利用单细胞微升液滴培养组学系统实现微生物单克隆的自动化与高通量培养及挑取
2025年3月14日
本方案描述了如何使用单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell）进行微生物单克隆分离、培养和挑取。MISS cell 基于液滴微流控技术，实现了集成化的工作流程，具有优异的液滴单分散性、高通量平行培养以及高通量生物量检测能力。
本研究利用自动化平台探索微生物培养组学，以增强微生物的分离、培养和单克隆筛选，旨在加深对人类肠道微生物组及其应用的理解。推动微生物组研究的技术包括微流控液滴技术、自动菌株分离与筛选平台、机器学习算法，以及用于高通量菌株培养组学和微生物组分析的单克隆分配器。
中细胞系统显著增强了肠道微生物视图、单克隆分离和染色能力，与传统方法相比可产生近两倍数量的克隆，从而推动了肠道微生物视图共培养体系的研究能力。本方案解决了低成本、高通量微生物筛选平台的需求，克服了传统方法在共培养研究中效率低下和可评分性差的局限性。本实验室将进一步致力于整合更多液滴操控技术，例如液滴分裂与合并，以拓展该技术的应用范围。
首先，打开 MISS 细胞的液滴生成与培养室门。垂直取下微管路和液滴生成微流控芯片的保护盖。使用一次性注射器，向腔室内的加湿器中加入 10 毫升无菌蒸馏水，然后重新安装保护盖。
打开微管和液滴生成微流控芯片的无菌包装，将其垂直放置在培养室正上方。然后在软件界面中点击安装。当确认弹窗出现时，点击“是”以开始安装。
取出除气泡装置，将其倒置固定在腔室内的除气泡装置放置位上。将除气泡装置的液滴出口管连接至其下方的夹管阀，并经通路引导至液滴检测与收集腔室。
打开腔室门后，将检测管垂直插入检测插孔中。确保检测管完全插入。顺时针方向拧紧固定检测管的螺丝。
确认完全插入并固定后，关闭腔室门。将微流控芯片上标记为 L1 至 L10 的 10 根硅胶管分别连接到对应编号的夹管阀。接下来，根据正确的连接方式，将微流控芯片上的快速接头连接至组学系统上对应的端口。
芯片安装完成后，会弹出一个窗口，显示“液滴管路夹紧阀已打开”。当微管和液滴生成芯片安装完成后，点击“确定”。在确认所有管路均已正确连接至对应的夹紧阀后，点击“确定”。
在执行初始化之前，单击设置界面以配置相关参数，例如选择模式、培养温度、培养时间、摇床转速、OD检测波长以及荧光检测的激发和发射波长。进入主界面后，单击“初始化”。系统将弹出确认窗口，单击“是”，允许IC系统对其组件进行自检，包括进样泵、温度设置、废液排放测试、筛选模块和液滴检测模块。
初始化完成后，点击弹出窗口中的“确定”。样品制备时，取微生物样品，用相应的培养基进行系列稀释，使浓度约为每毫升50个细胞，获得40毫升的样品悬液。然后拧开样品瓶的瓶盖，将含有磁力搅拌子的稀释后粪便悬液倒入瓶中，直至达到样品添加刻度线处。
拧紧瓶盖并确保其牢固。然后将快速接头A插入快速接头B，以完成样品加载过程。将样品瓶放入指定位置后，将快速接头A和快速接头B从样品瓶上分离。
将样品瓶的快接接头A连接至omic系统上的O3端口。将微流控芯片上的C3接头连接至快接接头B，并关闭腔室门。在软件主界面中，选择要生成的液滴管路数量，然后点击“生成”以开始单细胞液滴生成。
等待弹出窗口提示液滴生成完成，然后点击“确定”。关闭三通连接器上的夹具，并取下样品瓶。在软件的主界面中，选择与液滴生成过程中所用相同的液滴管路编号。
点击培养。确认培养时间和温度，然后开始培养过程。等待弹出窗口，提示液滴培养已完成。
按下omic系统的UV按钮以开启紫外光（UV）。在关闭前，对液滴检测和收集室照射30分钟。在超净工作台内，打开所有用于液滴收集的96孔板，不加盖，自下而上依次叠放，并按顺序编号。
确保顶部孔板已盖上盖子。打开液滴检测与收集室的门，将孔板放置在指定位置。取下顶部孔板的盖子，然后关闭腔室门。
再次打开omic系统上的紫外灯，照射30分钟以进行二次灭菌。接着，将除气泡装置从放置位置取出。拧开盖子，并从盖子上取下蝶形螺钉。
将 200 毫升脱气油倒入脱气装置中。拧紧瓶盖，然后将脱气装置倒置并固定在指定位置。在主界面中，选择用于分选的液滴管路。
点击分选。输入要收集的孔板数量，然后启动分选过程。观察过程显示区域，以实时监测液滴的光密度或荧光值。
分析约 20 至 30 个液滴以检测 OD 值。若大多数液滴的 OD 值约为 0.2，则将下限 OD 阈值设为 0.5，上限 OD 阈值设为 4。系统将自动收集该范围内的液滴至 96 孔板中。
等待弹出窗口提示液滴分选与收集完成，然后点击“确定”。打开液滴检测与收集室的门。将孔板盖盖在顶部孔板上，然后一起取出孔板。
单击“导出数据”以保存采集的液滴信号数据。单击热图。选择液滴采集数据文件，并以微孔板格式观察显示的光密度（OD）值。
