Name: 使用单细胞微升液滴培养组学系统的自动化和高通量微生物单克隆培养和挑取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解单细胞微升液滴培养组学系统MISS cell，利用液滴微流控技术实现自动化高通量微生物单克隆培养与筛选。该方法显著提升克隆生成效率，为肠道微生物组研究提供低成本高支持平台。

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本研究由以下机构资助：&#160;广东省重点领域研发计划（2024B1111130002）、河北省重点研发计划（22375503D）以及安徽工业微生物分子育种工程实验室开放项目（编号 ELMB-07）

所有研究程序均符合相关伦理规范。研究程序已获清华大学科学技术伦理委员会批准。为研究人类肠道微生物群，粪便样本采集自一名无重大医学病史的健康成人，该成人已签署书面知情同意书。
1. 仪器安装
<ol>
	<li>将Omics系统仪器置于洁净或无菌环境中（例如无菌室或厌氧操作台）。该仪器为精密设备，放置时需考虑以下事项：
	<ol>
		<li>使仪器处于常压和常温条件下。</li>
		<li>避免将仪器靠近强电场、强磁场及热辐射源。</li>
		<li>确保仪器放置区域的空间尺寸不小于2,500 mm（深）× 1,500 mm（宽）× 2,000 mm（高）。</li>
		<li>保持仪器所处环境的湿度低于60%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备工作
<ol>
	<li>依次开启组学系统、计算机和组学系统操作软件的电源。</li>
	<li>MISS细胞微管及液滴生成微流控芯片安装：
	<ol>
		<li>打开液滴生成与培养室的门图1A）并垂直取下微管路和液滴生成微流控芯片的保护盖。使用一次性注射器向液滴培养室内的加湿器中加入10 mL无菌蒸馏水（图1C）并重新安装微管路和液滴生成微流控芯片的保护盖。</li>
		<li>打开微管和液滴生成微流控芯片的无菌包装，将其垂直放置在培养室正上方（图1C).</li>
		<li>在软件界面上，点击 安装 (图2A）。此时，会出现一个弹出窗口，提示 确认更换微管和液滴生成微流控芯片？ 点击 是 开始安装。</li>
		<li>取出除气泡装置，并将其倒置固定在液滴生成与培养室的除气泡装置放置位上。注意不要挤压除气泡装置的液滴入口和出口管路。图1E).</li>
		<li>将去气泡装置的液滴出口管连接至其下方的夹紧阀，并使其穿过通向液滴检测与收集室的孔洞图1B).</li>
		<li>打开液滴检测与收集室的门，将已连接液滴出口管的检测管垂直插入检测插孔中，并确保检测管完全插入（图1D). 
		注意：插入检测管时，应垂直插入，确保检测管无任何弯曲。</li>
		<li>顺时针拧紧固定检测管的螺丝。确认检测管已完全插入并固定后，关闭液滴检测与收集室的门。</li>
		<li>从微管和液滴生成微流控芯片引出10根硅胶管，每根管上均标有编号（L01-L10）。将每个带标签的管子连接至相应编号的夹管阀（01-10）图1C).</li>
		<li>将微管和液滴生成微流控芯片的快速接头连接到Omics系统上对应的端口：C1接O1，C2接O2，C4接O4，CF接OF。 
		注意：微管和液滴生成微流控芯片的安装已完成。C3 不需要连接至 O3。</li>
		<li>微管和液滴生成微流控芯片安装完成后，会弹出一个窗口提示 打开液滴管路夹紧阀. 点击 好的 当微管路和液滴生成微流控芯片安装完成后，确保微管路和液滴生成微流控芯片上的所有硅胶管均已连接至相应的夹管阀，然后点击 好的.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仪器初始化
	<ol>
		<li>在执行初始化之前，单击 设置 界面（图2B设置相关参数：检测模式（基于OD或基于荧光的检测；此处为OD检测）、孵育温度（37 °C）和时间（30天 = 720 h）、振荡速度（20 rpm）、OD检测波长（600 nm），以及荧光检测的激发和发射波长。 
		注意：本方案中用于分离和培养人类肠道微生物群的参数均在括号内给出。设置参数时，培养温度应介于 5 °C 至 50 °C 之间。选择检测模式时，若液滴检测模块上的光纤与所需模式不一致，则必须更换光纤（见步骤 2.3.2）。配置参数时，油相参考值（基础光谱）由软件自动识别，无需手动调整。</li>
		<li>检测光纤的更换
		<ol>
			<li>从光纤支架上取下检测光纤（逆时针旋下），并松开液滴模块上的光纤固定螺钉（图1D).</li>
			<li>若不使用光纤，请将其从模块中取出，插入光纤支架并拧紧。将待检测光纤插入检测端口，并拧紧模块上的光纤固定螺钉。光纤更换完毕。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转向 首页 界面并点击 初始化 让Omics系统对其组件进行自检，包括进样泵、温度设置、废液排放测试、筛选模块和液滴检测模块。
