Name: 用于揭示放射敏感和放射抗性基因的全基因组 CRISPR 筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习全基因组CRISPR/Cas9筛选技术，用于鉴定肺癌细胞中的放射敏感和放射抗性基因。该方法通过慢病毒转导和CCK-8细胞活力检测，揭示DNA损伤应答通路，为克服肿瘤放疗耐药性提供功能基因组学研究基础。

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本研究由湖北省区域科技创新项目（2024EIA001）和武汉大学中南医院医学科技创新平台建设项目支持项目（PTXM2025001）资助。图1 使用 Figdraw 软件绘制。

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 选择合适的辐射剂量
<ol>
	<li>贴壁细胞的制备与接种
	<ol>
		<li>使用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培养基将细胞密度调整为每毫升5 × 105个细胞，用于传代和细胞生长。将细胞分装至3.5 cm培养皿中，用于接受不同剂量的辐射处理。每皿加入2 mL细胞悬液（含1 × 106个细胞），于37 °C、5% CO2条件下培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>施加不同辐射剂量
	<ol>
		<li>将3.5 cm培养皿编号为1至5号。第1组作为对照组，其余4组设为处理组。</li>
		<li>用封口膜密封6孔板边缘，对处理组分别施加2、4、6和8 Gy的辐射剂量。处理完成后，将培养皿放回培养箱中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>辐射后细胞系的接种
	<ol>
		<li>准备6孔板和96孔板。用PBS洗涤3.5 cm培养皿中的细胞一次，使用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，并用含10% FBS的RPMI 1640完全培养基将细胞密度调整为每毫升1 × 105个细胞。</li>
		<li>按每孔10 µL（即每100 µL含1,000个细胞）接种至6孔板中，每个辐射剂量设3个重复。每孔加入2 mL完全培养基，培养14天后进行计数（当每个克隆群体约含50个细胞时）。</li>
		<li>按每孔30 µL（即每100 µL含3,000个细胞）接种至96孔板中，每个辐射剂量设5个重复。每孔加入70 µL完全培养基，于72小时后检测细胞活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞活力测定 
	注意：克隆形成抑制率 = 1 -（处理组克隆数 / 对照组克隆数）× 100%。CCK-8法利用一种水溶性四唑盐（WST-8），可被细胞内的脱氢酶还原生成高度水溶性的黄色甲臜产物11。生成的甲臜量与活细胞数量成正比，其在450 nm波长处测得的光密度值能准确反映细胞的代谢活性和增殖状态11,13。基于这一成熟原理，CCK-8法已被广泛应用于细胞增殖检测、肿瘤药物敏感性测试等多种实验场景。本实验方案中，采用CCK-8法系统评估不同辐射剂量下的细胞活力。
	<ol>
		<li>将CCK-8试剂与不含FBS的RPMI 1640培养基按1:9比例混合。弃去96孔板中的原有培养基，每孔加入含CCK-8的混合培养基100 µL。</li>
		<li>避光孵育1小时，使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的OD值。 
		注意：细胞存活率 = [（处理组OD值 - 空白孔OD值）/（对照组OD值 - 空白孔OD值）] × 100%</li>
	</ol>
	</li>
	<li>辐射剂量的选择
	<ol>
		<li>结合克隆形成抑制率与细胞存活率，根据研究需求选择合适的辐射剂量。选择抑制率为50%左右的辐射剂量，用于筛选放射抗性与放射敏感性相关基因。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 选择合适的感染复数（MOI）和嘌呤霉素浓度
<ol>
	<li>贴壁细胞的接种
	<ol>
		<li>将细胞密度调整至每毫升 3 × 105 个细胞，每孔接种 1 mL（即 3 × 105 个细胞）至 12 孔板中。于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒感染
	<ol>
		<li>使用移液器吸除 12 孔板中的培养基，每孔加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 1 mL RPMI 1640 完全培养基。准备经质量验证的全基因组 CRISPR 慢病毒文库（建议使用商业化文库），并设置对数浓度梯度（例如 0-10-50-100-200-400-800）4,5,6,7,8。</li>
		<li>将相应量的慢病毒加入每孔 2 µL 的 polybrene 中，室温平衡 5 分钟。缓慢将慢病毒与 polybrene 的混合液滴加至各孔中，充分混匀后于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定杀灭细胞所需的最低嘌呤霉素浓度
	<ol>
		<li>将亲本细胞密度调整至 3 × 105 个细胞/mL，每孔接种 1 mL（即 3 × 105 个细胞）至 12 孔板中。于 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。</li>
		<li>在 12 孔板各孔中加入浓度梯度为 0-0.1-0.2-0.5-1-2-4-8 µM 的嘌呤霉素。72 小时后计数细胞。能够完全杀灭孔中所有细胞的最低浓度即为杀灭细胞所需的最低嘌呤霉素浓度，该浓度将用于后续对病毒感染细胞的筛选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后嘌呤霉素筛选
	<ol>
