Name: 基于荧光的 FEN1 核酸酶活性检测和小分子抑制剂的筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学习基于荧光的FEN1核酸酶活性检测方法，用于筛选小分子抑制剂FEN1-IN-4。该技术为癌症靶向治疗研究提供更安全、高效的生化分析工具，适用于高通量药物筛选平台。

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本工作得到了江苏省高等教育机构科学技术创新团队（2021年）、江苏省高等职业院校工程技术研究中心项目（2023年）、苏州市民生科技项目关键技术计划（SYWD2024099）、苏州大学放射医学与防护国家重点实验室项目（GZK12023013）、苏州卫生职业技术学院项目（SZWZYTD202201、SZWZYTD202205）以及中国江苏省青蓝工程（2021年、2022年）的资助。

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. FEN1 蛋白的表达与纯化
<ol>
	<li>蛋白质纯化
	<ol>
		<li>从 −80 °C 取出含有目标质粒的细菌保藏液（见材料表）。室温融化后，使用 200 µL 移液枪头将 1.5&#8239;mL 冷冻微量离心管中的 200 µL 菌液接种至含有 50 µg/mL 卡那霉素的 20&#8239;mL LB 培养基中。 
		注：菌株为 E. coli BL21(DE3)-FEN1。</li>
		<li>在 37 °C、160&#8239;rpm 振荡条件下培养 12 小时。</li>
		<li>将细菌悬液转移至含有添加了 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基的 200&#8239;mL 锥形瓶中。继续在 37 °C、160&#8239;rpm 振荡条件下培养 2–3 小时。</li>
		<li>当菌液 OD600 值达到约 0.6 时，加入 2&#8239;mL IPTG（终浓度：1&#8239;mM）。继续在 25 °C、160&#8239;rpm 振荡条件下培养 10 小时。</li>
		<li>将诱导后的菌液转移至预先称重的 50&#8239;mL 离心管中。在 4 °C、2500 × g 条件下离心 15 分钟。弃去上清液。称量含有沉淀的离心管重量，减去空管重量以计算沉淀质量。</li>
		<li>每克湿菌体沉淀加入 7&#8239;mL 裂解缓冲液。使用移液器反复吹打，充分重悬沉淀。 
		注：裂解缓冲液（共 10&#8239;mL）包含 20&#8239;mM Tris-HCl、250&#8239;mM NaCl、2% Triton X-100 和 ddH2O。此步骤应在通风橱中进行，以确保化学试剂的安全操作。</li>
		<li>将含有裂解缓冲液的细菌悬液转移至 −80 °C 冰箱中，冷冻过夜。次日，在 4 °C 摇床上解冻 1 小时，以提高裂解效率。</li>
		<li>使用超声波在 75% 功率下裂解细胞 45 分钟。在 4 °C、12,000 × g 条件下离心 20 分钟，分离上清液与沉淀。 
		注：若裂解液仍浑浊，可增加裂解缓冲液体积或重复冻融循环。也可加入核酸酶抑制剂以维持蛋白质完整性并防止降解。</li>
		<li>将澄清后的上清液沿管壁缓慢加入含有预装蛋白质纯化树脂的离心管中。用 10&#8239;mL 洗脱缓冲液洗涤，去除非特异性结合的蛋白质。 
		注：洗脱缓冲液包含 20&#8239;mM Tris-HCl（pH 7.5）、250&#8239;mM NaCl、2% Triton X-100、200&#8239;mM 咪唑和蒸馏水。</li>
		<li>沿离心管内壁加入 5&#8239;mL 洗脱缓冲液，洗脱 FEN1 蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过快速考马斯亮蓝染色鉴定目标蛋白
	<ol>
		<li>根据 FEN1 蛋白的预期大小，配制 12% 分离胶和 5% 浓缩胶的 SDS-PAGE 凝胶。</li>
		<li>将目标蛋白样品与 BSA 标准品按 1:4 的比例与 5× 上样缓冲液混合。在 95 °C 加热 5 分钟，使蛋白质充分变性。</li>
		<li>分别取 20 µL BSA 标准品和变性后的蛋白样品，加入 SDS-PAGE 凝胶的不同加样孔中。</li>
		<li>连接电泳装置。设定电压为 90&#8239;V，电泳 1 小时 40 分钟。</li>
		<li>电泳结束后，将凝胶转移至染色容器中。用去离子水冲洗，然后加入 30&#8239;mL 蛋白染色液，染色 25 分钟。回收染色液，用 20&#8239;mL 去离子水冲洗凝胶，并在水平摇床上脱色过夜。</li>
		<li>脱色后，将凝胶置于透明塑料板上，在白光下观察蛋白条带。 
		注：若条带较弱或蛋白浓度较低，可使用超滤管浓缩样品。该步骤可去除过量溶剂和小分子，提高蛋白浓度，确保后续实验的准确分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. FEN1 TAMRA标记的DNA底物制备
<ol>
	<li>TAMRA 标记的 DNA 底物制备
	<ol>
		<li>根据 FEN1 的特异性切割活性设计 DNA 寡核苷酸链，参考已发表的方法17（见表 1）。D1 序列的 5′ 端用荧光 TAMRA 标记进行修饰。</li>
		<li>将混合的单链 DNA 寡核苷酸加入 10 μL 退火缓冲液中，具体体积如下：5 μL D1（10 pmol/μL）、10 μL T1（10 pmol/μL）和 7.5 μL U2（10 pmol/μL）。加入去离子水使总体积达到 50 μL。 
