单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

我们的研究致力于开发并应用单分子方法，以研究复杂生物系统中的动态过程。特别是，我们关注DNA聚合酶在遇到障碍物（在此为G-四链体）时的行为方式。我们已建立了一种基于荧光可视化的单分子方法，能够直接观察单个DNA聚合酶在遇到G-四链体时的行为。

通过我们的检测方法，我们发现了一条此前未被表征的DNA聚合酶δ在遇到G-四链体时的交换途径：该聚合酶会从模板上解离，随后一个新的聚合酶重新结合。借助我们所建立的实验方案，我们最终回答了一个问题：不同的DNA聚合酶在遇到G-四链体时会如何表现？因为我们能够实时观察其动力学和机械特性随时间发生的变化。实验开始时，从真空环境中取出一张功能化的盖玻片，将其放置于部分装有水的微型离心管架上，以形成一个湿润的环境。

用移液器将100微升封闭缓冲液加入离心管中，然后加入25微升NeutrAvidin溶液，充分混匀。将该溶液均匀涂布于盖玻片表面，置于湿盒中室温孵育15分钟。随后，用清水洗涤盖玻片，再用氮气吹干。

将定制的聚二甲基硅氧烷块放置于流动池支架内的盖玻片上。将聚乙烯管插入流动池的孔中。现在，将1毫升吐温封闭缓冲液、500微升洗涤缓冲液和复制缓冲液分别加热至40摄氏度，持续15分钟，以释放溶液中的气体。

将溶液置于真空室中，在低于大气压800毫巴的条件下继续脱气15分钟。在物镜上滴加一滴油。取组装好的流动池，将其放置在显微镜载物台上。

然后，升高物镜使其接触盖玻片。将进样管插入脱气的Tween封闭缓冲液中，并将出口连接至注射泵。接着，回拉注射器，使Tween封闭缓冲液流经管路进入通道。

以每分钟100微升的流速将200微升脱气洗涤缓冲液注入通道，以冲洗掉Tween封闭缓冲液。现在，将DNA模板溶液用500微升复制缓冲液稀释至0.5皮摩尔。让150微升该溶液以每分钟10微升的流速流入通道。

使用647纳米激光在样品平面上以约900毫瓦/平方厘米的功率照射样品，以观察单个DNA模板。当观察到足够密度的荧光点时，引入新鲜的复制缓冲液以洗去多余的DNA。切换至新的视野，拍摄DNA图像，以确定标记的聚合酶与DNA底物之间的共定位程度。

完成后，提高激光功率以漂白剩余的荧光点。接着，在复制缓冲液中配制含有二硫苏糖醇、脱氧核苷三磷酸以及荧光探针的聚合酶溶液。以每分钟5微升的流速，将100微升聚合酶溶液注入通道中。

当样本处于焦点位置且已调整好全内反射荧光角度后，在样本平面将647纳米激光器的激光功率设置为约900毫瓦每平方厘米。开始对视野进行所需时长的成像。G-四链体序列阻断了DNA聚合酶δ的合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示为60个核苷酸的条带，而无G-四链体的对照底物则产生100个核苷酸的条带。

单分子荧光显微镜证实，与对照底物（停留时间为11±3秒）相比，DNA聚合酶δ在G-四链体底物上的停留时间较短，为6±2秒。DNA聚合酶δ在G-四链体底物上的结合事件数量显著高于对照组，提示由于合成受阻，发生了多次结合与解离循环。