Name: 使用表面等离子体共振技术鉴定 PD-1/PD-L1 抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 了解如何使用表面等离子体共振技术鉴定PD-1/PD-L1抑制剂。该方案通过阻断实验评估化合物或生物制剂的阻断率，支持癌症免疫治疗药物的高通量筛选，提高小分子药物研发效率。

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作者感谢罗德岛大学RI-INBRE核心设施的支持，该设施由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家研究资源中心（NCRR）资助（资助号：P20GM103430）。本研究得到了罗德岛大学药学院试点资助奖、罗德岛生命科学中心（RILSH）小型资助奖以及罗德岛基金会资助的支持，上述资助均授予刘畅博士（Chang Liu, Ph.D.）。

试剂和设备列在材料表中。
1. 在CM5芯片上固定链霉亲和素（SA）蛋白
<ol>
	<li>在 SPR 仪器上设置固定化方法： 新建向导 模板，选择 固定化，将芯片类型设置为 CM5，以及每个循环的流路细胞数 1检查 固定流通池1和流通池2.
	<ol>
		<li>设置 胺 采用固定化方法。设定固定化水平目标及配体浓度： 40 &#181;g/mL 链霉亲和素, 目标水平： 2000 RU，洗涤液： 50 mM NaOH接下来，运行前请检查进样系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备以下试管：R2 B1 和 R2 C1 - 40 &#181;g/mL 链霉亲和素；R2 B2 和 R2 C2：50 mM NaOH；R2 B3 和 R2 C3：EDC；R2 B4 和 R2 C4：NHS；R2 B5 和 R2 C5：空；R2 B6 和 R2 C6：乙醇胺。 
	注意：EDC 和 NHS 可激活 CM5 芯片上的羧基，从而与配体上的氨基发生共价偶联。乙醇胺用作封闭缓冲液，以防止固定化过程中发生非特异性结合。</li>
	<li>将 20 mL HBS-EP+ 缓冲液稀释 10 倍&#215; 在180 mL去离子水（DI水）中配制200 mL的1&#215; HBS-EP+ 运行缓冲液溶液</li>
	<li>向1 mg链霉亲和素中加入1 mL无DNase的水，在室温下孵育30分钟。随后将链霉亲和素溶液稀释至40 &#181;g/mL 的乙酸盐缓冲液（pH 4.5）中。根据生产商说明书配制胺偶联试剂盒的试剂，并按照步骤 1.2 所示放置所有相关试剂的位置。</li>
	<li>将维护用传感器芯片更换为CM5芯片，然后将A管放入已准备好的1&#215; HBS-EP+ 缓冲液，重新打开固定化方法，并按照步骤 1.2 的布局插入管子。 运行 该方法并保存结果文件。</li>
	<li>运行后维护：将CM5芯片更换为维护用传感器芯片，将A管放入盛有去离子水的瓶子中，运行引液程序。取出CM5芯片后，用数滴去离子水清洗芯片表面，并自然晾干。将芯片置于50 mL离心管中，于4 °C保存。 &#176;C. 
	注意：固定的SA使CM5芯片具备SA芯片的功能。</li>
</ol>
2. 在SA芯片上固定PD-1蛋白
<ol>
	<li>在 SPR 仪器上设置固定化方法：打开/新建向导模板，选择固定化，将芯片类型设为SA，每循环流路细胞数设为1。勾选固定化流路细胞 1 和细胞 2。
	<ol>
		<li>将方法设为SA-生物素捕获。细胞 1 设置为空白固定化，细胞 2 设置目标固定化水平，配体为10 µg/mL PD-1，目标水平：4000 RU，然后勾选运行前预润洗。 
		注意：准备以下试管 — R2 B1 和 R2 C1：1 M NaCl，50 mM NaOH；R2 B2 和 R2 C2：50% 异丙醇/50 mM NaOH/1 M NaCl；R2 C3：10 µg/mL PD-1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 58.44 mg NaCl 溶解于 1 mL 50 mM NaOH 中，配制 1 M NaCl 和 50 mM NaOH 溶液。将 58.44 mg NaCl 和 4.0 mg NaOH 溶解于 500 µL 水中，然后加入 500 µL 异丙醇，配制 50% 异丙醇/50 mM NaOH/1 M NaCl 溶液。</li>
	<li>配制 PD-1 溶液：向 100 µg 生物素化人 PD-1（Fc 和 Avitag 标记）中加入 200 µL 无 DNase 水，室温稳定 30 分钟，然后用乙酸盐缓冲液（pH 5.0）稀释至 10 µg/mL。</li>
	<li>按照步骤 2.1 所述放置所有试剂布局。将 A 管放入 1× HBS-EP+ 运行缓冲液中，弹出维护用传感器芯片并插入 SA 芯片（即步骤 1 中由链霉亲和素蛋白包被的 CM5 芯片）。重新打开固定化方法，插入试剂架 2，并核对位置，然后运行该方法，运行时间按预估时间执行。</li>
	<li>重复步骤 1.6。</li>
</ol>
3. PD-1 与 PD-L1 的再生条件筛选
<ol>
	<li>设置再生筛选方法：打开/新建向导模板，选择再生筛选，设置流路：2-1, 4-3，芯片类型为SA，勾选运行前平衡循环，记录溶液为 HBS-EP+，接触时间为30 s，注射次数为3，溶液为PD-L1，接触时间：30 s，流速：30 µL/min。
	<ol>
		<li>对于再生参数，流速为30 µL/min，稳定时间为300 s。在实验设计中，设置条件数量为4，每种条件的循环次数为2。设置条件为4种，再生溶液：甘氨酸 1.5, 2.0, 2.5, 3.0，接触时间：30 s，然后在运行前勾选预冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每种 PD-L1 浓度设置为 96 孔微孔板布局中的独立样品孔位置：R1 A1 至 R1 A9：1 µM PD-L1；R1 A10 至 R1 A12：HBS-EP+ 缓冲液；R1 B1：甘氨酸 1.5；R1 B2：甘氨酸 2；R1 B3：甘氨酸 2.5；R1 B4：甘氨酸 3。 
	注意：使用不同 pH 的甘氨酸缓冲液作为再生缓冲液。</li>