		<li>感染后的第二天，吸除各孔中的培养基，每孔更换为含 10% FBS 的 1 mL RPMI 1640 完全培养基。继续培养 48 小时。</li>
		<li>感染 72 小时后，将现有培养基更换为含有杀灭细胞所需最低浓度嘌呤霉素的完全培养基。在 12 孔板中设置两个未进行慢病毒感染的孔作为阴性对照和阳性对照。阴性对照孔加入嘌呤霉素处理，阳性对照孔不加嘌呤霉素。继续培养 72 小时。</li>
		<li>经过 72 小时嘌呤霉素筛选后，阴性对照中的所有亲本细胞应全部死亡，而阳性对照中的亲本细胞死亡极少。计算每孔的感染复数（MOI）。 
		注：MOI =（病毒感染组细胞数 / 阳性对照组细胞数）× 100%。选择 MOI 约为 0.3 的病毒浓度用于后续筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 全基因组范围CRISPR慢病毒文库感染
<ol>
	<li>贴壁细胞系的接种
	<ol>
		<li>将细胞密度调整为每毫升 RPMI 1640 完全培养基（含 10% FBS）中 1 × 107 个细胞，用于传代和细胞生长。将 1 mL 细胞悬液（含 1 × 107 个细胞）接种至每个 15 cm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 8 小时。待细胞贴壁并达到 70%–80% 融合度时，即可用于病毒感染（拷贝数约为 500）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒感染
	<ol>
		<li>吸除 15 cm 培养皿中的培养基，更换为 15 mL 含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基。准备经质量验证的全基因组 CRISPR 慢病毒文库。</li>
		<li>加入相应量的慢病毒（MOI = 0.3）及 30 µL/皿的聚凝胺（polybrene），室温平衡 5 分钟，缓慢将慢病毒与聚凝胺混合液滴加至 15 cm 培养皿中，轻轻混匀，于 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。同时，准备一皿亲本细胞作为对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染后嘌呤霉素筛选
	<ol>
		<li>病毒感染后的第二天，吸除 15 cm 培养皿中的培养基，更换为 15 mL 含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基，继续培养 48 小时。</li>
		<li>感染后 72 小时，更换为含最低致死浓度嘌呤霉素的完全培养基。以未感染的亲本细胞作为阴性对照，同样处理，并继续培养 72 小时。经过 72 小时的嘌呤霉素筛选后，阴性对照组中的亲本细胞应全部死亡，而慢病毒感染组中存活的细胞视为感染成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 0 天基因组提取
	<ol>
		<li>用 0.25% 胰蛋白酶消化一个 15 cm 培养皿中的细胞，重悬于含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养基中，计数细胞数量。将此样本标记为第 0 天（Day 0）。</li>
		<li>在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清；加入 1 mL PBS 重悬，再次以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清。提取第 0 天的基因组 DNA，使用 Nanodrop 紫外分光光度计测定 DNA 浓度和纯度。</li>
		<li>为检测 sgRNA 完整性，采用琼脂糖凝胶电泳分析扩增后的 sgRNA 文库，确保条带清晰且无明显降解，从而保持文库的完整性23。为评估慢病毒文库的覆盖度，采用深度测序技术对文库中的 sgRNA 进行测序分析24,25。</li>
		<li>在 CRISPR 筛选中，PCR 扩增用于初步验证 sgRNA 片段的完整性及文库质量6。为更全面地分析文库覆盖度和 sgRNA 分布模式，并确保筛选过程中每个靶基因对应的 sgRNA 具有足够代表性，需进行高通量测序（NGS），以深入评估筛选的稳健性9。 
		注：通过检测筛选前后 sgRNA 丰度的变化，并识别潜在的 sgRNA 脱靶整合或文库污染，可进一步提高 CRISPR 筛选的准确性和可靠性。这些第 0 天样本作为关键的阴性对照，需通过 PCR 扩增和 NGS 进行全面的质量评估，以实现两个关键目标：（1）确认必需基因的耗竭（表明文库具有充分代表性）；（2）证明非必需基因表达稳定（建立实验基线条件）9。</li>
		<li>确保文库覆盖度达到预期水平，以保证文库的多样性和代表性，避免筛选过程中的偏差。为测定感染效率，使用荧光成像评估感染效率，确保其满足实验要求。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 将辐射作为筛选条件的应用
<ol>
	<li>分组
	<ol>
		<li>将CRISPR感染的细胞密度调整至每毫升1 × 107个细胞，并将1 mL细胞悬液接种至每个15 cm培养皿中。在37 °C、5% CO2条件下培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>辐射处理
	<ol>
		<li>将细胞随机分为两组：处理组和对照组，每组6个培养皿。对处理组细胞施加适当剂量的辐射，对照组细胞不进行辐射处理，使其正常增殖。辐射处理后，在37 °C、5% CO2条件下继续培养7天。</li>
		<li>在第二周，再次对处理组细胞施加适当剂量的辐射，对照组细胞仍不进行辐射处理，使其继续正常增殖。放疗结束后，在37 °C、5% CO2条件下继续培养另外7天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 基因组提取与测序
<ol>
	<li>第14天提取
	<ol>
