基于荧光的 FEN1 核酸酶活性检测和小分子抑制剂的筛选

我们开发了一种基于荧光的方法来检测 FEN1 核酸酶活性并筛选小分子抑制剂，推进了诊断和靶向治疗研究。

当前的表达挑战包括传统方法的复杂性和安全性问题，以及现有荧光技术所需的高成本和专用设备。

该协议解决了传统放射学方法和高成本荧光技术的缺点，提供了更安全、高效和易于使用的检测解决方案。

我们的实验室将专注于优化高通量筛选平台，探索FEN1抑制剂在癌症治疗中的体内应用和机制。

[导师]首先，根据FEN1的特异性切割活性设计DNA寡核苷酸链。将单链 DNA 寡核苷酸混合在退火缓冲液中。加入 10 微升退火缓冲液和去离子水，使总体积为 50 微升。然后，将反应混合物在金属浴中以 100 摄氏度加热一分钟。立即将试管转移到 72 摄氏度并孵育 10 分钟。然后，关闭热源，让溶液逐渐冷却至室温，形成完整的双链DNA底物。对于FEN1核酸酶活性测定，首先将两微升DNA底物与FEN1核酸酶混合在反应缓冲液中。将反应混合物在37摄氏度的金属浴中孵育15分钟。加入 20 微升 2X 终止缓冲液以停止反应。然后，将 20 微升端接样品加载到预先制备的 12% 变性聚丙烯酰胺凝胶上。将凝胶在100伏下电泳60分钟。完成后，在荧光成像系统下可视化电泳结果。使用移液器，将两微升二甲基亚砜转移到 1.5 毫升微量离心管中。向试管中加入 2 微升 FEN1 核酸酶和 10 微升 2X 反应缓冲液和 6 微升去离子水。将溶液充分混合，然后在冰上孵育 10 分钟。孵育后，移液两微升DNA底物，以达到20微升的最终反应体积。接下来，通过从二甲基亚砜中的一摩尔储备溶液进行两倍连续稀释，制备FEN1核酸酶抑制剂FEN1-IN-4的工作稀释液。将FEN1核酸酶和稀释的FEN1-IN-4抑制剂各移液2微升到新的1.5毫升微量离心管中。然后，移液 10 微升 2X 反应缓冲液和 4 微升去离子水。轻轻混合并将混合物在冰上孵育 10 分钟。现在，将两微升 DNA 底物添加到管中，使最终体积达到 20 微升。将反应混合物在37摄氏度下在金属浴中孵育15分钟。然后，通过加入 20 微升终止缓冲液终止反应。大约 45 千道尔顿的透明蛋白条带证实了从诱导表达中成功纯化了 FEN1 核酸酶。荧光素标记的双链DNA底物在80千道尔顿时出现，与59千道尔顿的单链底物相比，证实了成功合成。FEN1核酸酶以剂量依赖性方式裂解80个核苷酸的双链DNA底物，在0.5微克/微升时观察到完全切割。FEN1-IN-4化合物显著抑制FEN1对双链DNA底物的切割，如保留80个核苷酸条带所示。FEN1-IN-4 以浓度依赖性方式降低 FEN1 核酸酶活性，半最大抑制浓度为 14.03 微摩尔。