	<li>配制 PD-L1 溶液：向 100 µg 人 PD-L1 Fc 标签蛋白（9.42 µM）中加入 200 µL 无 DNase 水，然后用 HBS-EP+ 缓冲液稀释至 1 µM。</li>
	<li>按照步骤 3.2 所述，将所有相关试剂放置在指定位置。将 A 管放入 1× HBS-EP+ 缓冲液中，然后将维护用传感器芯片更换为 SA 芯片。重新打开再生筛选方法，根据步骤 3.2 的管路位置插入试剂架，然后运行该方法，运行时间按预估时间执行。</li>
	<li>重复步骤 1.6。</li>
</ol>
4. PD-1/PD-L1 相互作用的验证
注意：验证实验参照先前已发表的文献18，并进行了少量调整。
<ol>
	<li>使用与已发表报告相同的参数 常规设置，实验步骤，以及 循环类型，将接触时间设置为 60 秒解离时间 60 秒，以及流速 30 &#181;L/min. 在 方法变量，评估变量 以及 命令，使用相同的设置，但以甘氨酸 2.0 取代 再生，设置流速为 30 &#181;L/min，依次流经通道1、2、3、4。
	<ol>
		<li>然后设置 运行，并选择流路： 2-1, 4-3. 输入浓度从 0 开始的 PD-L1 &#181;M, 0.037 &#181;M, 0.111 &#181;M, 0.333 &#181;M，分子量为51,300 Da。运行前请核对所有检测步骤并选择进样。</li>
		<li>然后在试剂架2布局中将每种PD-L1浓度设置为独立的样品孔位：R2 B1：PD-L1 0 &#181;M；R2 B2：PD-L1 0.037 &#181;M；R2 B3：PD-L1 0.111 &#181;M；R2 B4：PD-L1 0.333 &#181;M；R2 A1：以甘氨酸 2.0 作为再生缓冲液；R2 A2：以 HBS-EP+ 作为启动缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 200 mL 的 1&#215; HBS-EP+ 运行缓冲液溶液。配制 PD-L1 浓度：将 PD-L1 蛋白稀释至 9.42 &#181;M 到 0.333 &#181;M, 0.111 &#181;M，以及 0.037 &#181;M 的 HBS-EP+ 缓冲液中，然后按照步骤 4.1.2 所述将所有相关试剂放入布局中。
	<ol>
		<li>将试管 A 插入 1&#215; HBS-EP+ 运行缓冲液溶液，弹出维护传感器芯片，插入 SA 芯片。重新打开 再生 scouting 方法，按照步骤 4.1 的管路定位，插入试剂架 2，并 运行 估算持续时间的方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 1.6。</li>
</ol>
5. 使用小分子抑制剂 BMS-1166 的 PD-1/PD-L1 阻断实验
注意：阻断实验参照先前发表的文献18，并进行了少量调整。
<ol>
	<li>使用与已发表报告相同的参数 常规设置，实验步骤，以及 循环类型，将接触时间设置为 60 秒解离时间至 60 秒，流速为30 &#181;升/分钟。在 方法变量，评估变量 和 命令 也使用相同的设置，但以甘氨酸 2.0 取代 再生，设置流速为 30 &#181;L/min，依次流经通道1、2、3、4。
	<ol>
		<li>然后设置运行，并选择流路： 2-1, 4-3. 加入样品溶液：PD-L1（0.111 &#181;M，分子量为 51,300 Da）与 BMS-1166 在 0 &#181;M, 0.125 &#181;M, 0.625 &#181;M, 3.125 &#181;M. 检查所有检测步骤以进行验证，并在运行前选择清洗。</li>
		<li>然后在试剂架2布局中将每种PD-L1浓度设置为独立的样品孔位：R2 B1：PD-L1（0.111 &#181;M) + BMS-1166 0 &#181;M R2 B2：PD-L1（0.111 &#181;M) + BMS-1166 0.125 &#181;M；R2 B3：PD-L1（0.111 &#181;M) + BMS-1166 0.625 &#181;M；R2 B4：PD-L1（0.111 &#181;M) + BMS-1166 3.125 &#181;M；R2 A1：再生用甘氨酸 2.0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 200 mL 的 1&#215; HBS-EP+ 流动缓冲液溶液。配制 BMS-1166/PD-L1 混合物：将 5 mg BMS-1166 溶于 77.99 &#181;L 二甲基亚砜（DMSO）配制 100 mM 储备液。用 PD-L1 蛋白（0.11 &#181;M）稀释至 BMS-1166 的目标浓度 0 &#181;M, 0.125 &#181;M, 0.625 &#181;M 和 3.125 &#181;M in HBS-EP+。按照步骤5.1.2所述放置所有相关试剂。
	<ol>
		<li>将试管 A 放入 1&#215; HBS-EP+ 运行缓冲液溶液，然后弹出维护用传感器芯片并插入 SA 芯片。重新打开 再生 scouting 方法，按照5.1中的管位，插入试剂架2，然后 运行 估算运行时间的方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 1.6。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近几十年来，包括癌症疫苗、免疫检查点抑制剂和CAR T细胞疗法在内的多种免疫治疗策略已显著推动了癌症治疗的发展21。免疫检查点在防止病原体反应过程中免疫细胞介导的附带损伤以及抑制自身免疫方面发挥着关键作用。其中一个典型例子是PD-L1与PD-1之间的相互作用，该作用构成主要的免疫检查点通路，使癌细胞能够逃避免疫监视。针对PD-1/PD-L1通路的单克隆抗体在临床肿瘤学中已取得显著疗效。然而，由于单克隆抗体疗法存在诸多局限性，且免疫相关不良事件的发生率不断上升，目前人们越来越关注开发靶向PD-1/PD-L1的小分子抑制剂9,22。
目前针对小分子PD-1/PD-L1抑制剂的筛选策略主要集中在生物测定技术，如ELISA、基于细胞的报告基因检测和T细胞检测。表面等离子共振（SPR）和生物膜干涉技术（BLI）等生物物理技术虽广泛用于结合亲和力的表征，但其作为筛选工具的潜力仍被低估23</su...

