Name: 使用计算机视觉库简化细胞核定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习使用开源计算机视觉程序自动定量细胞核，以标准化骨骼肌代谢数据。该方法减少人工计数偏差，提高实验效率，适用于热疗诱导肌肉适应机制研究。

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本研究工作由美国国立卫生研究院/国家老龄化研究所（R01AG084597；DEL 和 HYL）以及德克萨斯理工大学的启动资金（DEL）提供资助。作者谨此感谢德克萨斯理工大学本科生研究学者计划（Undergraduate Research Scholars）和 TrUE 学者计划为参与本研究工作的本科生研究人员（REH、MRD、CJM、AKW）提供的财政支持。我们还感谢 Lauren S. Gollahon 博士和&#160;Michael P. Massett 博士慷慨共享其实验室空间与设备。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们的细胞核定量程序相较于现有选项具有多项优势：仅需基本的技术技能，针对细胞核定量这一特定任务经过验证，且为开源程序；其中开源特性克服了与成本相关的障碍。最终，该程序为细胞与分子生物学家提供了一种额外的选择，可快速、准确地对荧光显微镜拍摄的图像中的细胞核进行定量分析。目前可用的自动化细胞核或细胞计数程序并非所有用户都青睐，部分程序价格昂贵，且在特定应用中的验证可能不足或缺失。专用设备（如 BioTek Cytation 系列）虽附有技术公告，验证了利用细胞核染色进行原位细胞计数20，并支持多种其他应用。尽管已有验证数据，且 Cytation 产品线被广泛使用——尤其是在与 Seahorse 细胞外通量分析仪联用时，可便捷高效地归一化活细胞数据——但对于设备经费有限的实验室而言，该产品可能因成本过高而难以承受。例如，在2024日历年度，配备四个物镜和四个荧光滤光片组的基础型号的标价已超过10万美元。对于无力购买专用设备的研究者，开源软件为图像分析提供了免费的替代方案。适用于细胞核和细胞定量的开源软件包括 ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国；可访问 <sup class...