		注：退火缓冲液包含 100&#8239;mM Tris-HCl（pH 7.5）和 10&#8239;mM MgCl2。</li>
		<li>将反应混合物置于金属浴中，100 °C 加热 1 分钟，然后立即转移至 72 °C 保温 10 分钟18。 
		注：最终 DNA 底物长度为 80 个核苷酸。初始高温（100 °C）确保完全变性，而退火温度（72 °C）促进准确的链间配对。</li>
		<li>关闭热源，使溶液逐渐冷却至室温，形成完整的双链 DNA 底物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TAMRA 标记的 DNA 底物检测
	<ol>
		<li>通过混合以下组分制备 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶：4.8&#8239;mL 30% 丙烯酰胺（29:1）、4.32&#8239;mL 6&#8239;M 尿素、2.4&#8239;mL 5× TBE、50 µL 10% APS、5 µL TEMED 和 0.48&#8239;mL 去离子水。充分混匀以制备凝胶。</li>
		<li>将凝胶置于 37 °C 烘箱中 30 分钟以使其完全凝固。</li>
		<li>用于检测时，将 2 µL 合成的 DNA 底物加入 18 µL 蒸馏水中，并加入 7.7 µL 终止缓冲液。</li>
		<li>作为对照，将 2 µL TAMRA 标记的 D1 加入 18 µL 蒸馏水中，并加入 7.7 µL 终止缓冲液。</li>
		<li>将每种制备好的样品各取 20 µL 上样至凝胶，进行 SDS-PAGE 电泳以分析 DNA 底物的形成情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. FEN1 核酸酶活性检测
<ol>
	<li>FEN1 酶活性检测
	<ol>
		<li>通过将 2 µL DNA 底物与 FEN1 核酸酶在反应缓冲液中混合，配制 20 µL 反应体系。 
		注意：反应缓冲液由 100&#8239;mM Tris-HCl（pH 7.5）、200&#8239;mM MgCl2、2&#8239;mM DTT、0.2&#8239;mg/mL BSA 和去离子水组成。</li>
		<li>将反应体系置于金属浴中，37 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 20 µL 2× 终止缓冲液以终止反应。</li>
		<li>取 20 µL 反应后的样品，上样至预置的 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶，于 100&#8239;V 恒压电泳 60 分钟。</li>
		<li>电泳结束后，使用荧光成像系统（600 pathway）观察结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. FEN1 核酸酶小分子抑制剂的筛选
<ol>
	<li>小分子抑制剂筛选
	<ol>
		<li>使用移液器将 2 µL 二甲基亚砜 (DMSO) 转移至一个 1.5&#8239;mL 微量离心管中。</li>
		<li>向管中加入 2 µL FEN1 核酸酶和 10 µL 2× 反应缓冲液。</li>
		<li>充分混匀，并将混合物置于冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入 2 μL DNA 底物和 4 μL 去离子水，充分混匀，使总体积达到 20 μL。</li>
		<li>通过将 1&#8239;M 储存液用 DMSO 进行两倍倍比系列稀释，制备 FEN1 核酸酶抑制剂 FEN1-IN-4 的工作稀释液。</li>
		<li>用移液器将 2 µL FEN1 核酸酶 (0.03 µg/µL) 和 2 µL 稀释后的 FEN1-IN-4 抑制剂加入一个新的 1.5&#8239;mL 微量离心管中。加入 10 µL 2× 反应缓冲液和 4 µL 去离子水。轻轻混匀，并在冰上孵育 10 分钟，以确保抑制剂与酶之间充分结合。</li>
		<li>向管中加入 2 µL DNA 底物，形成最终体积为 20 µL 的反应混合物。</li>
		<li>将反应体系在 37 °C 金属浴中孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 20 µL 2× 终止缓冲液以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
FEN1--IN-4 小分子抑制剂抑制效力的评估
<ol>
	<li>使用微量移液器吸取10 µL的2×反应缓冲液，加入到一个1.5 mL的微量离心管中。</li>
	<li>加入2 µL浓度为0.03 µg/µL的FEN1核酸酶，以及不同浓度的2 µL FEN1抑制剂FEN1-IN-4。 
	注意：应根据实验要求建立多个浓度梯度。</li>
	<li>加入4 μL去离子水，并充分混匀溶液。将1.5 mL微量离心管置于冰上，孵育10分钟。</li>
	<li>向管中加入2 µL双链DNA底物，形成20 µL的反应体系。</li>
	<li>将EP管放入37 °C金属浴中孵育15分钟。</li>
	<li>反应完成后，向反应混合物中加入20 µL的2×终止缓冲液以终止反应。</li>
	<li>使用荧光成像设备观察结果，并绘制IC50&#160;曲线19。 
	注意：使用Fiji/ImageJ20进行荧光强度定量，随后采用绘图与分析软件进行统计分析和可视化21。</li>
</ol>