免疫检查点阻断疗法，特别是靶向程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）和程序性细胞死亡配体-1（PD-L1）的疗法，处于癌症免疫治疗策略的前沿。抗PD-1/PD-L1疗法已获批准用于多种癌症类型，包括血液系统、皮肤、肺、肝、膀胱和肾癌1。PD-1是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，其特征是N端具有一个免疫球蛋白可变区（IgV）样结构域，其后是由约20个氨基酸组成的茎区，将IgV结构域与质膜分隔开，接着是跨膜结构域，以及含有基于酪氨酸的信号基序的胞质尾部2。PD-L1被确认为PD-1的配体之一，是一种I型跨膜蛋白，包含一个跨膜区、两个胞外结构域——免疫球蛋白恒定区（IgC）和IgV结构域——以及一个相对较短的胞质结构域，可触发细胞内信号通路3。PD-1/PD-L1抑制性通路作为关键的免疫检查点，调控T细胞活化和自身免疫反应4。PD-1在T细胞上表达，与PD-L1结合后可抑制T细胞受体信号传导，并阻断抗原呈递细胞和T细胞上CD28与CD80分子的共刺激作用5。在免疫逃逸阶段，肿瘤组织通过过度表达PD-L1来利用这一生理机制，从而形成免疫抑制微环境，促进肿瘤生长和进展6。PD-1和PD-L1抑制剂可阻断这一相互作用，使免疫系统能够摆脱肿瘤诱导的抑制状态，重新启动T细胞介导的肿瘤细胞死亡过程7。
在免疫检查点阻断疗法奠定的重要基础上，PD-1/PD-L1抑制剂的开发标志着癌症免疫治疗领域的重大进展。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准了九种专门靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂。其中包括六种PD-1抑制剂——帕博利珠单抗（pembrolizumab）、多塔利单抗（dostarlimab）、纳武利尤单抗（nivolumab）、西米普利单抗（cemiplimab）、奥瑞帕利单抗（oripalimab）和替雷利珠单抗（tislelizumab），以及三种PD-L1抑制剂——阿替利珠单抗（atezolizumab）、阿维鲁单抗（avelumab）和度伐利尤单抗（durvalumab）8,9。这些疗法已被有效用于治疗多种癌症，包括黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌、宫颈癌、胃癌或胃食管交界处癌以及其他实体瘤10。尽管疗效显著，基于单克隆抗体的治疗仍面临诸多局限性，例如应答率低、成本高昂、半衰期长、严重的免疫相关不良事件，以及仅限于静脉或皮下给药方式11,12,13。因此，研究日益聚焦于开发靶向PD-1/PD-L1轴的小分子抑制剂。这类小分子具有独特优势，如更好的细胞穿透能力、可调节多种生物学靶点、更高的口服生物利用度以及更低的成本，旨在实现与现有疗法相当的治疗效果，同时减少不良反应14。然而，靶向PD-1/PD-L1相互作用的小分子抑制剂仍处于早期研发阶段，主要原因是缺乏可靠的高通量筛选平台。此类平台对于快速评估大量小分子化合物库并识别出可用于进一步验证和优化的先导化合物至关重要。克服这一挑战对于推动癌症免疫治疗的发展具有关键意义。
表面等离子体共振（Surface Plasmon&#160;Resonance, SPR）技术被广泛用于检测多种生物分子，包括抗体抗原、酶、核酸和药物，在小分子药物筛选中尤为有效15,16。与其他生物物理技术相比，SPR具有无需标记、可提供实时动力学数据以及检测范围广等优势。相比之下，等温滴定 calorimetry（ITC）缺乏实时动力学信息，且需要较大的样品体积，限制了通量；微尺度热泳（Microscale Thermophoresis, MST）易受缓冲液干扰，且无法提供动力学数据；生物层干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）则因分子大小和性质不同而存在应用局限性；均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）需要标记，且易受荧光干扰。我们承认HTRF也是探索PD-1/PD-L1抑制剂的合适技术之一，但与SPR相比，HTRF存在固有局限性，例如分子内激发过程可能因外部相互作用（如电子转移、FRET和漂白）导致荧光猝灭，且由于信号窗口较窄，在药物筛选过程中灵敏度较低，并易受荧光文库化合物或生物蛋白的干扰17。这些特点使SPR成为药物发现中的更优工具。我们先前的研究已证明，SPR能够测定小分子对PD-1/PD-L1相互作用的阻断效应，相较于其他需要高标记技术要求、多步骤操作、特异性差且成本高的技术，SPR在药物发现过程中具有明显优势18。
本研究介绍了一种经过优化的基于表面等离子体共振（SPR）的检测平台，该平台整合了双步偶联过程，结合使用胺偶联和生物素-链霉亲和素偶联，以增强PD-1在芯片上的定向固定，同时最大限度减少蛋白用量。该改进方法已使用PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1166作为阳性对照结合物成功验证，结果显示其阻断效果与我们先前的SPR方法以及其他成熟技术（如ELISA19,20）相当。这不仅证实了本实验方案的可靠性与可重复性，也展示了改进后平台在高通量筛选PD-1/PD-L1抑制剂方面的有效性。通过引入生物素-链霉亲和素捕获步骤，实现了蛋白质的定点固定而非随机取向，从而降低了PD-1的使用浓度（40 µg/mL vs. 10 µg/mL），并通过允许终端用户将链霉亲和素（SA）固定于CM5芯片上，节省了成本——这是一种比商业化预固定SA芯片更经济的替代方案。因此，该方法适用于对化合物/多肽文库进行大规模、低成本的筛选。尽管仍需借助in silico、in vitro和in vivo等其他表征手段来评估PD-1/PD-L1抑制剂在抗癌方面的临床潜力，但本优化的基于SPR的筛选平台仍是开展PD-1/PD-L1抑制剂大规模筛选的高效工具。