		<li>经过14天处理后，使用0.25%胰蛋白酶消化处理组和对照组的细胞，用含10%胎牛血清（FBS）的完全RPMI 1640培养基重悬，并标记为第14天-RT或第14天-NC。</li>
		<li>将细胞在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液；加入1 mL PBS重悬，再次在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。提取第14天的基因组DNA，并使用纳米滴紫外吸收光谱法检测DNA的浓度和纯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR扩增
	<ol>
		<li>准备相应序列的引物（见材料表），将其稀释至10 µM。将试剂加入无菌微量离心管中，配制成20 µL反应体系，于300 × g 离心5秒，充分混匀。根据扩增条件设置PCR仪参数，以获得PCR产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖凝胶电泳检测
	<ol>
		<li>准备凝胶制备板，用琼脂糖封住模具边缘，插入梳子，并根据样品DNA长度配制适当浓度的琼脂糖凝胶。</li>
		<li>准确称取一定量的琼脂糖粉末，加入适量电泳缓冲液，混匀后放入微波炉加热溶解。稍冷却后，加入适量核酸染料，轻轻混匀，缓慢倒入凝胶模具中，静置30分钟使其凝固。</li>
		<li>取出梳子，在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，直至液面覆盖凝胶。向DNA样品中加入适量上样缓冲液，混匀后用移液器缓慢加入样品孔中。</li>
		<li>根据DNA片段大小和琼脂糖凝胶浓度设置合适的电压。电泳结束后，小心取出凝胶，放入凝胶成像系统观察结果，检查PCR扩增是否成功。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Illumina测序
	<ol>
		<li>收集三组（第0天组、对照组和处理组）的基因组DNA，送至公司进行文库构建和Illumina测序。对测序结果进行生物信息学分析与可视化，以获得放疗敏感基因和放疗抵抗基因26。</li>
		<li>设置多次重复实验用于数据分析，并对实验结果进行统计学分析，以确保数据的一致性和可重复性27,28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序数据质量评估
	<ol>
		<li>对原始数据实施严格的过滤和质量控制机制，以确保测序信息的准确性5。基于测序错误率，采用特定的转换算法和评估碱基识别过程中出错概率的模型，计算每个核苷酸的Phred分数（Qphred）28。</li>
		<li>保持每个碱基位置的测序错误率低于1%（相当于Q30阈值），并确保至少80%的测序数据达到此Q30标准，以支持后续分析流程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据处理与样本水平质量控制 
	注：详细信息请参见已发表的文献29,30。
	<ol>
		<li>将测序数据中经过过滤的读段与sgRNA文库序列进行比对。报告比对统计信息，包括文库中完全匹配的sgRNA数量、sgRNA的平均丰度、未检测到的sgRNA数量，以及各单个样本中成功比对至sgRNA文库的读段比例。较高的比对率表示更高的覆盖度。</li>
		<li>计算每个样本中各基因（由不同sgRNA靶向）的读段富集情况。使用MAGeCK的&#34;中位数&#34;归一化方法对各样本中每个sgRNA的支持读段进行归一化。通过评估sgRNA读段数的分布、生成箱线图、进行主成分分析（PCA）以及构建相关性热图，实施样本水平的质量控制。</li>
		<li>假设sgRNA读段数服从泊松分布。通过箱线图展示不同组别的归一化sgRNA计数，以可视化样本内的整体数据分布，并比较组间分布差异。</li>
		<li>利用主成分分析（PCA）简化数据分析，反映主成分之间的差异及各成分内的变异速率，便于观察组内和组间变异。使用相关性热图展示样本之间的关系。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基础分析
	<ol>
		<li>在完成质量控制和初步数据处理后，进行组间差异sgRNA分析，识别必需基因。对相关基因进行功能富集分析30。根据MAGeCK或其他统计方法（如MLE）计算的稳健排序聚合（RRA）得分对必需基因进行排序，RRA得分越低表示重要性越高。</li>
		<li>使用R语言或其他编程语言对排序结果进行生物信息学分析，并通过GO和KEGG分析图对结果进行可视化30。通过ID映射或序列注释，将基因或蛋白质关联到相应的GO术语（分子功能、生物过程和细胞组分）。</li>
		<li>利用KEGG作为数据库，理解高级功能和生物系统，将鉴定出的基因目录与细胞、物种及生态系统层面的系统功能相连接。从GO和KEGG分析中选择前10或前20条通路，直观展示通路方向。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作为一种前沿的基因编辑技术，CRISPR 筛选已在科学研究领域引发深刻变革5。该技术源于 CRISPR-Cas9 系统，因其高效性和精确性，已成为研究基因功能不可或缺的工具9。CRISPR/Cas9 的工程化原理是设计并引入约含 20 个核苷酸的特异性 sgRNA，引导 Cas9 核酸酶精确定位并切割目标 DNA 序列，从而实现基因敲除、激活或抑制等基因编辑操作6。这一原理推动了高通量、可定制的 CRISPR 筛选技术的发展。通过构建包含大量 sgRNA 的文库，研究人员可同时对多个基因进行编辑和筛选，快速鉴定出与特定表型或疾病状态相关的基因。此外，CRISPR 筛选可在多种细胞类型、组织乃至完整生物体中开展实验，有助于更全面地理解基因功能及其作用机制。
随着技术的快速发展，CRISPR 筛选在多个领域展现出巨大的应用潜力。例如，CRISPR 筛选可帮助科学家发现新的药物靶点，从而加速药物研发进程。在疾病研究中，该技术揭示了疾病发病机制，为...

