Name: 通过颅窗口在新皮层的血流量为双光子成像方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 学习使用双光子显微镜结合颅窗技术对小鼠新皮层进行活体血流动力学成像的方法。通过尾静脉注射荧光葡聚糖染料，研究人员可深入观察脑血管结构与血流调节机制，为脑缺血等神经系统疾病研究提供重要技术支持。

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荧光葡聚糖染料的尾静脉注射
<ol>
<li>为了成像脑血管系统，需通过静脉注射荧光染料。我们使用与葡聚糖偶联的染料，因为葡聚糖部分可防止染料穿过血脑屏障并从血管中渗漏。</li>
<li>小鼠使用异氟烷进行麻醉（诱导浓度为4%，注射期间维持在1.5-2%）。</li>
<li>用70%酒精对尾部进行消毒。</li>
<li>使用26号针头，将75–100 µl浓度为5% v/v的罗丹明-葡聚糖生理盐水溶液注入尾静脉，注射位置位于尾杆中段。</li>
<li>尾静脉注射后可立即开始成像，直至染料随尿液排出；若使用罗丹明染料，尿液约在2小时后变为粉红色。</li>
</ol>
使用双光子显微镜成像血流（每次实验总时长为30-60分钟，具体时间取决于成像血管的数量）
<ol>
<li>注射荧光葡聚糖染料后，使用异氟烷对小鼠进行麻醉（诱导浓度为4%，成像时为1-1.5%）。</li>
<li>通过钛条将小鼠牢固地固定在显微镜载物台上，载物台配备有温控加热垫以维持动物体温。同时涂抹眼膏以保持眼睛湿润。</li>
<li>用70%酒精清洁颅窗的盖玻片。</li>
<li>在4倍物镜下，将颅窗调整至与焦平面平行，并置于视野中央。</li>
<li>最好使用数码相机拍摄脑表面血管的照片。该图像将在后续成像过程中作为参考图，以便逐日重复定位成像区域。</li>
<li>在不移动载物台的情况下，将4倍物镜更换为水浸40倍物镜，并再次拍摄视野的数码图像。将载物台操控器的坐标设为零。</li>
<li>我们使用ScanImage作为图像采集软件。该软件由Tom Pologruto和Bernardo Sabatini在Karel Svoboda实验室中基于MatLab编写（Pologruto等，2003年）。接下来，我们开启所有其他设备：激光器、功率计、光电倍增管、放大器等。</li>
<li>首先在低倍镜下对颅窗中适合成像的区域进行快速扫描，以确定最佳成像区域。一旦确定目标区域，即采集该区域的低倍图像序列，并记录其XY坐标。</li>
<li>为记录小血管或毛细血管中的血流动力学，我们沿目标血管至少40 µm的长度进行线扫描。这些持续一秒钟的单次“扫描”应尽可能使用最低的激光功率完成，同时记录扫描的坐标和角度。</li>
<li>成像结束后，将动物转移至温暖的恢复舱中，使其从麻醉状态中苏醒。</li>
</ol>

<ol><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).</li>
<li>Zhang, S., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+impact+of+cortical+microcirculation+on+synaptic+structure+and+sensory-evoked+hemodynamic+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo.</a> 5, (2007).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).</li>
</ol>

可通过双光子显微镜成像技术，在活体动物中研究经尾静脉注射的荧光葡聚糖染料在大脑皮层的血流动力学。本视频展示了一种通过玻璃覆盖的颅窗制备方法，对小鼠新皮层血流动力学进行成像的技术。

<table><tbody><tr><td>异硫氰酸荧光素-葡聚糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>分子量 500,000</td></tr><tr><td>异硫氰酸罗丹明B-葡聚糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>分子量 ~70,000</td></tr></tbody></table>

一种通过颅窗对新皮层血流进行双光子成像的方法

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

对活体啮齿类动物完整大脑中的脑血管系统（从大血管到毛细血管）进行成像并记录血流动力学变化，是一项强大的技术。通过颅窗利用活体双光子显微镜，可对经静脉注射的荧光染料进行成像，从而观察大脑皮层血管结构，并获取血流动力学参数的测量数据。该技术最初由 David Kleinfeld 和 Winfried Denk 开发。此方法可用于研究脑缺血期间或之后、神经退行性疾病、脑肿瘤以及正常脑生理状态下的血流动力学变化。例如，已有研究利用该技术探讨卒中如何引起梗死区域及其周围血流方向的改变，以及红细胞速度或通量的变化。本文将演示如何通过尾静脉注射荧光染料，结合双光子显微镜对活体小鼠新皮层中的血流动力学进行成像。

关键词：脑血管系统，血流动力学，双光子显微镜，颅窗，活体成像，新皮层，小鼠，荧光染料，尾静脉注射，红细胞流速

可通过双光子显微镜成像经尾静脉注射荧光葡聚糖染料的啮齿类动物，从而在活体中研究大脑皮层的血流动力学。本视频展示了如何通过覆盖玻璃的颅窗制备方法，对小鼠新皮层的血流动力学进行成像。