<ol><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell-virus-virophage+tripartite+infection+systems+discovered+in+the+freshwater+lake+Dishui+Lake+in+Shanghai%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China.</a> J Virol. 94 (11), e00149(2020).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

FEN1 核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选在DNA损伤修复与癌症发生研究中具有核心作用。与传统的放射性标记技术相比，本方法具有成本低、效率高、操作简便和安全性好等优势。此外，与基于荧光爆发信号的FEN1检测方法不同，该方法能够更直观地显示底物的切割情况，从而更准确地评估酶活性，并为相关研究提供更为可靠的实验平台14。
确保结果的可靠性和可重复性，有几个关键步骤至关重要。首先，采用原核表达系统（E. coli BL21用于表达重组FEN1蛋白，从而实现酶学实验所需蛋白的大规模制备。该蛋白带有N端His标签，通过镍亲和层析进行纯化，并用咪唑洗脱。蛋白的纯度和身份已得到确认 通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹，如图所示 图2A.
DNA底物的设计基于该研究团队先前关于FEN1核酸酶的研究工作17。这些底物模拟了在DNA复制和修复过...

DNA复制并不总是完美的，可能受到内部和外部因素的干扰。因此，DNA复制及损伤修复机制对于细胞存活和基因组稳定性至关重要。在此过程中，人源分支结构特异性核酸内切酶FEN1（Flap Endonuclease 1）作为一种核心DNA核酸酶，发挥着关键作用1,2,3。
FEN1 主要参与 DNA 复制过程，对滞后链上冈崎片段的成熟至关重要4,5。这确保了 DNA 复制的高效进行以及受损 DNA 的准确修复。然而，FEN1 水平的异常升高已与多种癌症的发生密切相关6,7，例如肺癌和乳腺癌7。因此，FEN1 不仅在 DNA 复制和修复中发挥关键作用，还作为癌症诊断的生物标志物及潜在治疗靶点受到广泛关注8,9。检测 FEN1 活性对于癌症的早期诊断以及靶向治疗研究的推进具有重要意义。
鉴于FEN1的重要性，以及研究其活性以实现癌症早期诊断和靶向治疗开发的需求，本实验所建立方法的主要目标是准确、高效地检测FEN1核酸酶活性。该方法旨在为筛选靶向FEN1的小分子抑制剂提供一个可靠的平台。通过实现这些目标，本研究期望加深对FEN1在癌症中作用的理解，并推动新型治疗策略的发现。
目前存在多种检测FEN1核酸酶活性的技术，每种技术在特性、原理、优势、局限性及适用场景方面各不相同。例如，基于凝胶电泳和高效液相色谱（HPLC）的底物分离方法虽然能够提供直观的结果，但操作繁琐且通量较低10,11。荧光偏振（FP）检测法在评估FEN1活性时面临挑战，因为化合物的自发荧光或光散射会干扰FP信号。尽管可通过反筛策略部分排除假阳性结果，但由于技术干扰，仍有约15%的初筛活性化合物被误判12。结合使用荧光供体/淬灭剂对（如TAMRA/BHQ-2）与AlphaScreen化学发光的方法也存在缺点，例如合成复杂的三重茎环荧光底物成本较高，尤其限制了其在大规模筛选中的应用。此外，底物的双茎环结构可能阻碍其与FEN1的最佳结合，降低酶切效率，从而影响检测灵敏度。同时，该方法高度依赖专用仪器（如ViewLux、EnVision），限制了其在资源有限实验室中的推广应用13,14,15。基于银纳米簇功能化的哑铃形双茎环DNA纳米探针（DNA-AgNCs）的荧光检测方法则因依赖精确的退火和原位成核步骤，存在批次间变异问题，影响实验的可重复性和可扩展性。高昂的成本和耗时的操作流程进一步限制了其实际应用16。
本文开发了一种基于荧光标记的检测方法，以解决当前技术的局限性，并满足对更安全、易于用户操作的FEN1活性研究方法日益增长的需求。该技术利用了荧光检测的高度特异性和高灵敏度，以及构建具有明确结构的DNA底物的能力，这些底物可被FEN1识别并切割（图1）。该方法在保持对FEN1核酸酶活性高精度评估的同时，简化了实验流程。与传统的凝胶电泳和基于高效液相色谱（HPLC）的技术相比，该方法操作更简便，检测周期更短。与荧光偏振检测不同，该方法可实现对化合物的快速定性筛选，为初步酶学评价建立了一种高效的策略。
该方法适用于在放射性材料使用受限的实验室环境中研究FEN1核酸酶活性。它也特别适合在较短时间内对大量小分子抑制剂进行筛选，尤其是在需要高灵敏度和高特异性的场合。然而，对于需要极高精度进行绝对定量的研究，或缺乏基本荧光检测设备以及荧光信号分析经验的实验室，该方法并不理想。对于侧重于体内（in vivo）应用的研究——其中FEN1的行为可能受到当前体外（in vitro）检测体系无法模拟的复杂生物学因素影响——可能需要进一步优化方法或采用其他替代方案。