		<ol>
			<li>初始化期间，通过向废液口注入1 mL 75%酒精，观察液滴检测模块的废液排出是否正常，以进行废液排放测试。</li>
			<li>在筛选模块测试中，将96孔板放置于板位上，观察板的移动是否正常。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 液滴生成
<ol>
	<li>人体肠道微生物组样本的采集与处理
	<ol>
		<li>准备便盆和粪便容器，洗手并佩戴手套以收集新鲜粪便样本。 
		注意：采集粪便样本时，应尽可能避免尿液污染。建议提前排尿，并将粪便放入干净、干燥的容器中。</li>
		<li>在无菌条件下采集适量中段粪便，密封于灭菌冻存管中（每管约 3–5 g）。立即将冻存管置于冰上，用于后续分装和标记。 
		注意：若粪便样本量较大或无法立即采集，应在最多 2 小时内完成采集。</li>
		<li>在厌氧操作台中，使用无菌拭子或粪便采样工具采集中段样本。 
		注意：粪便表层含有脱落的肠黏膜细胞，易受外界污染；暴露于空气中后，部分微生物 DNA 开始降解。</li>
		<li>将采集的粪便样本转移至 2 mL 无菌微量离心管或无菌冻存管中，每管含 0.5–2.0 g 粪便。每个样本准备两份分装样本用于冷冻保存。</li>
		<li>将新鲜粪便样本重悬于无菌生理盐水溶液中，每 100 mg 粪便用 1 mL 溶液稀释。充分混匀粪便，直至肉眼不可见大颗粒。</li>
		<li>静置沉降 10 分钟后，依次通过孔径为 200 目（0.075 mm）、400 目（0.038 mm）和 800 目（0.018 mm）的无菌筛网过滤上清液，以去除未消化的食物残渣及较小颗粒物质。最后，将滤液收集至无菌离心管中。</li>
		<li>取 10 µL 过滤后的粪便悬液，使用血细胞计数板和倒置荧光显微镜测定微生物浓度。 
		注意：粪便样本上清液经不同目数筛网过滤后，仍会残留少量较小的粪便颗粒。因此，在测定微生物浓度时，显微镜下观察到的活动颗粒被视为微生物，仅能对微生物浓度进行粗略估算。</li>
		<li>将粪便悬液转移至 1.5 mL 无菌离心管中，并标注日期、微生物浓度和样本名称。保留部分用于后续实验，其余样本于 4 °C 保存以备后续使用。 
		注意：应及时记录样本信息（样本名称、采集时间），确保样本在相同时间点采集（考虑哺乳动物肠道微生物时间节律变化）。整个样本采集与处理过程应在厌氧环境中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初始粪便悬液的制备
	<ol>
		<li>根据制造商说明书配制脑心浸出液（BHI）培养基，并在 121 °C 高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>取步骤 3.1.8 中的粪便悬液，用 BHI 培养基进行系列稀释，使浓度达到约 50 个细胞/mL。 
		注意：为填满样本瓶，需至少准备 40 mL 粪便悬液。</li>
		<li>确保样本瓶底部放置有小型磁力搅拌子，将稀释后的粪便悬液倒入样本瓶至加样位置。旋紧瓶盖。随后，将快速接头 A 插入快速接头 B，完成样本加载过程（图 3A）。</li>
		<li>将样本瓶放入指定位置，并将快速接头 A 和 B 从样本瓶上分离。将样本瓶的快速接头 A 连接到 Omics 系统的 O3 接口，将微管和液滴生成微流控芯片上的 C3 接头连接至快速接头 B。关闭液滴生成与培养室的门（图 3B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液滴生成
	<ol>
		<li>在软件的 主页 界面中选择所需生成的液滴管数量（图 2A）。 
		注意：每次运行最多可生成 10 根液滴管，每根管可生成约 5,000 个液滴。</li>
		<li>在软件的 主页 界面中点击 生成，启动单细胞液滴生成。 
		注意：确认废液泵的排液是否正常工作。在液滴生成过程中，每个液滴体积为 2.0 µL。液滴生成的详细说明见讨论部分。</li>
		<li>等待蜂鸣器报警提示液滴生成完成。关闭 C3 接头上的夹子（图 1E），并取下样本瓶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 液滴培养
<ol>
	<li>在软件的首页界面中选择与液滴生成时相同的液滴管路编号，点击培养，确认培养时间和温度，然后开始培养过程。在首页界面上监控进度条，以查看培养的进度和剩余时间。</li>
	<li>等待蜂鸣器报警提示液滴培养已完成。若需延长培养时间，可直接在设置界面中调整时间。</li>
</ol>
5. 液滴筛选
<ol>
	<li>按下 Omics 系统上的 UV 按钮以开启紫外光（UV）灯（图 1A），对液滴检测与收集室照射 30 分钟，随后关闭紫外光灯。 