功能实验和成像实验对于理解实验处理对全细胞生物化学和生理学的影响至关重要。对细胞生物学实验数据进行有效解读，依赖于实验方案的准确性和可重复性，包括数据的标准化处理。例如，在基础状态下以及使用特定药物处理后，检测活细胞的耗氧量和细胞外酸化率，可用于评估能量代谢的多个方面1,2。测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶等酶的活性，有助于量化细胞膜的完整性3。在固定前使用膜联蛋白V和碘化丙啶对培养细胞进行染色，可评估凋亡和坏死细胞的比例4。然而，不同孔之间细胞密度的差异会影响上述每项检测的结果。仅依赖接种密度可能导致结果误导，原因包括接种时细胞计数误差、铺板过程中细胞在培养基中密度不均，或样品及处理组在实验过程中细胞生长速率不同。因此，必须对实验结果进行标准化处理。
目前用于功能性和基于图像的细胞数据归一化的方法包括蛋白质浓度5或细胞核/细胞计数6。为了将数据归一化至蛋白质浓度，需在实验完成后，将细胞以等体积的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液提取，并额外进行一次蛋白定量实验（例如二辛可宁酸法、Bradford法等）。该方法的准确性依赖于细胞的完全提取；任何残留的蛋白质都会导致定量误差。细胞核或细胞计数则提供了一种替代方案，无需将细胞从其生长表面移除。取而代之的是，对活细胞或固定细胞使用比色或荧光染料进行染色或复染，然后基于全细胞或仅细胞核的图像进行计数。在荧光显微镜应用中，以及对融合细胞（如肌管细胞）或组织的数据进行归一化时，优先选择对细胞核进行定量。在采用荧光方法对细胞核进行定量时，可将荧光DNA染料（例如4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）、Hoechst 33342、Hoechst 33358、DRAQ5等）应用于活细胞或固定细胞，并通过荧光显微镜成像。DAPI、Hoechst和DRAQ5优先结合DNA中富含腺嘌呤-胸腺嘧啶的区域7,8,9，从而实现细胞核的检测。优化染料浓度可避免脱靶结合（例如与线粒体DNA结合，导致细胞质中出现点状荧光）10。通过使用市售的含DAPI的封片剂（如含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂）以及文献报道的活细胞染料浓度（如Hoechst）6,11,12，可简化优化过程。染色后，使用适当的激发滤光片（例如紫外光[DAPI和Hoechst]或远红光[DRAQ5]）对活细胞或固定细胞中的细胞核进行可视化。DAPI、Hoechst和DRAQ5的激发最大值位于荧光显微镜光谱的两端。这一特性，加上这些染料对DNA的特异性以及在最佳浓度下的使用，可最大限度地减少脱靶荧光。所得图像显示在黑色背景上明亮的细胞核，这些细胞核可作为单核细胞细胞数量的衡量指标。尽管存在其他基于组织学染色和明场显微镜的准确染色定量方法13，但使用这些方法实现自动化较为困难，尽管仍有可能。
尽管手动核计数仍是金标准，但该方法费时费力，且在长时间计数过程中容易引入人为误差。虽然已有自动化细胞计数程序，但并非所有用户都倾向于使用，这些程序可能成本较高，且针对特定应用的验证可能不足。近年来，Python 已成为生物学家一种有价值且易于获取的资源。Python 的计算机视觉库在图像分析方面尤为有用14。本文提供了使用基于 Python 代码开发的可执行程序对经荧光染料染色并利用荧光显微镜成像的细胞核进行定量分析的分步操作指南。使用本程序无需编程技能。该工作流程专门适用于应用了荧光 DNA 染料的细胞或组织，不适用于明场图像。第 1 节介绍如何以与本工作流程兼容的方式采集并保存荧光显微镜获取的图像。第 2 节提供将核计数程序作为可执行文件运行并获取输出结果的操作说明。该可执行程序可直接通过提供的 .exe 文件运行，无需任何修改即可对高质量图像中的细胞核进行定量。该可执行程序需在基于 Windows 的计算机上运行。第 3 节介绍如何将程序作为 Python 脚本而非可执行文件运行（在基于 Mac 或 Linux 的系统中为必需，在基于 Windows 的系统中为可选），并允许根据需要调整代码。第 4 节描述如何利用结果进行归一化处理。随后提供了代表性结果，包括来自本实验室的验证数据。

<table><tbody><tr><td>可访问方法2或方法3结果文件的计算机</td><td>-</td><td>-</td><td>参见步骤2.6（方法2）或步骤3.3.9或3.4.9（方法3）</td></tr><tr><td>具备互联网连接和现代浏览器的计算机</td><td>-</td><td>-</td><td>例如，Google Chrome</td></tr><tr><td>具备互联网连接、现代浏览器和Windows操作系统的计算机</td><td>视情况而定</td><td>视情况而定</td><td>对于Mac、Linux或其他操作系统，请使用方法3</td></tr><tr><td>配备图像采集软件的计算机</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision</td><td>其他软件也可接受；必须与荧光显微镜兼容</td></tr><tr><td>输出文件存储位置（结果电子表格和图像轮廓）</td><td>-</td><td>-</td><td>可以是一个新建的空文件夹</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>其他荧光显微镜也可接受；必须配备合适的滤光片组、所需物镜和相机&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>包含所有待量化图像的文件夹</td><td>-</td><td>-</td><td>参见步骤1.12</td></tr><tr><td>Python 3.10或更高版本</td><td>Python</td><td>-</td><td>可在 https://www.python.org/downloads/ 免费下载和安装&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>待成像样品</td><td>-</td><td>-</td><td>固定或活体样品，使用荧光DNA染料染色或复染</td></tr><tr><td>电子表格软件</td><td>Microsoft</td><td>Excel</td><td>类似的电子表格软件也可接受</td></tr></tbody></table>