该荧光检测法具有高灵敏度和高特异性，为研究FEN1活性及开发其抑制剂提供了一种安全、便捷且有效的工具。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Beyotime</td><td>ST774</td><td></td></tr><tr><td>30% Acr-Bis (29:1)</td><td>Beyotime</td><td>ST003-500ml</td><td></td></tr><tr><td>5M Nacl</td><td>Beyotime</td><td>ST347</td><td></td></tr><tr><td>BeyoBlue Plus</td><td>Beyotime</td><td>P0003S</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)-FEN1</td><td>Vazyme</td><td>C504-F1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>P0007</td><td></td></tr><tr><td>脱色摇床</td><td>Kylin-Bell</td><td>TS-100</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇</td><td>Beyotime</td><td>ST041</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温孵育器</td><td>RUICHENG</td><td>DH200</td><td></td></tr><tr><td>电泳仪</td><td>北京六一生物科技</td><td>DDY-6D</td><td></td></tr><tr><td>FEN1-IN-4</td><td>TargetMOL</td><td>T8545</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Takaba</td><td>9030</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素硫酸盐</td><td>Biosharp</td><td>BS152</td><td></td></tr><tr><td>实验室离心机</td><td>Thermo</td><td>SL 16R</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Solarbio</td><td>L8291</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His Bind Resin</td><td>7se biotech</td><td>PANF001-001C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>ODYSSEY</td><td>LI-COR</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Trition-x-100</td><td>Shyuanye</td><td>S15022</td><td></td></tr></tbody></table>

基于荧光的fen1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选

Fluorescence-Based Detection of FEN1 Nuclease Activity and Screening of Small-Molecule Inhibitors

FEN1（瓣状内切核酸酶1）是一种参与DNA复制和损伤修复的关键DNA核酸酶，在维持基因组稳定性方面发挥重要作用。FEN1活性升高与多种癌症的发生发展密切相关，使其成为肺癌、乳腺癌和前列腺癌公认的生物标志物和药物靶点。传统的放射性同位素标记法在检测FEN1核酸酶活性时存在操作不便和安全性差等问题。本研究合成了一种具有瓣状结构的DNA片段底物 体外该底物在 flap 的 5' 端标记有荧光基团，可使 FEN1 核酸酶特异性识别并切割指定位点。通过凝胶电泳后检测荧光基团信号，即可测定 FEN1 的活性。该方法能够快速、有效地评估 FEN1 核酸酶活性及其抑制剂的筛选，为分析 FEN1 活性及评价小分子抑制剂的效力提供了一种灵敏且特异的技术手段。此外，该方法对 DNA 损伤修复及癌症发生机制的研究具有重要意义，为疾病机制的临床研究以及遗传毒性物质的检测提供了新的策略。