<table><tbody><tr><td>50 mM NaOH</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>100358</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>905376</td><td></td></tr><tr><td>96孔聚苯乙烯微孔板</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100503</td><td></td></tr><tr><td>胺偶联试剂盒</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>35120</td><td></td></tr><tr><td>Biacore T200 SPR 系统及 Evaluation Software 3.2</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>28975001</td><td></td></tr><tr><td>生物素化人 PD-1 Fc Avitag 蛋白</td><td>Acro Biosystems</td><td>PD1-H82F1</td><td></td></tr><tr><td>BMS1166</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-102011</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>无DNase水</td><td>Fisher Scientific</td><td>188506</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸 1.5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100354</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸 2.0</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100355</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸 2.5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100356</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸 3.0</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100357</td><td></td></tr><tr><td>HBS-EP+ 缓冲液</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100669</td><td></td></tr><tr><td>人 PD-L1 Fc 标签蛋白</td><td>Acro Biosystems</td><td>PD-1-H5258</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板封口箔&amp;nbsp;</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>28975816</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>7 mm 塑料小瓶</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100212</td><td></td></tr><tr><td>橡胶盖，3型</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Series S CM5 传感器芯片</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>29149603</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠 4.5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>100350</td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠 5.0</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>100351</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr></tbody></table>