	注意：开启紫外光灯前，请确保液滴检测与收集室的门已关闭。</li>
	<li>在超净工作台内，打开所有用于收集液滴的 96 孔板，不加盖，自下而上依次叠放，并按顺序编号。确保最上方的孔板用盖子覆盖。 
	注意：每次运行最多可容纳十个 96 孔板，具体数量取决于液滴总数。</li>
	<li>打开液滴检测与收集室的门，将孔板放置于指定位置（图 1D），取出最上方孔板的盖子，然后关闭室门。</li>
	<li>开启 Omics 系统上的紫外光灯，持续 30 分钟，进行二次灭菌。</li>
	<li>安装去气泡装置
	<ol>
		<li>从放置位置取下去气泡装置，拧开盖子，并将盖子上的蝶形螺丝取下（图 3C）。</li>
		<li>将 200 mL 去气泡油倒入去气泡装置中，用去气泡装置的盖子将瓶口拧紧，并将其倒置固定在去气泡装置放置位上。去气泡装置安装完成。 
		注意：固定去气泡装置时，确保无油液泄漏。若发生泄漏，请拧紧盖子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 主界面 选择用于分选的液滴管路，点击 分选，输入待收集的孔板数量，然后启动流程。液滴筛选开始后，观察过程显示区域，该区域将实时显示液滴的光密度（OD）或荧光值。</li>
	<li>分析约 20–30 个液滴以检查 OD 值。例如，若发现大多数液滴的 OD 值约为 0.2，该值对应空液滴的 OD 值，根据泊松分布，将 下限 OD 阈值 设为 0.5，上限 OD 阈值 设为 4.0。处于该范围内的液滴将被自动收集至 96 孔板中（图 4A）。 
	注意：根据比尔-朗伯定律，空液滴的 OD 值由液滴内培养基成分决定。通常，下限 OD 阈值应比空液滴的 OD 值高出 0.2–0.3 个单位，以确保空液滴与含有微生物的液滴之间有清晰区分。</li>
	<li>等待蜂鸣报警提示液滴筛选与收集完成。打开液滴检测与收集室的门，将孔板盖盖在最上方的孔板上，然后将所有孔板一同取出，进行后续测序与备份。</li>
</ol>
6. 数据导出与热图展示
<ol>
	<li>点击导出数据以保存收集到的液滴信号数据（图4A，B）。</li>
	<li>点击热图，选择液滴收集数据文件，并观察软件显示的微孔板中液滴的OD值。将这些OD值以热图形式可视化，其中颜色强度对应于各孔中OD值的分布，从而清晰直观地展示所收集的单克隆OD值（图4A，C）。</li>
</ol>
7. MISS 细胞的清洗
<ol>
	<li>实验结束后，选择需要清洗的液滴管路，然后点击清洗以开始仪器清洗。</li>
</ol>
8. 微生物单克隆备份及测序样品制备
<ol>
	<li>测序样本制备
	<ol>
		<li>在厌氧操作台中，向收集的液滴板每孔加入 100 µL BHI 培养基，用移液器充分混匀，然后从每孔取 10 µL，全部转移至一个 15 mL 无菌离心管中。涡旋振荡以获得混合的微生物悬液。</li>
		<li>向混合的微生物悬液中加入 5 mL 磷酸盐缓冲液，以 1,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将微生物沉淀物置于液氮中快速冷冻。测序样本制备完成。</li>
		<li>采用针对 16S rDNA 的 V3 和 V4 区域的 16S rDNA 扩增子测序方法。所用的具体测序引物如下：341F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA 和 806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微生物单克隆样本冷冻保存：
	<ol>
		<li>从液滴板各孔（来自步骤 8.1.1）收集 10 µL 样本后，向每孔加入 30 µL 甘油。将板置于 -80 °C 条件下用于微生物菌株的保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案概述了MISS细胞在微生物单克隆的自动化、高通量分离、培养、检测与收集中的操作流程。与传统方法相比，传统方法仅能分离和培养约20%-30%的肠道微生物群2,12，而使用Omics系统获得的单克隆克隆数量比固体培养板获得的数量高出1.97倍。该比较表明，MISS细胞在单细胞分离、单克隆培养和筛选方面具有优势。
对于单细胞分离，Omics 系统依据泊松分布获取单细胞液滴，从而确保良好的单克隆性。此外，Omics 系统的液滴生成速率达每小时最多 5,000 个，能够在实现高通量单细胞分离的同时，由于液滴体积小而显著降低试剂消耗。在液滴生成过程中，微管上的聚焦流通道被用于控制流体。Omics 系统通过注射泵将油相、样品溶液和气体推入聚焦流通道，从而形成液滴。用户可通过通道或直接观察液滴导管，判断液滴是否成功生成。微管和液滴生成微流控芯片上的硅胶管连接至 10 根液滴导管的末端。当某一根液滴导管中生成了足够数量的液滴（约 5,000 个）时，夹紧阀将自动夹闭该导管的硅胶...