如图2A所示，染色试剂与蛋白质结合，使蛋白质在凝胶上呈现为蓝色条带。第一泳道包含用作分子量参照的标记蛋白质，其中BSA标准蛋白质条带对应的分子量为70 kDa，FEN1核酸酶蛋白质条带对应的分子量为45 kDa。实验结果表明，FEN1核酸酶在约45 kDa处出现清晰条带，表明诱导表达的蛋白质已成功纯化。
如图2B所示，第2泳道中的D1为荧光素标记的单链DNA底物，其条带大小为59 kDa。第3泳道中的SF为合成的荧光素标记双链底物，其条带大小为80 kDa。与第2泳道相比，结果表明荧光素标记的双链DNA底物合成成功。
如图2C所示，第2泳道中的D1为荧光素标记的单链DNA底物，而第3泳道中的SF代表未经处理的荧光素标记双链DNA底物。第4至第9泳道显示了FEN1在1 µg/µL、0.5 µg/µL、0.25 µg/µL、0.125 µg/µL、0.0...

本方案描述了一种凝胶迁移生化实验，用于检测FEN1（瓣状内切酶1）的活性及抑制剂的开发。

基于荧光的FEN1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选

FEN1（Flap 内切酶 1）是一种关键的 DNA 核酸酶，参与 DNA 复制和损伤修复，在维持基因组稳定性中发挥重要作用。

我们开发了一种基于荧光的方法来检测FEN1核酸酶活性并筛选小分子抑制剂，从而推动了诊断技术和靶向治疗研究的发展。目前的表达检测面临诸多挑战，包括传统方法的复杂性和安全性问题，以及现有基于荧光技术所需的高成本和专用设备。本方案解决了传统放射学方法和高成本荧光技术的不足，提供了一种更安全、高效且易于使用的检测方案。我们的实验室将致力于优化高通量筛选平台，以探索FEN1抑制剂在癌症治疗中的体内应用及其作用机制。[指导教师] 首先，根据FEN1的特异性切割活性设计DNA寡核苷酸链。将单链DNA寡核苷酸加入退火缓冲液中混合。加入10微升退火缓冲液和去离子水，使总体积达到50微升。随后，将反应混合物置于金属浴中，100摄氏度加热1分钟。立即转移至72摄氏度，孵育10分钟。然后关闭热源，使溶液逐渐冷却至室温，以形成完整的双链DNA底物。进行FEN1核酸酶活性检测时，首先将2微升DNA底物与FEN1核酸酶在反应缓冲液中混合。将反应混合物置于37摄氏度金属浴中孵育15分钟。加入20微升2X终止缓冲液以终止反应。随后，将20微升终止后的样品上样至预置的12%变性聚丙烯酰胺凝胶。以100伏电压电泳60分钟。完成后，在荧光成像系统下观察电泳结果。用移液器将2微升二甲基亚砜转移至1.5毫升微量离心管中。向管中加入2微升FEN1核酸酶和10微升2X反应缓冲液，以及6微升去离子水。充分混匀后，冰上孵育10分钟。孵育结束后，加入2微升DNA底物，使最终反应体积为20微升。接下来，通过将1摩尔储备液（溶于二甲基亚砜）进行两倍系列稀释，制备FEN1核酸酶抑制剂FEN1-IN-4的工作稀释液。向新的1.5毫升微量离心管中分别加入2微升FEN1核酸酶和2微升稀释后的FEN1-IN-4抑制剂。然后加入10微升2X反应缓冲液和4微升去离子水。轻轻混匀后，冰上孵育10分钟。随后向管中加入2微升DNA底物，使最终体积达到20微升。将反应混合物置于37摄氏度金属浴中孵育15分钟。然后加入20微升终止缓冲液终止反应。在约45千道尔顿处出现清晰的蛋白条带，表明从诱导表达中成功纯化了FEN1核酸酶。荧光素标记的双链DNA底物出现在80千道尔顿位置，与59千道尔顿的单链底物相比，证实了其成功合成。FEN1核酸酶以剂量依赖方式切割80个核苷酸的双链DNA底物，在0.5微克/微升浓度下观察到完全切割。FEN1-IN-4化合物显著抑制了FEN1对双链DNA底物的切割，表现为80个核苷酸条带的保留。FEN1-IN-4以浓度依赖方式降低FEN1核酸酶活性，其半数最大抑制浓度为14.03微摩尔。

fluorescence-based-detection-fen1-nuclease-activity-screening-small

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于荧光的 FEN1 核酸酶活性检测和小分子抑制剂的筛选

本文描述了一种涉及FRET（福斯特共振能量转移）信号定量分析的新方法，用于研究酶动力学。通过该方法获得了SENP1（SUMO/Sentrin特异性蛋白酶1）催化结构域对pre-SUMO1（小泛素样修饰蛋白1）水解反应的KM和kcat值。这种基于定量FRET的蛋白酶动力学研究的一般原理可应用于其他蛋白酶的研究。...

