研究髓系细胞与CAR T细胞之间的相互作用 体外 和 在体 内

本研究提供了简化的体外和体内模型，用于理解在套细胞淋巴瘤背景下，人源免疫抑制性巨噬细胞对CA 19抗肿瘤活性的影响。目前研究人源巨噬细胞和单核细胞最常用的体内模型是将造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内。将人源造血干细胞移植至免疫缺陷小鼠以研究小鼠体内人源髓系细胞的方法，可能耗时较长且成本较高。

移植效率也可能受限。我们建立了更为简化的体外和体内模型，用于研究人巨噬细胞、CAR-T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。该模型也可用于测试其他靶向巨噬细胞的免疫疗法。

首先，在4摄氏度条件下，以300×g离心1000万个人类经典单核细胞5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于培养基中，调整终浓度为每毫升100万个细胞。向细胞悬液中加入人重组GM-CSF，使其终浓度达到每毫升10纳克，并充分混匀。

将单核细胞转移至T25培养瓶中，在37摄氏度下孵育七天。第七天时，在冰上每10分钟剧烈吹打细胞一次，并在显微镜下观察，直至大多数巨噬细胞脱落。将脱落的细胞转移至预冷的15毫升锥形管中，置于冰上。

然后，用预冷的 PBS 洗涤细胞，以松动残留的细胞，并将其收集至锥形管中。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，随后在 4°C 条件下以 300g 离心 5 分钟。吸除上清液，再用 5 mL 预冷的 PBS 洗涤并重悬细胞沉淀。

再次离心试管并吸除上清液后，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬最终的细胞沉淀，调整细胞浓度至每毫升2000万个细胞。将悬液转移至1.5毫升微量离心管中，置于冰上保存。接着，将已制备的1500万个荧光素酶阳性的JeKo细胞转移至15毫升锥形管中。

离心JeKo细胞后，吸除上清液。将沉淀重悬于预冷的PBS中，调整细胞浓度至每毫升4000万个细胞。随后，在一个新的1.5毫升微量离心管中，等体积混合巨噬细胞悬液与肿瘤细胞悬液。

加入等体积的溶解基底膜基质，冰上充分混匀。作为对照，在新的微量离心管中，将剩余的JeKo细胞与等体积的PBS混合，再加入等体积的溶解基底膜基质，冰上混匀。

将小鼠麻醉后，将其置于带有鼻罩的加热平台上。在小鼠双眼涂抹眼用软膏，以防止角膜损伤。剃除每只小鼠右侧 flank 部的毛发，暴露皮肤。

将100微升JeKo巨噬细胞混合物装入0.5毫升注射器中，并排出气泡。轻轻提起暴露的皮肤，将针头插入抬起的皮肤区域，同时用手指对注射部位施加压力。缓慢将细胞注入皮下层，然后轻柔地拔出针头。

为了评估免疫抑制性巨噬细胞在体内的影响，通过生物发光成像技术在NSG小鼠中追踪肿瘤负荷的进展，这些小鼠仅移植了JeKo细胞，或同时移植了分化后的巨噬细胞。分化后的巨噬细胞显著加速了体内肿瘤的进展，表现为到第17天时，联合移植小鼠的肿瘤负荷明显高于仅移植JeKo细胞的小鼠。