通过颅窗口在新皮层的血流量为双光子成像方法
2008年2月25日
皮质血流动力学，可以研究在体内注入尾静脉鼠类与双光子显微镜的成像荧光葡聚糖染料。本视频演示了如何通过玻璃覆盖的颅窗口准备在小鼠大脑皮层的图像血液血流动力学。
对活啮齿动物完整大脑中的脑血管系统进行成像和记录血流动力学的能力是一项强大的技术，可应用于脑缺血或正常大脑生理学的研究。在这里，我们将演示如何使用两种照相显微镜，使用注射到尾静脉中的荧光染料对活小鼠新皮层中的血流动力学进行成像。该技术最初由 David Kleinfeld 在 Winfred Dank 中开发。
大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校神经病学系 Carlos Porter Cayo 实验室的 Ricardo Mota。在之前的视频中，我们向您展示了植入颅窗进行体内慢性成像实验的方法。今天，我们将向您展示通过颅窗对大脑皮层中的血流动力学进行成像的程序。
这种准备工作非常有用，因为它允许人们使用光子激光显微镜对大脑深处进行成像。所以让我们开始吧。为了对脑血管系统进行成像，必须向动物静脉注射荧光染料。
我们使用 Dexter 偶联染料，因为 dextron moty 可以防止染料穿过血脑屏障并从血管中泄漏。用 isof 氟麻醉小鼠，4% 用于诱导，注射期间为 1.5 至 2%。接下来，用 70 号针头用三根 26% 酒精棉签对尾部进行消毒，通过尾静脉注射 75 至 100 微升溶于盐水中的 5% 多米葡聚糖溶液。
在尾静脉注射后，可以立即对尾巴动物的轴中途进行成像，直到模具从尿液中排泄，如果使用 ERO 多米染料，它会变成粉红色在荧光 Dexter 染料注射后大约两个小时内，用 isof 氟麻醉小鼠。同样，诱导为 4%，成像为 1 到 1.5%。使用钛棒将鼠标牢固地固定在显微镜载物台上，显微镜载物台包含一个热调节加热垫，以保持动物温暖。
涂抹一些眼药膏以保持眼睛湿润。颅窗的盖玻用 70% 的酒精清洗。窗口平行于焦平面放置，并在视野中居中。
在四个 x 目标下，最好用数码相机拍摄大脑表面血管的照片。这张图片将用作后续成像会话中的参考图像，以每天重复查找图像区域。然后将 4 x 物镜替换为水浸 40 x 物镜。
在不移动舞台的情况下，拍摄视图的数字图片。同样，舞台纵器的坐标设置为零。我们使用扫描图像作为图像采集软件。
这是由 Tom Paul Rudo 和 Bernardo Sabatini 在 Carls Voto 实验室用 MATLAB 编写的。接下来，我们打开所有其他设备，激光器、功率计、光电倍增管、放大器等。以低放大倍率对适合成像的窗口区域进行简短扫描，以找到最佳区域。
一旦确定了这些，就会拍摄所选成像区域的低放大倍率堆栈，并将其 XY 坐标注释为记录小血管或毛细血管中的血流动力学。我们沿着感兴趣血管的至少 40 微米进行线扫描。这些持续一秒钟的单次扫描使用尽可能少的激光功率完成，并记录扫描的坐标和角度。
成像过程结束后，动物被转移到温暖的房间，在那里它可以从麻醉中恢复过来。在这里，我们展示了一组每五微米拍摄的一百张图像，使用我们的双光子显微镜通过放置在五个月大的小鼠的体感皮层上的颅窗，该小鼠通过尾静脉注射了 r Domine 葡聚糖。这一系列图像显示了大血管和小血管的复杂网络，包括毛细血管。
我们刚刚向您展示了一种通过颅窗可视化体内血流动力学的方法。这是一种非常强大的方法，用于对皮质脉管系统中的脑血流动力学进行成像，例如，研究中风后血流的变化。通过使用荧光染料的重复尾静脉注射，可以在不同时间在 BUL 中进行多次想象。
进行此程序时，请务必记住在最干净、更无菌的条件下工作，并保持手部非常稳定。好了，就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本视频展示了使用双光子显微镜技术对活体小鼠新皮层血流动力学进行成像的技术。将荧光右旋糖酐染料注射到尾静脉，从而可以对大脑血管进行体内观察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管成像
- 体内技术
背景
- 成像大脑血流对于理解大脑生理学至关重要。
- 该技术可以应用于脑缺血研究。
- 双光子显微镜允许对血流动力学进行详细成像。
- 荧光染料提供了对血管进行可视化的对比度。
研究目的
- 展示新皮层血流动力学的成像。
- 展示颅窗在长期成像中的应用。
- 为对该技术感兴趣的研究人员提供视觉指南。
使用的方法
- 向小鼠尾静脉注射荧光右旋糖酐染料。
- 使用双光子显微镜进行成像。
- 准备一个玻璃覆盖的颅窗以便接触新皮层。
- 对活体啮齿动物的血流动力学进行体内成像。
主要结果
- 成功可视化了新皮层的血流动力学。
- 展示了颅窗准备的有效性。
- 说明了荧光染料在成像中的应用。
- 对大脑血管和血流调节提供了洞察。
结论
- 该技术为大脑生理学提供了宝贵的洞察。
- 它可以应用于涉及大脑血流的各种研究中。
- 该方法增强了我们对脑缺血和相关疾病的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
In vivo 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window enables high-resolution, quantitative assessment of cerebral microvascular dynamics in living rodents. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurovascular and neurodegenerative disease research pipelines. The method supports predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points, informing portfolio decisions for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vascular responses to experimental perturbations in disease-relevant brain regions.
- Supports functional target validation by quantifying blood flow changes in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular targets to physiological vascular outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantitative measurement of blood flow dynamics.
- Enables reproducible imaging of the same cortical region across multiple sessions for longitudinal studies.
- Supports assay standardization through controlled dye administration and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of vascular function in models of stroke, neurodegeneration, and brain tumors.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing quantitative endpoints relevant to human disease.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling robust, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a bridge between molecular target identification and functional validation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neurovascular mechanisms and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible blood flow measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of blood flow parameters across experimental groups and timepoints.
- Translational Research: Provides endpoints aligned with clinical imaging biomarkers of cerebral perfusion.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS vascular studies across therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with quantitative, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, in vivo imaging, and quantitative analysis.
- Demands access to 2-photon microscopy, image acquisition software, and animal support infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dye preparation, injection, and imaging protocols.
- Adaptation to other rodent models or brain regions may require protocol optimization.
- Imaging depth and dye clearance kinetics may limit applicability for certain experimental designs.
