通过颅窗口在新皮层的血流量为双光子成像方法

对活啮齿动物完整大脑中的脑血管系统进行成像和记录血流动力学的能力是一项强大的技术，可应用于脑缺血或正常大脑生理学的研究。在这里，我们将演示如何使用两种照相显微镜，使用注射到尾静脉中的荧光染料对活小鼠新皮层中的血流动力学进行成像。该技术最初由 David Kleinfeld 在 Winfred Dank 中开发。

大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校神经病学系 Carlos Porter Cayo 实验室的 Ricardo Mota。在之前的视频中，我们向您展示了植入颅窗进行体内慢性成像实验的方法。今天，我们将向您展示通过颅窗对大脑皮层中的血流动力学进行成像的程序。

这种准备工作非常有用，因为它允许人们使用光子激光显微镜对大脑深处进行成像。所以让我们开始吧。为了对脑血管系统进行成像，必须向动物静脉注射荧光染料。

我们使用 Dexter 偶联染料，因为 dextron moty 可以防止染料穿过血脑屏障并从血管中泄漏。用 isof 氟麻醉小鼠，4% 用于诱导，注射期间为 1.5 至 2%。接下来，用 70 号针头用三根 26% 酒精棉签对尾部进行消毒，通过尾静脉注射 75 至 100 微升溶于盐水中的 5% 多米葡聚糖溶液。

在尾静脉注射后，可以立即对尾巴动物的轴中途进行成像，直到模具从尿液中排泄，如果使用 ERO 多米染料，它会变成粉红色在荧光 Dexter 染料注射后大约两个小时内，用 isof 氟麻醉小鼠。同样，诱导为 4%，成像为 1 到 1.5%。使用钛棒将鼠标牢固地固定在显微镜载物台上，显微镜载物台包含一个热调节加热垫，以保持动物温暖。

涂抹一些眼药膏以保持眼睛湿润。颅窗的盖玻用 70% 的酒精清洗。窗口平行于焦平面放置，并在视野中居中。

在四个 x 目标下，最好用数码相机拍摄大脑表面血管的照片。这张图片将用作后续成像会话中的参考图像，以每天重复查找图像区域。然后将 4 x 物镜替换为水浸 40 x 物镜。

在不移动舞台的情况下，拍摄视图的数字图片。同样，舞台纵器的坐标设置为零。我们使用扫描图像作为图像采集软件。

这是由 Tom Paul Rudo 和 Bernardo Sabatini 在 Carls Voto 实验室用 MATLAB 编写的。接下来，我们打开所有其他设备，激光器、功率计、光电倍增管、放大器等。以低放大倍率对适合成像的窗口区域进行简短扫描，以找到最佳区域。

一旦确定了这些，就会拍摄所选成像区域的低放大倍率堆栈，并将其 XY 坐标注释为记录小血管或毛细血管中的血流动力学。我们沿着感兴趣血管的至少 40 微米进行线扫描。这些持续一秒钟的单次扫描使用尽可能少的激光功率完成，并记录扫描的坐标和角度。

成像过程结束后，动物被转移到温暖的房间，在那里它可以从麻醉中恢复过来。在这里，我们展示了一组每五微米拍摄的一百张图像，使用我们的双光子显微镜通过放置在五个月大的小鼠的体感皮层上的颅窗，该小鼠通过尾静脉注射了 r Domine 葡聚糖。这一系列图像显示了大血管和小血管的复杂网络，包括毛细血管。

我们刚刚向您展示了一种通过颅窗可视化体内血流动力学的方法。这是一种非常强大的方法，用于对皮质脉管系统中的脑血流动力学进行成像，例如，研究中风后血流的变化。通过使用荧光染料的重复尾静脉注射，可以在不同时间在 BUL 中进行多次想象。

进行此程序时，请务必记住在最干净、更无菌的条件下工作，并保持手部非常稳定。好了，就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。