定量FRET（Förster共振能量转移）分析用于SENP1蛋白酶动力学测定

外切核酸酶在维持基因组稳定性方面发挥着关键作用。WRN外切核酸酶功能的缺失会导致早衰。研究该核酸酶的底物及其他需求因素 体外 有助于阐明其作用...

一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关WRN外切酶的果蝇同源蛋白DmWRNexo及其在其他核酸酶中的应用

本研究提出了一种高通量筛选方法，采用一种通用的遗传性酶筛选系统，理论上可应用于200多种酶。在此，通过更换所用底物，该单一筛选系统即可识别三种不同的酶（脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）p对硝基苯乙酸酯，p-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷，以及苯基磷酸盐。...

基于高通量基因酶筛选系统的多酶筛选

我们介绍一种开源的高内涵分析（HCA）仪器，该仪器利用自动化的荧光寿命成像（FLIM）技术，通过基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法来分析蛋白质相互作用。openFLIM-HCA 仪器的数据采集由基于 µManager 编写的软件控制，数据分析则在 FLIMfit...

利用自动荧光寿命成像显微镜的开源高内涵分析

已开发基于核磁共振（NMR）的活性检测方法，用于鉴定和表征两种核苷核糖水解酶抑制剂。本文提供了在500 μM和250 μM浓度下进行初筛化合物检测、测定IC50值的剂量-反应检测、去垢剂对照筛选检测、稀释-跳跃对照筛选检测，以及在大肠杆菌（E.

基于核磁共振的活性检测方法用于测定核苷核糖水解酶的化合物抑制作用、IC50 值、人工活性及全细胞活性

核酸酶活性的改变与多种人类疾病状态相关，表明其作为疾病生物标志物的潜力。本文介绍了一种模块化且易于实施的筛选方法，可用于选择特异性的核酸探针，从而利用核酸酶活性作为疾病的生物标志物。...

利用核酸探针进行核酸酶活性的动力学筛选

监测目标蛋白熔解温度的变化即热移位分析（thermal shift assay, TSA）是一种用于筛选包含数百种化合物的片段库的高效方法。本文介绍了一种采用机器人辅助纳米微分扫描荧光法（nano-DSF）的TSA实验方案，通过监测内在色氨酸荧光和光背向散射进行片段筛选。...

基于片段的先导化合物发现中用于筛选的纳米差示扫描荧光法

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

RAS病是一类由RAS-MAPK信号通路过度激活引起的多系统遗传综合征。随着大量潜在致病变异不断被发现，亟需对其进行功能验证，然而临床前证据的缺乏限制了治疗策略的开发。本文中，我们描述了一种在Teen-报告基因斑马鱼中通过活体FRET成像检测RAS病相关ERK活化水平及其在胚胎发育过程中药物调控作用的体内实验方案。...

一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

本方案介绍了一种优化的荧光检测筛选方法，用于鉴定天然产物/小分子蛋白合成抑制剂。该方法具有良好的实用性，既适用于本科生药物发现技术的教学，也适用于药物化学研究项目的实施。...

一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

本文介绍一种用于固定哺乳动物细胞中聚（ADP-核糖）（PAR）富集灶的细胞水平可视化、亚细胞定位及定量分析的方法。该检测方法可对暴露于基因毒素的细胞核内由DNA损伤诱导的PARP激活位点进行定量分析，包括与碱基切除修复或单链断裂修复相关的激活位点。...

利用基于荧光融合蛋白的报告系统对细胞中基因毒素诱导的PARP1/PARP2激活进行可视化与定量分析

学习基于荧光的FEN1核酸酶活性检测方法，用于筛选小分子抑制剂FEN1-IN-4。该技术为癌症靶向治疗研究提供更安全、高效的生化分析工具，适用于高通量药物筛选平台。

基于荧光的FEN1核酸酶活性检测及小分子抑制剂筛选

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