将这些OD值以热图形式可视化，其中颜色强度对应于各孔中OD值的分布情况，从而提供一种清晰且直观的表示方式。在科水平上比较了来自组学系统、固体平板法以及初始粪便样本所获得的人类肠道微生物群的物种多样性。共有34个微生物科被固体平板法和本研究所展示的组学方法共同富集，而组学系统额外还富集了4个科。
OMIC 系统还有效富集了一些丰度较低的菌科。在属水平上，两种方法均富集了 74 个微生物属，而 MISS 细胞法额外富集了 13 个属。此外，使用 OMIC 系统有效富集了最初丰度较低的两个属。
这些结果表明，MISS细胞培养方法为原始微生物悬液中比例较低或生长性能较差的菌株提供了更佳的生长条件。
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概述
本方案描述了单细胞微升液滴培养组学系统（MISS cell）在微生物单克隆分离与培养中的应用。该系统利用液滴微流控技术，提高微生物研究的效率与通量。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物培养
- 微流控
- 高通量筛选
背景
- 本研究重点在于改进微生物分离与培养技术。
- 传统方法通常缺乏效率和可扩展性。
- MISS细胞通过先进技术解决了这些局限性。
- 微生物培养组学对于理解人类肠道微生物组至关重要。
研究目的
- 提高微生物分离和单克隆筛选效率。
- 增进对肠道微生物组及其应用的理解。
- 提供一种低成本、高支持性的微生物筛选平台。
使用的方法
- 单细胞微升级液滴培养系统。
- 用于高通量平行培养的液滴微流控技术。
- 自动菌株分离与筛选平台。
- 用于数据分析的机器学习算法。
主要结果
- 与传统方法相比，MISS细胞显著增加了所产生的克隆数量。
- 在微生物单克隆分离与培养方面效率更高。
- 有助于更深入理解微生物在培养条件下的相互作用。
- 在微生物组研究的技术应用拓展方面具有潜力。
结论
- MISS细胞代表了微生物培养技术的一项重大进步。
- 它解决了传统方法中的关键局限性。
- 未来的研究将聚焦于整合更多的液滴操控技术。
常见问题
行业重要性概要
高通量、自动化的单克隆微生物培养对于加速微生物组研究和微生物培养组学的发现至关重要。MISS细胞系统能够快速、可扩展地分离和筛选多种微生物菌株，直接推动早期靶点识别和功能验证。该技术能力通过获取此前难以培养或丰度较低的分类群，支持项目组合的扩展，并降低转化型微生物组项目的研发风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过为基于微生物组的治疗手段提供系统性探究微生物多样性的方法，以实现靶点验证。
- 通过分离和鉴定低丰度或难培养菌株，促进生物学层面的风险降低。
- 通过提供纯的单克隆培养物，增强功能研究的可预测性和可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游表型筛选和功能检测制备经过验证的单克隆培养物。
- 标准化分离与培养流程，提高实验的可重复性和定量输出。
- 支持高通量筛选的前期准备，并适用于大规模微生物文库的扩展应用。
转化与临床前研究
- 扩大与疾病相关的微生物类群的获取途径，促进转化生物标志物的发现。
- 通过实现可靠的菌株筛选，提高从发现到临床前验证的连续性。
- 通过富集功能多样性，支持对基于微生物组的候选物进行风险调整后的推进。
流程与工作流整合
MISS细胞系统融入了从发现到临床前研究的连续过程，将早期微生物分离与后续的功能及转化研究连接起来。
- 发现生物学：通过实现快速单克隆分离，加速假设验证和通路阐明。
- 筛选：为检测方法开发和化合物评价提供可重复、定量的输出结果。
- 分析：提供基于光密度和荧光的测量，用于微生物生长条件的稳健比较。
- 转化研究：与生物标志物及疾病相关类群富集相结合，支持临床前研究。
- 企业级复用：建立可扩展、自动化的平台，可在多种微生物项目中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高微生物组研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的单克隆培养工作流程。
- 战略价值：通过拓展可获取的微生物多样性，支持更优的立项/终止决策和资本使用效率。
- 组合影响：支持基于风险调整的微生物组相关资产优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备微流控、微生物操作和数据分析方面的专业知识。
- 需要专用仪器用于液滴生成、检测和分选。
- 需要跨团队标准化，以确保数据可比性和工作流程整合。
- 针对不同的微生物群落或样品类型，可能需要进行方法调整。
- 通量和多样性提升效果取决于样品制备和系统校准。