生物现象的研究本质上与细胞行为的研究密切相关，而细胞行为的研究又从根本上关联着基因组的探索。随着现代技术的不断发展，医学研究人员正逐步将注意力转向调控细胞行为 通过 基因编辑旨在提升多种疾病的治疗效果。在此领域，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术因其相对简便的应用而成为基因组编辑的革命性工具1CRISPR-Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和单导向 RNA（sgRNA）组成，sgRNA 可特异性识别并结合靶标 DNA 序列，引导 Cas9 核酸酶在该位置进行切割，从而导致基因组 DNA 产生双链断裂（DSB）。2,3,4此外，引入其他物质可导致基因组发生特异性的插入、缺失或突变，从而实现靶向基因编辑。
在功能基因组学研究中，RNA干扰（RNAi）筛选曾是用于开展大规模基因功能缺失实验、研究基因在癌症中作用的常用方法。RNAi技术通过特异性沉默目标基因来研究基因功能，帮助研究人员鉴定关键的致癌因子。然而，该技术受限于脱靶效应和基因敲低效率不完全的问题。脱靶效应可能导致非目标基因被意外沉默，从而影响实验结果的准确性和可靠性1,2。此外，某些基因的RNAi敲低效率较低，可能无法完全抑制目标基因的表达。相比之下，CRISPR筛选具有更高的特异性和效率3。该技术不仅能对特定基因进行精确编辑，还可实现全基因组范围的大规模筛选，为基因功能研究提供了强有力的支持。CRISPR筛选技术是一种基于CRISPR-Cas9系统的强大基因编辑工具，可用于高效筛选并揭示细胞中特定基因的未知功能5,6,7,8。研究人员批量设计针对特定基因或基因区域的sgRNA，并精确严谨地构建相应的sgRNA文库，确保其完整性和功能性9。随后将这些sgRNA文库包装至慢病毒颗粒中，用于高效感染宿主细胞。成功感染后，将感染的细胞置于研究人员自定义的筛选条件下进行培养。筛选完成后，提取筛选后细胞的基因组DNA，并保证其纯度和产量达到高标准。接着对感兴趣的sgRNA靶向区域进行PCR扩增，该过程可准确复制目标核酸片段3,9。最后对扩增的DNA片段进行高通量测序，从而实现对目标区域的全面且高效的分析，为研究基因的功能与行为提供重要信息4。
癌症作为一种复杂的疾病，对人类健康构成严峻威胁。全球范围内，研究人员和临床医生正共同努力，以揭示致癌的分子机制并开发新的治疗策略。国际间已建立多项合作，旨在加速将基础研究发现转化为临床应用，最终改善患者的治疗效果。Sasmal 等人提出了一种基于合成主客体系统的生物正交组装策略，用于精准靶向转移性癌细胞，该策略已显著帮助数十位科学家推进了医学技术的发展。他们的杰出研究工作具有高度创新性和独特见解，为科学界作出了有意义的贡献10。癌症的特征是基因组不稳定性所导致的紊乱状态，其根源在于DNA损伤应答的异常调控11,12,13,14。DNA损伤包括单核苷酸缺陷、单链断裂以及双链断裂（DSBs）。同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）在不同阶段参与双链断裂的修复过程15,16,17。在此基础上，放射治疗已成为一种可行的治疗手段，其利用高能射线（如X射线和γ射线）照射肿瘤组织，诱导肿瘤细胞产生DNA损伤，从而破坏其生长与增殖能力18。然而，在相当一部分癌症患者中，放疗并未达到预期疗效，这可能源于对邻近正常组织的损伤，以及肿瘤自身特性所带来的限制，例如对放疗的敏感性较低19,20,21。
理论上，任何细胞类型均可用于CRISPR筛选。然而，为在突变细胞群体中维持足够的代表性，需要大量的起始细胞。因此，丰度较低的细胞类型并不特别适用于全基因组范围的筛选。至于文库的选择，大多数文库针对每个靶基因包含3至6条gRNA，而在细胞群体中维持每条gRNA的分布均匀性至关重要。18由于特定gRNA的富集或耗竭可能导致表征丢失，从而引起结果分布不均。为解决这一问题，选择经过市场验证的商用CRISPR文库可能是更优的方案。20. 体外 使用同质性癌细胞系进行CRISPR筛选可能无法充分捕捉肿瘤的遗传和表观遗传异质性 体内 肿瘤。尽管 体外 筛选揭示了参与DNA损伤修复和辐射诱导自分泌信号通路的关键基因，但未能完全模拟肿瘤微环境，包括缺氧诱导的放射抗性通过 活性氧、代谢适应和自噬），免疫介导的旁分泌效应，以及细胞外基质依赖性细胞因子调节。在利用CRISPR筛选技术探索与辐射敏感性或抗性相关基因之前，必须仔细考虑这些因素。鉴于当前的治疗现状，迫切需要识别并深入研究与放射抗性和放射敏感性相关的因素，以有效提高放射治疗的疗效22鉴于CRISPR筛选在研究未知基因功能方面具有关键优势，本文提供了一种系统且详尽的全基因组CRISPR筛选技术，可高效鉴定放射敏感性和放射抗性基因。

