G-四链体 DNA 聚合酶动力学的单分子荧光可视化
April 4th, 2025
该方案概述了一种基于荧光显微镜的单分子 DNA 复制测定，能够实时可视化 DNA 聚合酶与障碍物（如 G 四链体结构）之间的相互作用。
我们的工作重点是开发和使用单分子方法来研究复杂生物系统中的动力学。特别是，我们有兴趣了解 DNA 聚合酶在遇到障碍时的行为，在本例中为 G-四链体。我们开发了一种基于荧光可视化的单分子方法，使我们能够看到单个 DNA 聚合酶在遇到 G-四链体时的行为。
通过我们的检测，我们已经确定了 DNA 聚合酶 delta 在撞击 G-四链体时以前未表征的交换途径，其中聚合酶会脱落，新的聚合酶会重新结合。随着我们方案的开发，我们终于回答了以下问题:不同的 DNA 聚合酶在遇到 G-四链体时表现如何，正如我们可以实时看到动力学和力学如何随时间变化一样？首先，从真空中取出功能化的盖玻片，并将其放在部分装满水的微管架上，以创造一个潮湿的环境。
将 100 微升封闭缓冲液移液到试管中，然后加入 25 微升 NeutrAvidin 溶液并充分混合。将溶液涂抹在盖玻片表面，并在潮湿箱中室温孵育 15 分钟。接下来，用水清洗盖玻片，然后用氮气干燥。
将定制的聚二甲基硅氧烷块放在流通池支架内的盖玻片上。将聚乙烯管插入流通池的孔中。现在，将 1 毫升等分试样的 Tween 封闭缓冲液、500 微升洗涤缓冲液和复制缓冲液加热至 40 摄氏度 15 分钟，以从溶液中释放气体。
在真空室中以低于大气压 800 毫巴的压力再脱气 15 分钟。在物镜上滴一滴油。取构建的流通池并将其放在显微镜载物台上。
然后，抬高物镜以符合盖玻片。将入口管插入脱气的 Tween 封闭缓冲液中，并将出口连接到注射泵。然后，向后拉注射器，将 Tween 封闭缓冲液通过管道吸入通道。
以每分钟 100 微升的速率将 200 微升脱气洗涤缓冲液流入通道，以冲洗掉 Tween 封闭缓冲液。现在，在 500 微升复制缓冲液中将 DNA 模板溶液稀释至 0.5 皮摩尔。让 150 微升溶液以每分钟 10 微升的速度流入通道。
在样品平面上使用 647 纳米激光以每平方厘米约 900 毫瓦的功率照射样品，以观察单个 DNA 模板。一旦可见足够密度的斑点，就流入新鲜的复制缓冲液中以洗掉多余的 DNA。移动到新的视野并捕获 DNA 图像，以确定标记的聚合酶和 DNA 底物之间的共定位程度。
完成后，增加激光功率以光漂白剩余的斑点。接下来，在复制缓冲液中制备含有二硫苏糖醇、dNTP 和荧光探针的聚合酶溶液。以每分钟 5 微升的速率将 100 微升聚合酶溶液流入通道。
一旦样品聚焦并调整了总内反射荧光角度，在样品平面上将 647 纳米激光器的激光功率设置为每平方厘米约 900 毫瓦。在所需的时间长度内开始对视野进行成像。G-四链体序列阻断了聚合酶 δ 合成，如页面凝胶中存在 60 个核苷酸条带所示，而没有 G-四链体的对照底物产生了 100 个核苷酸条带。
单分子荧光显微镜证实，聚合酶 delta 在 G 四链体衬底上的停留时间更短，为 6 秒或负 2 秒，而对照衬底的停留时间为 11 秒或负 3 秒。与对照相比，G-四链体底物上的聚合酶 δ 结合事件的数量显著更高，表明由于合成阻断而存在多个结合和解结合循环。
概述
本研究调查了DNA聚合酶在遇到G-四链体结构时的动力学，这些结构在DNA复制过程中构成了重大障碍。通过单分子荧光显微镜，研究可视化了个别DNA聚合酶delta与这些复杂结构的相互作用，揭示了一条以前未被表征的交换途径。
关键研究组成部分
研究领域
- DNA复制动力学
- 单分子方法
- 显微技术
背景
- DNA聚合酶在复制中的作用
- G-四链体结构对聚合酶活性的影响
- 实时可视化在生物过程中的重要性
使用的方法
- 基于荧光显微镜的检测
- 单分子DNA复制检测
- 包含流动池和激光照明的定制实验设置
主要结果
- 在遇到G-四链体时，识别出了DNA聚合酶delta的一条新交换途径
- 在G-四链体底物上观察到的停留时间比对照组更短
- 由于合成阻碍，建议存在多次结合和解离循环
结论
- 本研究展示了DNA聚合酶对复制障碍的复杂行为
- 研究结果增强了对DNA复制机制的理解，并有助于未来的遗传学研究
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence visualization of DNA polymerase dynamics at G-quadruplexes addresses a critical challenge in understanding replication fidelity and genome stability. This method enables direct observation of polymerase behavior at DNA obstacles, informing mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery. The approach supports portfolio decisions by clarifying how replication machinery responds to complex DNA structures relevant to disease and therapeutic targeting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of DNA polymerase response to G-quadruplex roadblocks.
- Clarifies mechanistic pathways underlying replication stalling and exchange events.
- Supports functional target validation for proteins involved in genome maintenance.
- Improves predictive confidence in selecting targets affected by DNA secondary structures.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of quantitative single-molecule assays for polymerase activity.
- Enables reproducible measurement of binding kinetics and dwell times at DNA obstacles.
- Supports assay standardization for evaluating protein-DNA interactions under defined conditions.
- Prepares validated systems for downstream screening of modulators affecting polymerase dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Provides mechanistic insight into replication stress relevant to disease models.
- Aligns with translational biomarker strategies by linking polymerase behavior to genomic instability.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation of genome maintenance targets.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates modulating DNA replication fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This single-molecule fluorescence method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on polymerase stalling and exchange at G-quadruplexes.
- Screening: Provides quantitative readouts of binding events and dwell times for assay readiness.
- Analytics: Delivers statistical outputs on polymerase kinetics for condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular mechanisms to disease-relevant replication stress models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DNA-protein interactions at single-molecule resolution.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in replication biology.
- Operational Value: Standardizes single-molecule assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying target engagement at DNA obstacles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy and microfluidic assay design.
- Demands specialized instrumentation for real-time imaging and quantitative analysis.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data interpretation.
- May require adaptation for different DNA substrates or protein targets.
- Throughput and scalability are limited by imaging and analysis capacity.