利用计算机视觉库简化细胞核定量分析

Using Computer Vision Libraries to Streamline Nuclei Quantification

活细胞检测和基于图像的细胞分析需要进行数据归一化，以实现准确解读。一种常用的方法是对细胞核进行染色并定量，随后将数据归一化为细胞核数量。对于单核细胞，该细胞核计数通常被表示为细胞数量。尽管手动定量可能费力且耗时，但现有的自动化方法可能并非所有用户都愿意使用，可能缺乏针对此特定应用的验证，或成本过高。本文提供了详细的分步操作指南，用于获取经荧光DNA染料染色的细胞核的可定量图像，并利用基于Python计算机视觉库开发的自动化目标计数软件程序对细胞核进行定量分析。我们还在不同细胞密度范围内对该程序进行了验证。虽然程序运行的确切时间取决于图像数量和计算机硬件，但该程序可将原本需要数小时的人工计数工作缩短至数秒内完成。尽管本实验方案是基于固定后染色细胞的图像开发的，但该程序同样适用于活细胞中染色细胞核以及免疫荧光&#160;应用的图像定量。最终，该程序提供了一种无需高技术水平即可使用的、经过验证的开源替代方案，有助于细胞与分子生物学家优化工作流程，实现繁琐且耗时的细胞核定量任务的自动化。

每批图像运行将生成：1）一组已应用轮廓的图像文件，显示所识别出的细胞核的轮廓（图5）；以及 2）一个 .csv 文件（电子表格），用于关联图像文件名及其对应的计数结果。通过查看这些轮廓，用户可对计数质量进行视觉评估。具体而言，按照第1节&#160;所述方法获得的图像中，所有（或几乎全部）细胞核应被实心绿色线条包围，表明该细胞核已被程序计入。此处正是利用这些轮廓对程序进行了优化调整。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67945/67945fig5.jpg" /> 
图5：原始图像及对应轮廓示例。（A-C）分析前的原始图像示例，（D-F）为其正下方对应的分...

本文详细描述了使用一款开源可执行程序对基于图像的细胞核进行自动化定量分析的逐步方法，该程序已在多种细胞密度范围内得到验证。该程序提供了一种替代方案，可克服现有技术在成本、对技术能力有限的用户而言的可及性，以及特定应用验证方面的局限性，从而提升其实用性。