微生物培养组学在食品工业中有益微生物的研究、环境微生物多样性分析、新型抗菌化合物的筛选以及与疾病相关的肠道微生物组研究中具有广泛应用1,2,3,4。传统方法主要依赖固体平板、孔板或微型反应器来获得并挑取单克隆菌落，虽然操作简便，但由于步骤较多，通量较低。这一局限性制约了微生物诱变筛选、微生物培养组学研究以及高产菌株筛选等需要大规模单克隆筛选的应用。
近年来，已设计出多种单细胞检测与分液装置，可显著提高微生物样品的处理速度，同时减少人工操作所需的人力并最大限度降低人为误差5。然而，这些仪器通常仅针对传统方法中的特定步骤进行优化，往往需要复杂的设备集成，占用较大空间，且成本高昂。因此，迫切需要开发一种低成本、具有广泛适用性的微生物培养与筛选平台，以弥补上述不足。
在我们之前的研究中，我们成功开发了一种自动化的高通量筛选平台，称为单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell，下文简称为 &#34;组学系统&#34;）6。该平台采用液滴微流控技术，在微生物分离、培养和挑取的自动化与集成化方面具有广阔前景7,8,9,10。组学系统包含多个关键模块，如取样模块、微流控芯片、液滴检测与收集系统，可在微生物学研究中实现高效的单细胞分离、培养、单克隆筛选和收集。我们已利用该组学系统实现了对Corynebacterium glutamicum的高通量诱变筛选6。
由于组学系统具备自动化和高通量筛选能力，将其应用于微生物培养组学有望快速获得大量微生物数据。在本方案中，我们以人肠道微生物群的分离与培养为例，详细介绍了MISS细胞的操作流程，展示了微生物单细胞分离、培养、单克隆检测及筛选的全过程。组学系统的操作简便，研究人员只需按照软件指引，依次完成微管路安装、液滴生成微流控芯片设置、参数设定及样品制备即可。
在软件操作界面中，Omics 系统分为三个主要功能模块——分离、培养和筛选。研究人员可根据实验需求选择不同的阶段。此外，在液滴筛选阶段，研究人员可从两种检测模式中进行选择：荧光信号或光密度。软件可对液滴筛选过程进行实时可视化。最后，研究人员可根据具体的实验需求灵活设置参数，例如培养条件、检测波长以及收集孔的数量，并可随时暂停仪器以执行其他操作。MISS 细胞是一种对微生物友好、高通量、操作简便且试剂消耗极低的单克隆筛选平台。