利用表面等离子共振技术鉴定pd-1/pd-l1抑制剂

Identifying PD-1/PD-L1 Inhibitors with Surface Plasmon Resonance Technology

阻断PD-1/PD-L1相互作用是癌症免疫治疗的一种有前景的策略。可靠的筛选平台对于评估PD-1/PD-L1抑制剂的效力至关重要。此前建立的一种利用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术的人源PD-1/PD-L1阻断检测方法（第一代PD-1/PD-L1抑制剂SPR筛选平台），其结果与均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）和基于细胞的检测方法相当，并具备大规模筛选的潜力。本文介绍该检测方法的优化版本（第二代PD-1/PD-L1抑制剂SPR筛选平台），其采用双步偶联工艺，结合胺偶联与生物素-链霉亲和素偶联，以增强PD-1在芯片上的取向控制，并减少PD-1蛋白的消耗。该更新后的平台使用PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1166进行了成功验证，显示出与先前基于SPR的方法以及其他成熟技术（如ELISA）相当的阻断效果。这些结果证实了该方法的可靠性。该优化的SPR筛选平台为发现新型PD-1/PD-L1抑制剂提供了高通量且可靠的工具，有助于推动癌症免疫治疗研究，并凸显了SPR技术在免疫检查点抑制剂筛选中的潜力。

SA在CM5芯片上的固定 
数据被分析 通过 SPR 仪器及其相关分析软件的输出结果，表明在流通池 1 和流通池 2 上成功实现了目标响应单位（2000 RU）的链霉亲和素（SA）蛋白固定。流通池 1 和 2 已固定 SA（40 μg/mL) 在CM5芯片表面，1号流路的最终响应值为1902.3 RU图1A）以及 1900.7 RU 在 2 号流通池（图1B).
PD-1 在 SA 芯片上的固定 
基于 SPR 仪器及其配套软件输出结果的数据分析显示，1 号流通池的空白对照组响应单位（RU）较低，2 号流通池中的 PD-1 配体成功达到目标 RU 值（4000 RU）。1 号流通池作为空白固定，最终响应值为 -161.0 RU（图 2A）；2 号流通池则固定了包被在 SA 芯片上的生物素化 PD-1 蛋白（1...

