 20 分钟，确保离心机断裂或加速度设置为 0。离心后，观察不同细胞层的形成。使用移液器小心收集包含所需细胞的界面层，避免被其他层污染。GPR25转导的T细胞相对于填充物转导的对照表现出向hCXCL17和mCXCL17的迁移增强，验证了功能性受体表达。GPR25转导的细胞优先定位于非肠粘膜组织，如泌尿生殖道，胃和气管，在注射后7周观察到显着富集，但在注射后1周没有观察到。短期归巢实验表明，GPR25转导的T细胞优先归巢于富含Cxcl17的器官，如气管、胃、舌头、胆囊和子宫黏膜，而未能在Cxcl17缺陷小鼠中积累。GPR25 转导的细胞主要位于支气管，而对照细胞更常见于静脉附近。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

高效的逆转录病毒转导和竞争归巢，用于研究 GPCR 介导的 T 细胞在不同组织微环境中的定位

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小鼠T细胞中T细胞受体的逆转录病毒转导

竞争性归巢实验可直接在单个小鼠体内评估两种不同细胞群体的迁移特性。本文通过比较体外生成的肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移能力，说明该实验方法。...

研究肠道趋向性T细胞迁移的竞争性归巢实验

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

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逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

为了理解调控T细胞发育及其在免疫应答中功能的机制，人们已采用多种实验系统。本文介绍一种使用逆转录病毒转导的遗传学方法，该方法经济、高效，且最重要的是，能够高度有效地识别调控通路。...

逆转录病毒感染辅助性T细胞作为一种研究调控其分化与功能机制的遗传学方法

当前方案结合了单细胞配对的人类 T 细胞受体 α 和 β 链测序与简化流程的逆转录病毒载体构建，该载体具有兼容性 体外 和 体内 TCR...

简化单细胞TCR分离及逆转录病毒载体构建 体外 和 在体 内 人类TCR的表达

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通过共聚焦显微镜检测配体激活的G蛋白偶联受体的内化

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在小鼠B-1a细胞中通过逆转录病毒过表达CXCR4并进行过继转移，以实现B-1a细胞向骨髓的靶向迁移及IgM的产生

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逆转录病毒CRISPR/Cas9介导的基因靶向技术用于体外研究Th17细胞分化

学习逆转录病毒转导和竞争归巢技术，用于研究GPCR介导的T细胞在不同组织微环境中的定位机制。该方法为免疫学基础研究及免疫相关疾病治疗策略的开发提供重要依据。

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