<table><tbody><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>P5731-500EA</td><td>用于固体培养基平板的制备</td></tr><tr><td>30 mL 粪便采样容器</td><td>Boen Healthcare Co., Ltd</td><td>611101</td><td>用于收集粪便样本</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 恒温培养箱</td><td>上海一恒科技有限公司</td><td>LRH-150</td><td>用于在培养箱中培养固体平板</td></tr><tr><td>96 孔透明平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>用于微孔板运动检测和液滴收集</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>用于固体培养基平板的制备</td></tr><tr><td>去气泡油</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISS cell-S-oil</td><td>液滴筛选过程中去气泡装置中的油相</td></tr><tr><td>去气泡装置</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISS cell-S</td><td>在进行液滴检测和收集前排除液滴间的气相</td></tr><tr><td>厌氧工作站</td><td>常熟市海虞镇 氩氮空间设备经营部</td><td>VGB-4CM&amp;nbsp;</td><td>用于在厌氧条件下进行无菌操作和紫外灭菌</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>普和西健康医疗设备有限公司</td><td>MLS-830L</td><td>用于对 BHI 培养基、EP 管等进行高压灭菌</td></tr><tr><td>脑心浸出液（BHI）肉汤</td><td>青岛高科技工业园海博生物技术有限公司</td><td>HB8297-1</td><td>BHI 培养基的组分&lt;br/&gt; 配方列表：&lt;br/&gt; 38.5 g/L BHI 肉汤溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>涂布棒</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>HS8151</td><td>将微生物悬液接种至固体平板</td></tr><tr><td>离心管，15 mL</td><td>北京新恒岩科技有限公司</td><td>HB53397</td><td>用于微生物悬液的制备</td></tr><tr><td>计算机</td><td>联想</td><td>E450</td><td>软件安装及 MISS cell 仪器控制</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo Fisher</td><td>2.0 mL</td><td>用于粪便样本的保存</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>北京麦瑞德科技有限公司</td><td>M306444-100ml</td><td>加入加湿器中，以维持液滴培养室内的湿度</td></tr><tr><td>EP 管</td><td>Thermo Fisher</td><td>2.0 mL</td><td>用于收集粪便样本</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>奥林巴斯生命科学（LS）</td><td>CKX53</td><td>检查并计算微生物浓度</td></tr><tr><td>甘油</td><td>GENERAL-REAGENT</td><td>G66258A</td><td>用于菌株保存</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Acmec</td><td>AYA0810-1ea</td><td>用于计算微生物浓度</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Ambeed</td><td>A442876</td><td>磷酸盐缓冲液（PBS 溶液）的组分。配方列表：8 g/L NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>MACKLIN</td><td>P815661</td><td>磷酸盐缓冲液（PBS 溶液）的组分。配方列表：8 g/L NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>筛网滤器</td><td>安平县九丰丝网制造有限公司</td><td>200 目（0.075 mm），400 目（0.038 mm），800 目（0.018 mm）&amp;nbsp;</td><td>去除粪便样本中未消化的食物残渣及较小颗粒物</td></tr><tr><td>微管及液滴生成微流控芯片</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISC-B2</td><td>用于液滴生成和液滴培养</td></tr><tr><td>MISS cell 油</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISS cell-BOS-B</td><td>液滴微流控中的油相</td></tr><tr><td>MISS cell 软件</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISS cell V3.2.4</td><td>在 MISS cell 仪器上执行实验操作</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Solarbio</td><td>D7292</td><td>磷酸盐缓冲液（PBS 溶液）的组分。配方列表：8 g/L NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>GENERAL-REAGENT</td><td>G81793J</td><td>生理盐水溶液的组分&lt;br/&gt; 配方列表：&lt;br/&gt; 9 g/L NaCl 溶于蒸馏水中</td></tr><tr><td>移液器</td><td>eppendorf</td><td>2.5 &amp;mu;L, 10 &amp;mu;L, 100&amp;mu;L, 1000&amp;mu;L</td><td>用于液体操作</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管</td><td>深圳市沃而热缩材料有限公司</td><td>3401000141</td><td>用于液滴培养。该材料已包含在微管及液滴生成微流控芯片中</td></tr><tr><td>采样瓶</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISS cell-bottle</td><td>用于微生物悬液的取样</td></tr><tr><td>单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell）</td><td>洛阳泰茂斯生物科技有限公司</td><td>MISS cell-G3f</td><td>用于微生物单克隆的分离、培养、检测和收集</td></tr><tr><td>超高速离心机</td><td>Thermo Fisher</td><td>Sorvall Lynx 4000&amp;nbsp;</td><td>用于制备测序用微生物悬液</td></tr><tr><td>注射器</td><td>江苏智予医疗器械有限公司</td><td>10 mL</td><td>吸取蒸馏水并注入液滴培养室的加湿器中</td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>SANYO 超低温&amp;nbsp;</td><td>MDF-U4086S&amp;nbsp;</td><td>用于菌株保存（-80 &amp;deg;C）</td></tr></tbody></table>

