全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

本研究聚焦于全基因组CRISPR筛选与放射治疗。我们提供了一种利用全基因组CRISPR筛选技术，在肺癌细胞经辐射处理后鉴定放射敏感性和放射抵抗性基因的实验方案。当前实验面临的挑战包括脱靶效应，这源于基因组的高度复杂性以及探索潜在机制时可能遇到的困难。与传统筛选方法相比，CRISPR能够实现永久性的遗传修饰，并具有更高的精确度，因此在功能基因组学研究和靶点发现中尤为有价值。未来，我们的团队将致力于开展体内CRISPR筛选研究，以解决本研究所遗留的问题，并将持续推进CRISPR技术的优化工作。

[旁白] 首先，将贴壁细胞的密度调整为每毫升5 × 10⁵个细胞。使用移液器将2毫升细胞悬液分别加入每个3.5厘米的培养皿中，用于不同剂量的辐射处理。将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中，过夜培养。使用记号笔将每个3.5厘米的培养皿编号为1至5。使用辐射源分别对第2至第5号培养皿施加2、4、6和8戈瑞（Gy）的辐射剂量。将经辐射处理的细胞密度调整为每毫升1 × 10⁵个细胞。以每孔10微升接种至六孔板，相当于每100微升含1000个细胞，每个辐射剂量设三个重复。再以每孔30微升接种至96孔板，相当于每100微升含3000个细胞，每个辐射剂量设五个重复。接下来，将CCK-8试剂与不含FBS的RPMI 1640培养基按1:9的比例混合。将混合液加入96孔板中，并在避光条件下孵育1小时。然后使用酶标仪在450纳米波长处测定吸光度。开始感染过程时，设置慢病毒浓度从0至800单位/毫升的对数梯度。将相应体积的慢病毒加入每皿含2微升聚凝胺（polybrene）的溶液中，室温平衡5分钟。缓慢将慢病毒与聚凝胺的混合液滴加至各孔中。将亲本细胞密度调整为每毫升3 × 10⁵个细胞，并将1毫升接种至12孔板的每孔中。向各孔中加入不同浓度梯度的嘌呤霉素（puromycin）。感染72小时后，将每孔中的培养基更换为含最低致死浓度嘌呤霉素的完全培养基。根据存活细胞数量计算每孔的感染复数（MOI）。将贴壁细胞密度调整为每毫升1 × 10⁷个细胞。按感染复数0.3的比例将慢病毒加入含每皿30微升聚凝胺的溶液中，室温平衡5分钟。缓慢将慢病毒与聚凝胺的混合液滴加至15厘米培养皿中。充分混匀后，在37°C、含5%二氧化碳的培养箱中过夜培养。感染后第二天，吸除培养皿中的培养基，并更换为15毫升含10% FBS的RPMI 1640完全培养基。对未感染的亲本细胞进行相同处理作为阴性对照，并继续培养72小时。现在，使用0.25%胰蛋白酶消化一个15厘米培养皿中的细胞。将细胞重悬于含10% PBS的RPMI 1640完全培养基中，并计数细胞数量。在提取第0天的基因组DNA后，使用NanoDrop紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。对处理组细胞施加适当剂量的辐射，对照组细胞不进行辐射处理，使其正常增殖。处理14天后，使用0.25%胰蛋白酶消化处理组和对照组的细胞。将细胞重悬于含10% FBS的RPMI 1640完全培养基中。在300 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于1毫升PBS中。重复一次离心步骤后，从沉淀中提取第14天的基因组DNA，并测定DNA浓度。接下来，准备所需的引物并稀释至10微摩尔。在加入各组分建立20微升反应体系后，将离心管在300 × g短暂离心5秒。进行琼脂糖凝胶电泳时，制备凝胶，取出梳子，并向电泳槽中加入足够缓冲液以覆盖凝胶。向DNA样品中加入上样缓冲液并充分混匀。最后，将混合液加入加样孔中，开始电泳。14天后的克隆形成实验显示，与0戈瑞组相比，暴露于2戈瑞辐射显著减少了存活克隆的数量。CCK-8检测表明，在2戈瑞剂量下细胞活力显著下降，且随着辐射剂量增加进一步降低。经72小时不同浓度嘌呤霉素处理后发现，1微摩尔为清除A549细胞所需的最低浓度。PCR验证结果显示在231个碱基对处出现清晰条带，证实CRISPR文库中sgRNA序列长度符合预期。测序分析显示约60%的读段成功比对至参考基因组。sgRNA读段计数符合泊松分布，与全基因组筛选的理论预期一致。主成分分析（PCA）和热图分析显示组间变异性高而组内变异低，验证了实验的重复性。基因本体（GO）分析在前15个结果中识别出DNA损伤应答为最显著富集的通路。