用于揭示放射敏感和放射抗性基因的全基因组 CRISPR 筛选

本研究的重点是全基因组CRISPR筛查和放疗。我们提供了一种方案，用于在照射后使用全基因组 CRISPR 筛选在肺癌细胞中查看放射敏感和抗辐射基因。目前的实验挑战包括脱靶效应，这是由于基因组的巨大复杂性和探索潜在机制的潜在困难造成的。与传统的筛选方法相比，CRISPR实现了永久性基因改造，并表现出卓越的精确度，这使得它在功能基因组研究和靶点发现中特别有价值。未来，我们的团队将专注于研究体内CRISPR屏幕，以解决这项研究留下的问题，并致力于优化CRISPR技术。

[旁白]首先，将贴壁细胞密度调整为10的五倍，每毫升5个细胞的幂。使用移液器，将两毫升细胞悬液分配到每个3.5厘米的培养皿中，以不同剂量进行放射治疗。将培养皿放入设置为 37 摄氏度的培养箱中，含有 5% 二氧化碳并孵育过夜。使用记号笔将每个 3.5 厘米的培养皿从 1 到 5 编号。使用辐射源，分别对培养皿 2 至 5 施以 2、4、6 和 8 灰色的辐射剂量。将辐照细胞密度调整为10的1乘以每毫升5个细胞的幂。每孔接种 10 微升，相当于每 100 微升 1000 个细胞，每个辐射剂量重复 3 次。然后将每孔 30 微升（相当于每 100 微升 3000 个细胞）接种到 96 孔板中，每个辐射剂量重复 5 次。现在，将 CCK-8 试剂与不含 FBS 的 RPMI 1640 培养基以 1 比 9 的比例混合。将混合物加入 96 孔板中，并将板在黑暗中孵育一小时。然后使用酶标仪测量 450 纳米处的光密度。要开始感染过程，请为慢病毒设置从零到每毫升 800 单位的对数浓度梯度。将相应体积的慢病毒加入每个培养皿两微升聚苯中，并在室温下平衡五分钟。将慢病毒聚溴化混合物慢慢滴入每个孔中。将亲本细胞密度调整为每毫升 5 个细胞的 3 倍 10 次方，并将 1 毫升接种到 12 孔板的每个孔中。将嘌呤霉素以浓度梯度添加到孔中。感染72小时后，用含有最低嘌呤霉素浓度的完全培养基替换每个孔中的培养基，以杀伤细胞。根据存活的细胞计算每个孔的感染多重性。将贴壁细胞密度调整为10的1乘以每毫升7个细胞的幂。将感染倍数等于0.3的慢病毒加入每培养皿30微升聚苯中，并在室温下平衡五分钟。将慢病毒和聚乙烯混合物慢慢滴入15厘米的培养皿中。充分混合并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育过夜。在感染后的第二天，从培养皿中吸出培养基，并用含有10%FBS的15毫升RPMI 1640完全培养基代替。对未感染的亲本细胞重复相同的处理作为阴性对照，并继续培养72小时。现在，使用 0.25% 胰蛋白酶从一个 15 厘米的培养皿中消化细胞。将细胞重悬于含有 10% PBS 的 RPMI 1640 完全培养基中，并计数细胞数。提取零天的基因组 DNA 后，使用 NanoDrop 紫外分光光度计测量 DNA 浓度和纯度。对治疗组的细胞给予适当剂量的辐射，让对照组的细胞不处理正常繁殖。治疗14天后，使用0.25%胰蛋白酶消化治疗组和对照组细胞。将细胞重悬于含有 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基中。将细胞以 300 G 离心五分钟，然后弃去上清液。将沉淀重悬于一毫升PBS中。重复离心步骤后，从沉淀中提取第 14 天的基因组 DNA 并测定 DNA 浓度。接下来，准备所需的引物并将其稀释至 10 微摩尔。添加组分以建立 20 微升反应系统后，将试管以 300 G 短暂离心 5 秒钟。对于琼脂糖凝胶电泳，准备凝胶，从中取出梳子，并用足够的缓冲液填充电泳罐以覆盖凝胶。将上样缓冲液添加到 DNA 样品中并充分混合。 最后，将混合物装入孔中并开始电泳14天后菌落形成表明，与零格雷相比，暴露于两个格雷辐射显着减少了存活菌落的数量。CCKA测定显示，在两个格雷时细胞活力显着下降，在较高的辐射剂量下进一步下降。用增加浓度的嘌呤霉素处理72小时表明，1微摩尔是消除A549细胞所需的最低浓度。PCR 验证显示 231 个碱基对处有不同的条带，证实了 CRISPR 文库中 sgRNA 序列的预期长度。测序分析显示，大约 60% 的读数成功定位到参考基因组。sgRNA 读取计数遵循泊松分布，符合基因组规模筛选的理论预期。PCA和热图分析显示，组间变异性高，组间变异低，验证了实验一致性。基因本体分析确定 DNA 损伤反应是前 15 名结果中富集最多的途径。