<table><tbody><tr><td>150 mm 细胞和组织培养皿</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.</td><td>715011</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>35 mm 细胞和组织培养皿</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.</td><td>706011</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>A549 细胞系</td><td>ATCC</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8</td><td>上海碧云天生物技术股份有限公司</td><td>C0041</td><td>用于细胞活力检测</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-非依赖性培养基</td><td>PHCbi</td><td>MCO-50AIC</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Countess 3 FL 全自动细胞计数仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAF2001</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>LEICA</td><td>ebq 100-04</td><td>用于荧光显微观察</td></tr><tr><td>全基因组CRISPR慢病毒文库</td><td>上海欧易生物科技股份有限公司</td><td>H5070</td><td>用于慢病毒感染</td></tr><tr><td>MiniAmp plus PCR仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>C37835</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>NEST 细胞培养板，12孔</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.</td><td>712002</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>NEST 细胞培养板，6孔</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.</td><td>703002</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>NEST 细胞培养板，96孔</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.</td><td>701001</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>PCR 正向引物 (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)</td><td>北京奥科鼎盛生物科技有限公司</td><td>-</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>PCR 反向引物 (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)</td><td>北京奥科鼎盛生物科技有限公司</td><td>-</td><td>用于PCR扩增</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>上海碧云天生物技术股份有限公司</td><td>C0351</td><td>用于慢病毒感染</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>MCE</td><td>HY-K1057</td><td>用于慢病毒感染后筛选</td></tr><tr><td>RPMI 1640 细胞培养基</td><td>Gibco</td><td>23400-021</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>天根基因组DNA提取试剂盒</td><td>北京天根生化科技有限公司</td><td>DP304</td><td>用于基因组DNA提取</td></tr><tr><td>X射线粉末衍射仪</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>用于放射治疗</td></tr></tbody></table>