本方案描述了一种利用表面等离子共振技术检测PD-1/PD-L1抑制剂的阻断实验。该方法采用两步固定策略和定制的缓冲体系，精确测量响应单位，从而便于评估化合物或生物制剂的阻断率。此外，该方法还支持对PD-1/PD-L1抑制剂进行高通量筛选。

利用表面等离子共振技术鉴定PD-1/PD-L1抑制剂

阻断PD-1/PD-L1相互作用是癌症免疫治疗的一种有前景的策略。可靠的筛选平台对于评估……

我从事药物发现工作，致力于寻找新的癌症免疫检查点抑制剂，例如 PD-1、PD-L1。我的核心问题是：如何设计一个高通量筛选平台来加速这一进程？近年来，靶向 PD-1、PD-L1 的生物药物已取得显著进展。而小分子药物仍处于早期研发阶段，我们的目标是开发靶向 PD-1、PD-L1 的小分子药物。均相时间分辨荧光（HTIF）和af-ah-ly-zer是两种可用于PD-1、PD-L1抑制剂筛选的技术。小分子的溶解度以及缓冲液不匹配是当前实验中的主要挑战。我们发现，表面等离子体共振（SPR）不仅可以用于结合亲和力的测定，还可以作为PD-1、PD-L1抑制剂的筛选平台。[指导教师] 首先，打开表面等离子共振（SPR）仪器。点击“打开”或“新建向导模板”，选择“固定化”以设置固定化方法。将芯片类型设为 CM-5。选择 Amin 方法，并将每循环的流路池数量设为 1。然后勾选流路池一和流路池二进行固定，使用 40 微克/毫升的 SA（链霉亲和素）。选择“SA-生物素捕获”作为固定化方法。将流路池一设为空白固定化。对于流路池二，目标是使用 10 微克/毫升的 PD-1 作为配体，固定化水平达到 4,000 响应单位。然后勾选“运行前预启动”。将两个吸管尖端置于 HBSEP 阳性运行缓冲液中。弹出维护用传感器芯片，插入 CM-5 芯片。重新打开固定化方法。插入试剂架二，并核对试剂位置。按预估时间运行该方法。再次将两个吸管尖端放入 HBSEP 阳性运行缓冲液中。弹出维护芯片，插入 SA 芯片。重新打开固定化方法后，插入试剂架二并确认试剂位置。按预估持续时间运行方法。在验证 PD-1 与 PD-L1 相互作用时，在常规设置中将数据采集率设为 10 赫兹。检测模式为多通道。样品室温度设为 25 摄氏度，浓度单位为微摩尔。在检测步骤中，设定平衡步骤重复 10 次。启动动力学检测，重复 10 次。样品进入动力学检测阶段，重复 1 次，温度为 25 摄氏度。设定接触时间为 60 秒，解离时间为 60 秒，流速为 30 微升/分钟。在方法变量中，将属性设为变量，并选择样品溶液。在评估变量中，选择评估目的为“动力学亲和力”，并选择预定义变量为浓度和分子量（MW）。设置运行参数，选择流路路径为二到一和四到三。输入 PD-L1 的浓度：0 微摩尔、0.037 微摩尔、0.111 微摩尔 和 0.333 微摩尔，分子量为 51,300 道尔顿。准备 200 毫升 HBSEP 阳性运行缓冲液，并用运行缓冲液对 PD-L1 进行稀释。将所有试剂按布局放置到相应位置，并按预估时间运行。在阻断实验中，使用小分子抑制剂时，采用与验证测试相同的设置和流速。设置运行参数并选择流路路径后，输入样品 PD-L1 溶液和稀释的 BMS 1166 溶液。按照指定方式分配试剂架二中的孔位。然后将 5 毫克 BMS 1166 溶解于 77.99 微升 DMSO 中，配制 100 毫摩尔的母液。按指定方式排列所有试剂。在流路池一和流路池二上，链霉亲和素蛋白的固定化接近实现了 2000 响应单位的目标。流路池一最终响应为 1902.3 响应单位，流路池二为 1900.7 响应单位。流路池一的空白池响应较低，为 -161 响应单位，而流路池二达到了 4,000 响应单位的目标，最终响应为 3698.5。在测试的不同甘氨酸 pH 条件中，甘氨酸 pH 2.0 被确定为最适再生条件，具有稳定的基线响应，表明 PD-1 蛋白损失最小，且成功去除了 PD-L1。在不同浓度下，PD-L1 与 PD-1 的结合相互作用被定量检测，产生了可测量的响应信号。在 BMS 1166 稀释浓度为 0 至 3.125 微摩尔范围内，观察到其对 PD-1 与 PD-L1 结合相互作用的阻断效应。随着 BMS 1166 浓度的增加，结合响应单位呈比例下降。

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癌症研究

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