活细胞检测和基于图像的细胞分析需要进行数据归一化，以实现准确解读。一种常用的方法是染色并定量……

我们开发了此方法，用于对细胞模型的代谢数据进行标准化处理，以帮助识别机制，阐明热疗诱导的骨骼肌适应性变化，并最终改善糖尿病前期人群的代谢健康。我们必须对细胞核进行计数以用于实验归一化。人工定量细胞核存在诸多挑战，包括观察者偏差、耗时，以及在处理不同样本或条件时的变异性。我们的程序是开源的，可确保具备不同编码相关技术水平的科学家均能使用，并已针对快速、准确地定量细胞核这一特定任务进行了验证。该技术使我们能够客观地验证我们最近一项由美国国家衰老研究所（NIA）资助的临床研究中热疗对肌肉和线粒体健康益处的潜在作用机制。[旁白] 首先，在计算机系统上启动一个网页浏览器，访问 github.com 上的 nuclei counter releases 页面。下载名为 Count_nuclei.zip 的最新版本文件。从“下载”文件夹中，右键单击该压缩文件，然后选择“全部解压”，将文件解压到本地计算机上的目标位置。接下来，在搜索栏中搜索 CMD 或命令提示符，以打开命令提示符窗口。使用 CD 命令将目录更改为可执行文件所在的路径，即可从下载文件夹中解压出的应用程序文件所在路径。然后按 Enter 键确认目录更改。在下一行命令中，将“path to images”替换为包含待分析图像的文件夹路径，将“path to output”替换为用于保存 .csv 文件的输出文件夹路径，并将“results.csv”替换为所需的输出文件名。屏幕上显示了一个示例代码，图像和输出路径可按引号内的格式插入。可使用 results.csv 作为结果文件名，也可指定其他名称。然后按 Enter 键。当下一行命令提示符出现时，确认处理已完成。验证指定的输出目录中是否已生成轮廓图像和结果电子表格文件。在数据归一化之前，目视检查轮廓图像，并与计数结果进行比较，以确认计数质量。打开浏览器并访问 github.com 上的 nuclei counter 项目页面。点击绿色的“Code”按钮，然后选择“Download ZIP”以下载代码仓库。对于 Mac OS 系统，点击“下载”文件夹中的文件菜单，选择“打开”以将文件解压至本地计算机。进入名为 nuclei_counter_main 的解压文件夹，该文件夹包含代码仓库内容。将该文件夹保存在易于访问的位置，并在文本文档中记录其文件路径。接下来，按下 Command + 空格键以打开 Spotlight 搜索，然后在 Spotlight 中输入 terminal 并选择终端应用程序。使用 CD 命令，通过复制粘贴文本文档中的文件路径，将目录切换至代码仓库路径，然后按 Enter 键。在下一行命令中，确保美元符号后有一个空格。然后输入屏幕上给出的命令并按 Enter 键，以安装所需的库并启用可编辑模式。在 pip 后立即输入适当的 Python 版本号，中间不留空格。在下一行命令中输入屏幕上的命令，将目录切换至主源代码目录，即屏幕所示的 CD nuclei_counter。然后输入屏幕上的命令，根据实际情况替换相应的文件路径，然后按 Enter 键。当下一行命令提示符出现时，确认处理已完成。验证指定的输出目录中是否已生成轮廓图像和结果电子表格文件。在数据归一化之前，目视检查轮廓图像，并与计数结果进行比较，以确认计数质量。由自动化程序生成的图像中所有细胞核均被实心绿色轮廓线标出，表明细胞核已被成功计数。两次人工计数之间的评分者间信度极佳，组内相关系数大于 0.999，P 值小于 0.0001。与平均人工计数相比，自动化程序表现出极佳的可靠性，组内相关系数为 0.993，P 值小于 0.0001。在所有细胞密度四分位区间均观察到极佳的可靠性，组内相关系数范围为 0.986 至 0.998，所有 P 值均小于 0.0001。自动化程序无法准确计数多个细胞核聚集区域或存在伪影（如光晕）的区域。这些潜在问题及其可能原因，以及提高图像质量和自动化细胞核定量工作流程准确性的故障排除步骤，已在屏幕上的表格中列出。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用计算机视觉库简化细胞核定量

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。...

基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

细胞内细胞器的形态、大小和位置在进化上是保守的，并且似乎直接影响其功能。了解这些过程背后的分子机制已成为现代生物学的重要目标。本文展示了如何通过应用定量技术来促进这些研究。...

为何定量至关重要：在表型水平上的特征描述 果蝇 幼虫神经肌肉接头

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。...

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

骨骼肌分化是一个高度动态的过程，尤其依赖于细胞核的定位。本文介绍了一种通过活细胞成像技术在成肌细胞分化及肌管形成过程中追踪细胞核运动的方法，并通过自动追踪获取的信息对细胞核动态进行定量表征。...

利用活体成像追踪成肌细胞分化与融合过程中的细胞核动态

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

我们提供了一种免费的工作流程，专为快速探索和精确分析荧光显微镜图像中特定细胞区室内的细胞结构而设计。该用户友好的工作流程基于开源软件 Icy 构建，同时利用了 ImageJ...

亚结构分析器：一种用于快速探索与精确分析荧光显微图像中细胞结构的用户友好型工作流程

我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系，以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术，可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。...

高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

本方法介绍了一种免疫荧光实验方案及定量分析流程，用于评估在具有不同核结构模式的人类T淋巴细胞中蛋白质的分布情况。该方案提供了从样品制备开始，到在Fiji中进行半自动化分析操作，最后通过Google...

一种用于分析多种细胞类型中核体动态变化的多功能流程

对多维显微图像数据的准确分析需要复杂的流程。本文演示了如何使用软件...

使用 Cell-ACDC 分析多维显微镜数据

学习使用开源计算机视觉程序自动定量细胞核，以标准化骨骼肌代谢数据。该方法减少人工计数偏差，提高实验效率，适用于热疗诱导肌肉适应机制研究。

利用计算机视觉库简化细胞核定量分析

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