全基因组crispr筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

Genome-Wide CRISPR Screen for Unveiling Radiosensitive and Radioresistant Genes

CRISPR-Cas9 系统已被开发并改造为一种强大的基因组编辑工具。利用该技术，研究人员能够精确地在活细胞内对 DNA 序列进行切割、拼接，甚至重写。然而，CRISPR 筛选技术的应用远不止于基础实验。它在对抗遗传性疾病方面发挥着关键作用，可系统性地解析复杂的遗传图谱，帮助研究人员揭示生物学现象背后的分子机制，并使科学家能够识别和靶向癌症、囊性纤维化及镰状细胞贫血等疾病的根本病因。其中，癌症对医学界构成了严峻挑战，推动着根除疾病的持续努力。放射治疗作为一种传统疗法虽具疗效，但存在局限性：它在清除癌细胞的同时也会损伤健康组织，导致不良反应，降低患者生活质量。此外，并非所有癌细胞都对放疗有反应，部分细胞可能产生耐受性，从而加重病情。为应对这一问题，本研究引入了一种全面的全基因组 CRISPR 筛选技术，该技术可高效鉴定与放射敏感性和放射抗性相关的基因，进而推动癌症研究与治疗领域的发展。根据所述方案，研究人员在经照射处理的肺腺癌细胞中开展了全基因组范围的 CRISPR 筛选，成功鉴定了与放射抗性和放射敏感性相关的一系列基因。