对活体啮齿类动物完整大脑中的脑血管系统（从大血管到毛细血管）进行成像并记录血流动力学的能力是……

对活体啮齿类动物完整大脑中的脑血管系统进行成像并记录血流动力学变化，是一种强大的技术手段，可用于脑缺血或正常脑生理学的研究。本文将演示如何利用两种光学显微技术，通过尾静脉注射荧光染料，对活体小鼠新皮层中的血流动力学进行成像。该技术最初由 David Kleinfeld 在 Winfred Dank 实验室开发。大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校神经病学系Carlos Porter Cayo实验室的Ricardo Mota。在之前的视频中，我们向您展示了用于体内长期成像实验的颅窗植入方法。今天，我们将向您展示通过颅窗对大脑皮层血流动力学进行成像的操作流程。这种制备方法非常有用，因为它允许人们利用双光子激光显微镜对大脑深部进行成像。现在让我们开始操作。为了成像脑血管系统，必须通过静脉向动物体内注射荧光染料。我们使用右旋糖酐偶联染料，因为右旋糖酐基团可防止染料穿过血脑屏障并从血管中渗出。小鼠采用异氟烷麻醉，诱导浓度为4%，注射过程中维持在1.5%至2%。随后，用70%酒精棉签擦拭尾部进行消毒，使用26号针头经尾静脉注射75至100微升浓度为5%的罗丹明右旋糖酐生理盐水溶液。在尾静脉注射后，可立即对动物尾部中段进行成像，直至染料通过尿液排出；若使用ERO二聚体染料，尿液将在约两小时后呈现粉红色。在注射荧光示踪染料Dexter约两小时后，用异氟烷对小鼠进行麻醉，诱导浓度为4%，成像时维持在1%至1.5%。将小鼠通过钛金属杆牢固固定于显微镜载物台上，载物台内置温控加热垫以维持动物体温。涂抹一些眼膏以保持眼睛湿润。用70%酒精清洁颅窗的盖玻片。将颅窗调整至与焦平面平行，并置于视野中央。在4倍物镜下，最好使用数码相机拍摄脑表面血管的照片。该图像将作为后续成像过程中每天重复定位成像区域的参考图像。随后将4倍物镜更换为40倍水浸物镜。在不移动载物台的情况下，拍摄视野的数字图像。再次将载物台操纵器的坐标设为零。我们使用 Scan Image 作为图像采集软件。该程序由 Tom Paul Rudo 和 Bernardo Sabatini 在 Carls Voto 的实验室中使用 MATLAB 编写。接下来，我们开启所有其他设备，包括激光器、功率计、光电倍增管、放大器等。以低倍率快速扫描成像窗口的合适区域，以找到最佳成像区域。确定这些区域后，对选定成像区域进行低倍镜下的图像堆栈采集，并标注其 XY 坐标，以记录小血管或毛细血管中的血流动力学。我们沿感兴趣血管至少 40 微米的长度进行线扫描。每次单次扫描持续一秒钟，应使用尽可能低的激光功率完成，同时记录扫描的坐标和角度。成像结束后，将动物转移至温暖的恢复室，使其从麻醉状态中苏醒。此处展示的是使用双光子显微镜，对一只五个月大、经尾静脉注射了荧光标记右旋糖酐的小鼠，通过覆盖于体感皮层上方的颅窗，每隔五微米采集一层、共一百层图像所形成的图像堆栈。该图像序列显示了包括毛细血管在内的大小血管构成的复杂网络。我们刚刚向您展示了一种通过颅窗在活体中可视化血流动力学的方法。该方法在成像大脑皮层血管系统的血流动力学方面极为强大，例如可用于研究卒中后血流的变化情况。通过重复尾静脉注射荧光染料，可在不同时间点对同一只动物进行多次成像。进行此操作时，务必牢记应在尽可能洁净和无菌的条件下进行，并且需要非常稳定的手法。好了，就这些。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

a-method-for-2-photon-imaging-blood-flow-neocortex-through-cranial

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过颅窗口在新皮层的血流量为双光子成像方法

本视频和实验方案演示了如何在啮齿类动物中植入玻璃覆盖的颅窗。此类制备可用于长期活体双光子成像，对新皮层进行数月时间尺度的观察。该方法也可用于其他类型的成像，包括光学内在信号成像。...

一种用于慢性脑成像的开颅手术操作流程

在本视频及补充材料中，我们展示了一种利用磨薄颅骨制备法对完整大脑进行长期在体成像的实验方案。...

使用磨薄颅骨制备法对小鼠视觉皮层进行长期成像

我们介绍一种在小鼠颅骨上制备成像窗口的方法，该窗口可跨越数毫米，并且在数月内保持稳定，且不会引起脑部炎症。该方法非常适合利用双光子显微镜进行血流、细胞动态以及细胞/血管结构的长期研究。...

一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

来源：Bisht, K.，等．通过精确脑图谱实现小鼠神经-免疫动态的重复活体成像．J. Vis. Exp.

利用颅骨植入物进行神经-免疫动态的荧光成像

本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。...

结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

神经元中依赖于经验的分子变化对于大脑应对行为挑战时的适应能力至关重要。 体内...

体内 双光子成像技术观察皮层神经元中由经验引起的相关分子变化

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

体内双光子成像技术在新生小鼠皮层神经元中的应用

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

我们提出了一种新的方法，利用双光子显微镜在小鼠模型中研究荧光标记的氧化铁纳米颗粒向胶质母细胞瘤递送的过程。...

小鼠模型中胶质母细胞瘤的双光子活体显微成像

学习使用双光子显微镜结合颅窗技术对小鼠新皮层进行活体血流动力学成像的方法。通过尾静脉注射荧光葡聚糖染料，研究人员可深入观察脑血管结构与血流调节机制，为脑缺血等神经系统疾病研究提供重要技术支持。

一种通过颅窗对新皮层血流进行双光子成像的方法

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