改良的最可能数法检测生鸡和即食鸡产品中的沙门氏菌

我们的研究致力于开发针对食源性病原体的快速检测、定量和表征技术，重点发展高灵敏度方法，以通过在实际环境中识别污染来提升食品安全水平。主要挑战包括在低成本且可扩展的解决方案下，实现对复杂基质中病原体的快速高灵敏度检测。我们还致力于解决减少假阳性结果以及提高与多种检测环境兼容性的难题。

对于食品安全而言，这意味着需要在多种食品基质中准确检测出低浓度的病原体。本方案填补了沙门氏菌检出与定量之间的空白，可提供食品产品中污染水平的确定性数值。该流程干扰性极小，因其整合了FSIS方案中已验证的检测方法，且具有足够的灵活性，可适用于其他病原体和食品基质。

首先，将从当地零售商生鲜肉类部门获取的绞鸡肉放置在操作平台上。在无菌条件下将肉分成每份25克的样品。从当地零售商冷冻食品区获取即食鸡肉产品，并在无菌条件下将其分成每份25克的样品。

在脑心浸液琼脂平板上划线接种伤寒沙门氏菌鼠伤寒血清型 ATCC 14028。于 37 摄氏度培养过夜。次日，取一新鲜培养的沙门氏菌单菌落接种至 25 毫升脑心浸液肉汤中。

在37摄氏度、100转/分钟振荡条件下，需氧培养过夜。为制备十倍系列稀释液，取0.5毫升培养物加入4.5毫升缓冲肽水（BPW）中，充分混匀；随后，从已制备的稀释液中取0.5毫升转移至4.5毫升BPW中，进行后续每一步的稀释。

接下来，将25克辐照灭菌的绞鸡肉无菌转移至无菌均质袋中。加入一毫升所需浓度的菌液稀释液对样品进行接种。使用无菌涂布棒将接种液轻轻均匀涂布于鸡肉表面，并于4摄氏度静置一小时。

将辐照的碎鸡肉样品与沙门氏菌培养物共同孵育一小时后，向每个样品中加入 225 毫升 BPW，以达到所需的样品与培养基比例。使用均质器以正常速度均质鸡肉样品 120 秒。用 50 毫升移液管小心地从均质器的滤过侧吸取液体，并将其均分至两个无菌离心管中。

将样品在10,000 G条件下离心10分钟，弃去上清液。用无菌刮勺将细胞沉淀重悬于3毫升BPW中。向重悬的沉淀中加入12毫升BPW，用无菌刮勺充分搅拌混匀。

将两个离心管中的内容物合并至一个离心管中。取3毫升重悬的样品，加入48孔板第一列的每个孔中，以制备八个重复样本。使用八通道移液器在第一至第六列进行十倍系列稀释：将每孔中的0.3毫升样品加入下一列含有2.7毫升BPW的孔中，并确保充分混匀。

将样品块在37摄氏度、100转/分钟振荡条件下孵育过夜。次日，使用多通道移液器，将每个稀释度的七微升培养物以四行六列的阵列形式接种至脑心浸液琼脂平板上。接种后静置平板10分钟，待其干燥，随后在37摄氏度孵育18至24小时。

孵育后，观察螺旋平板，至少标记一个菌落为阳性，无菌生长为阴性。在工作表中记录稀释倍数和稀释因子。输入样品相应的体积或重量。

然后指定重复次数，并输入检测结果为阳性的样本数量。点击“计算结果”按钮，使用简单的最大概率解析方法分析标注的阳性与阴性结果。首先，设置48孔MPN板，用于接种鸡样本的沙门氏菌培养。

用移液器反复吹打数次，将48孔板中的培养物混匀。将每种培养物各200 µL转移至96孔PCR板中。密封PCR板，并在6,600 ×g离心10分钟。

弃去上清液，向沉淀中加入 20 µL DNA 提取试剂盒试剂。通过移液吹打混匀沉淀。再次密封反应板，在 99 °C 下加热 10 分钟，随后冷却至 20 °C。

离心后，取上清液 2 µL，根据既定方案配制 QPCR 反应体系。采用以下条件进行实时 PCR。PCR 结束后导出结果，将循环阈值小于或等于 30 的孔视为阳性，大于 30 的孔视为阴性。

用移液器在48孔板中上下吹打数次以混匀培养物。将每份样品20微升转移至沙门氏菌分子检测试剂盒提供的含有裂解液的离心管中。在100摄氏度下加热样品15分钟。

然后在室温下孵育样品10分钟。从每个裂解管中转移20 µL裂解液至试剂管中，并将试剂管放入支架。将装有试剂管的支架加入分子检测系统仪器中。

设置分子检测系统检测的软件参数。运行检测并导出报告以进行分析。MDS 运行报告提供详细的输出信息，结果为阳性或阴性。