肺癌是病死率最高的恶性肿瘤，是一种高度侵袭性且高发的疾病。以肺癌细胞系 A549 为例，在放射照射作为筛选条件的情况下开展全基因组 CRISPR 筛选，其示意图流程见图1。首先，通过克隆形成实验和 CCK8 实验检测 A549 细胞对不同剂量辐射的敏感性（图2）。在克隆形成实验中，2 Gy 组的克隆数为 140 ± 5.35，而 0 Gy 组为 303 ± 31.63；在 CCK-8 实验中，2 Gy 组的光密度（OD）值为 0.65 ± 0.05，而 0 Gy 组为 1.35 ± 0.08。为研究辐射敏感性和抗辐射相关的候选基因，选择 2 Gy（IC50）作为后续的照射剂量。对 A549 细胞使用不同浓度的嘌呤霉素处理，并在 72 小时后进行计数。检测发现 A549 细胞的嘌呤霉素最低致死浓度为 1 µM（图3）。以不同梯度的 MOI 值感染 A549 细胞，感染 72 小时后通过荧光显微镜观察感染效率，并在嘌呤霉素处理前后分别计数，获得感染效率约为 0.3...

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

CRISPR-Cas9 系统已被开发并重新利用为一种强大的基因组编辑工具。通过利用该技术，研究人员能够精确地……

本研究聚焦于全基因组CRISPR筛选与放射治疗。我们提供了一种利用全基因组CRISPR筛选技术，在肺癌细胞经辐射处理后鉴定放射敏感性和放射抵抗性基因的实验方案。当前实验面临的挑战包括脱靶效应，这源于基因组的高度复杂性以及探索潜在机制时可能遇到的困难。与传统筛选方法相比，CRISPR能够实现永久性的遗传修饰，并具有更高的精确度，因此在功能基因组学研究和靶点发现中尤为有价值。未来，我们的团队将致力于开展体内CRISPR筛选研究，以解决本研究所遗留的问题，并将持续推进CRISPR技术的优化工作。[旁白] 首先，将贴壁细胞的密度调整为每毫升5 × 10⁵个细胞。使用移液器将2毫升细胞悬液分别加入每个3.5厘米的培养皿中，用于不同剂量的辐射处理。将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中，过夜培养。使用记号笔将每个3.5厘米的培养皿编号为1至5。使用辐射源分别对第2至第5号培养皿施加2、4、6和8戈瑞（Gy）的辐射剂量。将经辐射处理的细胞密度调整为每毫升1 × 10⁵个细胞。以每孔10微升接种至六孔板，相当于每100微升含1000个细胞，每个辐射剂量设三个重复。再以每孔30微升接种至96孔板，相当于每100微升含3000个细胞，每个辐射剂量设五个重复。接下来，将CCK-8试剂与不含FBS的RPMI 1640培养基按1:9的比例混合。将混合液加入96孔板中，并在避光条件下孵育1小时。然后使用酶标仪在450纳米波长处测定吸光度。开始感染过程时，设置慢病毒浓度从0至800单位/毫升的对数梯度。将相应体积的慢病毒加入每皿含2微升聚凝胺（polybrene）的溶液中，室温平衡5分钟。缓慢将慢病毒与聚凝胺的混合液滴加至各孔中。将亲本细胞密度调整为每毫升3 × 10⁵个细胞，并将1毫升接种至12孔板的每孔中。向各孔中加入不同浓度梯度的嘌呤霉素（puromycin）。感染72小时后，将每孔中的培养基更换为含最低致死浓度嘌呤霉素的完全培养基。根据存活细胞数量计算每孔的感染复数（MOI）。将贴壁细胞密度调整为每毫升1 × 10⁷个细胞。按感染复数0.3的比例将慢病毒加入含每皿30微升聚凝胺的溶液中，室温平衡5分钟。缓慢将慢病毒与聚凝胺的混合液滴加至15厘米培养皿中。充分混匀后，在37°C、含5%二氧化碳的培养箱中过夜培养。感染后第二天，吸除培养皿中的培养基，并更换为15毫升含10% FBS的RPMI 1640完全培养基。对未感染的亲本细胞进行相同处理作为阴性对照，并继续培养72小时。现在，使用0.25%胰蛋白酶消化一个15厘米培养皿中的细胞。将细胞重悬于含10% PBS的RPMI 1640完全培养基中，并计数细胞数量。在提取第0天的基因组DNA后，使用NanoDrop紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。对处理组细胞施加适当剂量的辐射，对照组细胞不进行辐射处理，使其正常增殖。处理14天后，使用0.25%胰蛋白酶消化处理组和对照组的细胞。将细胞重悬于含10% FBS的RPMI 1640完全培养基中。在300 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于1毫升PBS中。重复一次离心步骤后，从沉淀中提取第14天的基因组DNA，并测定DNA浓度。接下来，准备所需的引物并稀释至10微摩尔。在加入各组分建立20微升反应体系后，将离心管在300 × g短暂离心5秒。进行琼脂糖凝胶电泳时，制备凝胶，取出梳子，并向电泳槽中加入足够缓冲液以覆盖凝胶。向DNA样品中加入上样缓冲液并充分混匀。最后，将混合液加入加样孔中，开始电泳。14天后的克隆形成实验显示，与0戈瑞组相比，暴露于2戈瑞辐射显著减少了存活克隆的数量。CCK-8检测表明，在2戈瑞剂量下细胞活力显著下降，且随着辐射剂量增加进一步降低。经72小时不同浓度嘌呤霉素处理后发现，1微摩尔为清除A549细胞所需的最低浓度。PCR验证结果显示在231个碱基对处出现清晰条带，证实CRISPR文库中sgRNA序列长度符合预期。测序分析显示约60%的读段成功比对至参考基因组。sgRNA读段计数符合泊松分布，与全基因组筛选的理论预期一致。主成分分析（PCA）和热图分析显示组间变异性高而组内变异低，验证了实验的重复性。基因本体（GO）分析在前15个结果中识别出DNA损伤应答为最显著富集的通路。