利用单细胞微升液滴培养组学系统实现微生物单克隆的自动化与高通量培养及挑取

Automated and High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking Using the Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System

纯细菌培养物对于微生物培养组学的研究至关重要。基于固体平板、孔板和微反应器的传统方法由于操作繁琐且通量较低，限制了微生物培养组学研究的快速进展。为解决这些挑战，我们成功开发了单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell），这是一种利用液滴微流控技术进行微生物单克隆分离、培养和筛选的自动化高通量平台。该系统可在短时间内生成大量单细胞液滴，并实现单克隆菌落的培养、筛选与收集，从而促进从微生物分离到挑取的全流程一体化。在本实验方案中，我们以人肠道微生物群的分离与培养为例，展示了该系统的应用，并与固体平板培养法在微生物分离效率、单克隆培养性能及筛选通量方面进行了比较。实验流程简便，试剂消耗极低。与固体平板培养法相比，MISS cell 能够培养出更多样化的肠道微生物物种，为微生物培养组学研究提供了重要的潜力与价值。

人类肠道微生物群构成了主要的微生物群落，估计肠道中约含有 4 × 1013 个微生物，显示出其数量庞大且组成复杂11。在本研究中，我们旨在分离和培养肠道微生物群，并采用固体平板法作为对照，以展示MISS细胞的高通量性能。
首先，我们使用相同的粪便悬液来比较两种方法的单细胞分离通量。在MISS细胞中，我们采用较低的微生物浓度，此时液滴中微生物的分布概率可根据泊松分布计算：P(λ,x) = λxe-λ/x!，其中λ表示每个液滴中的平均细胞数，可通过微生物浓度与液滴体积的乘积计算得出；x表示被包裹在液滴中的细胞数量。在此，我们使用的初始微生物悬液浓度为0.1（初始微生物浓度为50个细胞/mL，液滴体积为2.0 µL），表明空液滴、单细胞液滴和多细胞液滴出现的概率分别为90.5%（x = 0）、9.1%（x = 1）和0.4%（x ≥ 2）。
在Omi...

本方案描述了如何使用单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell）进行微生物单克隆分离、培养和挑取。MISS cell 基于液滴微流控技术，实现了集成化的工作流程，具有优异的液滴单分散性、高通量平行培养以及高通量生物量检测能力。

