一种慢性脑功能成像开颅手术过程

成像技术在脑功能研究中变得越来越重要。其中，双光子激光显微镜已成为一种非常有用的方法，因为它允许研究活体 anta 大脑并进行适当的准备。该技术允许从数分钟到数月长期观察同一皮质区域。

在本视频中，我们展示了使用两种照片显微镜对大脑进行慢性体内成像的准备工作。Janelia Farm 的霍华德休斯医学研究所研究员 Carl Voda 博士最初开创了我们今天将演示的颅窗制备方法。嗨，Ricardo 必须来自加州大学洛杉矶分校神经病学系 Carlos Porter Cayo 的实验室。

今天我们将向您展示为慢性体内成像创建颅窗的程序。这种准备工作非常有用，因为它允许人们使用光子激光显微镜对大脑深处进行成像。所以让我们开始吧。

在开始手术之前，用 isof fluor 麻醉小鼠。4% 用于诱导，1 点半到 2% 用于手术，使用 I-A-C-U-C 批准的程序，重要的是使用尾巴和/或脚趾捏，以确保动物完全镇静。使用啮齿动物修剪器，从脖子后部到眼睛的毛发被剃光。

剃须后，将鼠标放在立体定位框架上，放在 37 摄氏度的水循环毯上，使用耳杆牢固地固定头部。然后涂抹眼膏以防止动物的眼睛干燥。接下来，皮下注射地塞米松，每公斤 0.2 毫克和卡洛芬每公斤 5 毫克。

为了分别防止大脑肿胀和/或炎症反应。在开始手术之前，请务必用 3 次交替的 70% 酒精和 Betadine 棉签擦拭皮肤，对手术区域进行消毒。所有手术器械均已使用喷洒了乙醇的剪刀使用玻璃珠灭菌器进行预灭菌。

去除颅骨顶部的皮肤，从沿头部底部的水平切口开始，然后在嘴部方向进行两次切割，几乎到达眼睑。然后是两个在中线汇合的斜切口。此时，将一滴利多卡因和肾上腺素溶液滴在骨膜上，以避免过度出血或手术刀疼痛，骨膜缩回颅骨边缘。

脖子后面的肌肉组织也轻轻缩回。然后用手术刀轻轻刮擦整个颅骨的暴露区域，以形成干燥的表面。这非常重要，因为它可以让胶水在以后涂抹时更好地粘附。

选择成像站点后，就可以先创建颅窗了。用气动牙钻轻轻画出一个直径约 4 毫米的圆圈。稍微钻孔后，将利多卡因肾上腺素溶液再次涂抹在颅骨表面。

当留下一层非常薄的骨头（通常是 1 个鼻子）时，就会停止钻孔。通过轻轻推动他们的开颅手术中心来感受它在一滴盐水下是如何让位的，并利用骨小梁来达到这个阶段。骨骼的海绵状结构。

开颅手术用非常细的尖端镊子从颅骨上抬起。生理盐水很重要，因为它有助于抬起颅骨并防止硬脑膜出血。接下来，将先前浸泡在盐水中的凝胶泡沫涂抹在硬脑膜上，以阻止去除颅骨时有时会发生的任何小出血。

干燥硬脑膜表面并确保没有渗出后，将无菌的 5 毫米玻璃盖玻片轻轻放在硬脑膜上。将一滴基于氰基丙烯酸酯的胶水涂抹在颅骨的对侧半球。在针的帮助下，将胶水轻轻地涂抹在窗户周围，小心不要将其放在玻璃下。

胶水现在可以薄薄地涂在颅骨的整个表面。一旦胶水干燥，牙科丙烯酸树脂就被混合并涂在整个颅骨表面，还覆盖了盖玻片的一个小边缘以固定它。固定盖玻片后，用牙科丙烯酸在窗户周围做一个小井。

钛棒也嵌入到牙科丙烯酸中。此杆稍后将用于将鼠标牢固地连接到显微镜的载物台上。对于成像，重要的是要确保杆条水平，使其与颅窗平行。

在棒下放一张纸可以让棒保持水平，同时亚克力变硬，让牙科亚克力固化或硬化 10 分钟，此时钛棒已经固定到位。然后将动物放在温暖的笼子里，直到它恢复。从麻醉中恢复后，可以在同一天对动物进行成像。

这部电影展示了一堆 160 张图像，这些图像是用我们定制的双光子显微镜以 5 微米的间隔拍摄的，通过放置在三个月大的 GFPM 小鼠体感皮层上的颅窗拍摄。这种转基因小鼠系在一小部分神经元中表达 GFP。在第 5 层和第 2 层第 3 层中，图像是使用 40 倍水浸物镜拍摄的，数值孔径为 0.8，激发波长为 910 纳米。

在更浅表的图像中，很容易识别副金属细胞顶端树突的树突乔木。每个神经元树突的顶端簇收敛到一个大的顶端树突上。也可以看到较小的斜树突从这个主要的顶端树突上脱落，穿过视野也是显而易见的。

这是一堆 12 张图像，使用相同的 40 倍物镜以更高的放大倍率拍摄每 1.5 微米，浅表树突以足以分辨单个树突棘的高分辨率显示。我们刚刚向您展示了如何使用照片显微镜为大脑的慢性成像进行颅窗准备。这是一种非常强大的大脑研究方法，因为它允许你研究活着的大脑的结构和功能，不仅在单个想象中，而且在几个月内通过多个想象来长期研究。

颅窗制备的另一个优点是可以成像大视野，这使得在毫米跨度内对大型结构（例如整个动作或印式心轴）进行成像成为可能。进行此程序时，请务必记住在最干净、更无菌的条件下工作，并保持手部非常稳定。好了，就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。