genome-wide-crispr-screen-for-unveiling-radiosensitive-radioresistant

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

用于揭示放射敏感和放射抗性基因的全基因组 CRISPR 筛选

本视频介绍了一种用于鉴定基因组经CRISPR-Cas9技术修饰的转基因果蝇（Drosophila）的筛选方法。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，彻底改变了科学家操控生物体基因组的方式。在本示例方案中，我们将学习如何鉴定通过CRISPR技术产生的突变体，其中一段转录激活序列的插入取代了branchless（bnl）基因的第一个外显子，从而构建出针对bnl基因的特异性驱动品系bnl-LexA。...

筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

CRISPR/sgRNA 文库已应用于研究蛋白质编码基因。然而，sgRNA 文库在揭示 CTCF 边界在基因调控中功能方面的可行性仍尚未探索。本文中，我们描述了一种针对 HOX 位点的特异性 sgRNA 文库，以阐明 CTCF 边界在 HOX...

HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

本文描述了一种基于细胞的全基因组筛选方法，用于鉴定细胞外受体-配体相互作用。...

利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

本文介绍一种快速、直接的体内CRISPR/Cas9筛选方法，该方法通过超声引导下的子宫内胚胎慢病毒注射，同时评估多个基因在免疫功能健全小鼠皮肤和口腔中的功能。...

利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

CRISPR等技术面临的一个重大障碍是脱靶效应，其可能破坏重要基因。“环化用于 体外...

使用CIRCLE-Seq检测基因编辑脱靶效应

本文描述了一种应用于 体外 健康供体嵌合抗原受体T细胞中用于耗竭模型的全基因组CRISPR敲除筛选...

在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

学习全基因组CRISPR/Cas9筛选技术，用于鉴定肺癌细胞中的放射敏感和放射抗性基因。该方法通过慢病毒转导和CCK-8细胞活力检测，揭示DNA损伤应答通路，为克服肿瘤放疗耐药性提供功能基因组学研究基础。

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

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