纯细菌培养物对于微生物培养组学的研究至关重要。基于固体培养板、孔板和微反应器的传统方法……

本研究利用自动化平台探索微生物培养组学，以增强微生物的分离、培养和单克隆筛选，旨在加深对人类肠道微生物组及其应用的理解。推动微生物组研究的技术包括微流控液滴技术、自动菌株分离与筛选平台、机器学习算法，以及用于高通量菌株培养组学和微生物组分析的单克隆分配器。中细胞系统显著增强了肠道微生物视图、单克隆分离和染色能力，与传统方法相比可产生近两倍数量的克隆，从而推动了肠道微生物视图共培养体系的研究能力。本方案解决了低成本、高通量微生物筛选平台的需求，克服了传统方法在共培养研究中效率低下和可评分性差的局限性。本实验室将进一步致力于整合更多液滴操控技术，例如液滴分裂与合并，以拓展该技术的应用范围。首先，打开 MISS 细胞的液滴生成与培养室门。垂直取下微管路和液滴生成微流控芯片的保护盖。使用一次性注射器，向腔室内的加湿器中加入 10 毫升无菌蒸馏水，然后重新安装保护盖。打开微管和液滴生成微流控芯片的无菌包装，将其垂直放置在培养室正上方。然后在软件界面中点击安装。当确认弹窗出现时，点击“是”以开始安装。取出除气泡装置，将其倒置固定在腔室内的除气泡装置放置位上。将除气泡装置的液滴出口管连接至其下方的夹管阀，并经通路引导至液滴检测与收集腔室。打开腔室门后，将检测管垂直插入检测插孔中。确保检测管完全插入。顺时针方向拧紧固定检测管的螺丝。确认完全插入并固定后，关闭腔室门。将微流控芯片上标记为 L1 至 L10 的 10 根硅胶管分别连接到对应编号的夹管阀。接下来，根据正确的连接方式，将微流控芯片上的快速接头连接至组学系统上对应的端口。芯片安装完成后，会弹出一个窗口，显示“液滴管路夹紧阀已打开”。当微管和液滴生成芯片安装完成后，点击“确定”。在确认所有管路均已正确连接至对应的夹紧阀后，点击“确定”。在执行初始化之前，单击设置界面以配置相关参数，例如选择模式、培养温度、培养时间、摇床转速、OD检测波长以及荧光检测的激发和发射波长。进入主界面后，单击“初始化”。系统将弹出确认窗口，单击“是”，允许IC系统对其组件进行自检，包括进样泵、温度设置、废液排放测试、筛选模块和液滴检测模块。初始化完成后，点击弹出窗口中的“确定”。样品制备时，取微生物样品，用相应的培养基进行系列稀释，使浓度约为每毫升50个细胞，获得40毫升的样品悬液。然后拧开样品瓶的瓶盖，将含有磁力搅拌子的稀释后粪便悬液倒入瓶中，直至达到样品添加刻度线处。拧紧瓶盖并确保其牢固。然后将快速接头A插入快速接头B，以完成样品加载过程。将样品瓶放入指定位置后，将快速接头A和快速接头B从样品瓶上分离。将样品瓶的快接接头A连接至omic系统上的O3端口。将微流控芯片上的C3接头连接至快接接头B，并关闭腔室门。在软件主界面中，选择要生成的液滴管路数量，然后点击“生成”以开始单细胞液滴生成。等待弹出窗口提示液滴生成完成，然后点击“确定”。关闭三通连接器上的夹具，并取下样品瓶。在软件的主界面中，选择与液滴生成过程中所用相同的液滴管路编号。点击培养。确认培养时间和温度，然后开始培养过程。等待弹出窗口，提示液滴培养已完成。按下omic系统的UV按钮以开启紫外光（UV）。在关闭前，对液滴检测和收集室照射30分钟。在超净工作台内，打开所有用于液滴收集的96孔板，不加盖，自下而上依次叠放，并按顺序编号。确保顶部孔板已盖上盖子。打开液滴检测与收集室的门，将孔板放置在指定位置。取下顶部孔板的盖子，然后关闭腔室门。再次打开omic系统上的紫外灯，照射30分钟以进行二次灭菌。接着，将除气泡装置从放置位置取出。拧开盖子，并从盖子上取下蝶形螺钉。将 200 毫升脱气油倒入脱气装置中。拧紧瓶盖，然后将脱气装置倒置并固定在指定位置。在主界面中，选择用于分选的液滴管路。点击分选。输入要收集的孔板数量，然后启动分选过程。观察过程显示区域，以实时监测液滴的光密度或荧光值。分析约 20 至 30 个液滴以检测 OD 值。若大多数液滴的 OD 值约为 0.2，则将下限 OD 阈值设为 0.5，上限 OD 阈值设为 4。系统将自动收集该范围内的液滴至 96 孔板中。等待弹出窗口提示液滴分选与收集完成，然后点击“确定”。打开液滴检测与收集室的门。将孔板盖盖在顶部孔板上，然后一起取出孔板。单击“导出数据”以保存采集的液滴信号数据。单击热图。选择液滴采集数据文件，并以微孔板格式观察显示的光密度（OD）值。将这些OD值以热图形式可视化，其中颜色强度对应于各孔中OD值的分布情况，从而提供一种清晰且直观的表示方式。在科水平上比较了来自组学系统、固体平板法以及初始粪便样本所获得的人类肠道微生物群的物种多样性。共有34个微生物科被固体平板法和本研究所展示的组学方法共同富集，而组学系统额外还富集了4个科。OMIC 系统还有效富集了一些丰度较低的菌科。在属水平上，两种方法均富集了 74 个微生物属，而 MISS 细胞法额外富集了 13 个属。此外，使用 OMIC 系统有效富集了最初丰度较低的两个属。这些结果表明，MISS细胞培养方法为原始微生物悬液中比例较低或生长性能较差的菌株提供了更佳的生长条件。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用单细胞微升液滴培养组学系统的自动化和高通量微生物单克隆培养和挑取

来源：Jian, X. et. al., 利用微生物微滴培养系统（MMC）实现微生物自动化培养与适应性进化。J. Vis. Exp.

利用微流控微液滴培养系统实时监测细菌生长

来源： Jian, X., et al., 利用微生物微滴培养系统（MMC）实现微生物自动化培养与适应性进化。J. Vis. Exp.

利用微生物微滴培养系统进行细菌的适应性进化

本方案介绍了用于原核微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器（PLBR）的制备、装置搭建及基本操作。作为原理验证，对具有工业相关性的微生物进行了分析，从而获得了在特定时间段内的生长速率、形态特征及表型异质性等方面的深入信息，而这些信息采用传统方法极难实现。...

用于微生物单细胞分析的微流控皮升级生物反应器：制备、系统搭建与操作

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

本文介绍了一种利用微流控平台分离和培养单细胞的实验方案，该平台采用了一种新型的微孔设计概念，可实现高效的单细胞分离和长期克隆培养。...

一种用于高通量单细胞分离与培养的微流控平台

我们设计了一种用于光遗传学系统的连续培养装置，可对微生物培养物进行光照，并利用倒置显微镜定期对流出液中的细胞进行成像。该装置实现了培养、取样、成像及图像分析的全程自动化，从而可在数天内连续测量细胞对光照的动态响应。...

用于微生物光遗传学应用的自动化光照、培养与取样系统的设计与实现

本文介绍了一种在微型生物反应器系统中同时进行48个平行细胞培养并在不同条件下操作的详细方案。描述了细胞培养过程、收获以及后续的抗体滴度分析。...

使用高通量自动化微型生物反应器系统在CHO细胞中生产模型IgG1

本方案中介绍的共培养相互作用检测方法成本低廉、通量高且操作简便。这些检测可用于观察微生物在共培养条件下的相互作用，识别相互作用模式，并表征目标微生物菌株对人类及环境病原体的抑制潜力。...

高通量共培养实验用于研究微生物相互作用

本方案介绍了如何使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化的微生物培养和适应性进化研究。MMC...

使用微生物微滴培养系统（MMC）进行自动化微生物培养与适应性进化

我们介绍一种用于毫流体连续培养装置（MCCD）的实验方案，该装置可在恒定的低营养条件下（低至数百纳摩尔浓度）或在分钟时间尺度上的动态营养波动条件下培养细菌群体。...

用于研究的连续培养毫流体装置 大肠杆菌 在低且波动的营养条件下

本方案介绍了一种用于工业微生物的标准高通量筛选流程。该流程包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动化微流控技术进行正向液滴筛选，随后对筛选结果进行验证。该工作流程的可靠性已通过筛选高产B.

高通量筛选L-乳酸高产菌株 Bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

了解单细胞微升液滴培养组学系统MISS cell，利用液滴微流控技术实现自动化高通量微生物单克隆培养与筛选。该方法显著提升克隆生成效率，为肠道微生物组研究提供低成本高支持平台。

利用单细胞微升液滴培养组学系统实现微生物单克隆的自动化与高通量培养及挑取

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