Name: 在体内2光子层钙成像对小鼠的2 / 3 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学习使用双光子钙成像技术在小鼠大脑皮层中进行活体神经元网络动态研究。该方法通过植入颅窗和注射荧光钙染料，实现对大量神经元活动的高分辨率同步记录，为理解神经微环路功能提供重要工具。

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我们感谢 Olga Garaschuk 在优化钙指示剂批量负载方面的有益讨论。

<ol>
<li>配制荧光钙离子指示剂溶液。我们使用乙酰氧基甲酯染料（简称 AM 染料），这类染料在细胞外注射后可被细胞摄取。通常使用浓度为 1 mM 的 Oregon-Green BAPTA-1 AM 或 Fluo-4 AM。AM 染料可从 Invitrogen 公司购得，包装为 50 微克/瓶。首先配制 20% 的 Pluronic F-127 DMSO 溶液，每天使用前加热至澄清。将钙指示剂溶解于 20% Pluronic F-127/DMSO 溶液中，避光孵育 15–20 分钟，使其终浓度为 10 mM。然后将该溶液稀释至 1 mM，稀释液的成分为（单位：mM）：150 NaCl、2.5 KCl、10 Hepes，pH 7.4。此外，通常加入 100 µM Sulforhodamine 101，用于标记星形胶质细胞并在注射过程中可视化移液管。注射前使用 0.49 微米离心滤器对溶液进行过滤（Stosiek et al., 2003；Garaschuk et al., 2006）。 </li>
<li>在待成像区域上方植入颅窗。我们已经 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">在 JoVE 中描述了一般方法</a>，但钙染料注射需注意以下修改： 在目标皮层区域制作一个直径为2 mm的较小颅骨开窗，操作时需格外小心，避免损伤下方的硬脑膜。将盖玻片固定于颅骨开窗上方，但仅部分覆盖开窗区域，在开窗边缘与玻璃盖玻片之间留出微小间隙，以便移液管能够以倾斜角度进入皮层。注射前，用牙科水泥在颅骨开窗周围制作一个浅井结构，该浅井应向头端适当延伸，且深度足够浅，以允许微移液管插入进行注射。 </li>
<li>将小鼠转移至显微镜载物台，并固定头部，如我们所示 <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">血流成像视频</a>. </li>
<li>使用拉针仪将玻璃微电极移液管拉制成尖端直径为2-4兆欧电阻的规格。使用微量注射器将钙离子指示剂染料混合物加载到玻璃移液管中。利用显微操作器，在4倍物镜下将微移液管轻柔地降至脑表面，随后在40倍物镜下进行精细定位。选择合适的注射位点，确保上方无或仅有极少血管，以避免影响成像。通过双光子显微镜观察移液管尖端，并缓慢将其推进至硬脑膜下约200微米的皮层深度。然后使用Picospritzer以10 psi压力注射染料混合物1分钟。通常进行2至4次AM钙指示剂染料混合物的注射，各注射点之间空间间隔约200-300微米。这种略微重叠的大体积加载方式可确保约600 × 600微米范围的区域被充分染色，适用于钙成像。注射AM染料混合物后1小时开始成像，以允许染料充分扩散并被神经元摄取。

关键词：玻璃微电极移液管，钙离子指示剂，AM染料，双光子显微镜，压力注射，Picospritzer，皮层成像，神经元活动，钙成像，微量注射 </li>
<li>使用自制的双光子显微镜进行活体双光子成像，该系统配备Chameleon钛宝石激光器（调谐至800–880 nm）和Cambridge Technology公司生产的检流计镜。图像采集采用Karel Svoboda实验室开发的ScanImage软件（Pologruto等，2003）。样品处的激光功率通常远低于70 mW。全视野图像使用Olympus 20倍（0.95 NA）或40倍（0.8 NA）物镜获取，成像速度为每秒1.95至15.63帧（分辨率从512 × 256像素到256 × 64像素）。线扫描以500 Hz频率采集。成像过程中，动物维持在低浓度异氟烷麻醉（0.6%–0.9%）状态下，并使用Harvard Apparatus公司生产的温控装置保持体温在37°C。操作中需尽量使动物呼吸频率接近每分钟100次。该麻醉水平为能够固定动物体位的最低剂量，同时仍允许记录自发神经活动。 </li>
</ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

与电生理记录相比，该方法的优势在于侵入性更小，能够记录密集神经元网络中的活动。进行此操作时，需特别注意在实施开颅手术时应格外小心，避免损伤硬脑膜。即使少量的硬膜下出血也会严重干扰成像效果。

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 in DMSO</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>离心滤膜（0.45 微米）</td><td>试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体内进行双光子钙成像，是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。该方法包括植入颅窗、注射可被大量神经元摄取的荧光钙离子指示剂染料，并最终利用体内双光子显微镜通过时间序列钙成像记录神经元活动。共注射星形胶质细胞特异性染料可将神经元与星形胶质细胞区分开来。该技术也可在特定神经元亚群表达荧光分子的小鼠中实施，以更深入地研究不同细胞群体之间的网络相互作用。

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。

为了理解新皮层中微环路的网络动态，同时记录大量神经元的活动至关重要。

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在活体中，钙成像技术是唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。该方法包括植入颅窗、注射一种可被大量神经元摄取的荧光钙染料，最后通过延时钙成像记录神经元的活动。大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院神经病学系Carlos Portera-Caio实验室的Payman Go。在此前的视频中，我们的实验室已演示了在小鼠中进行开颅手术及双光子血流成像的操作流程。今天我们将向您展示一种在小鼠体内进行双光子钙成像的操作流程。在开始之前，首先需要配制染料注射溶液。首先，配制荧光钙离子指示剂溶液。我们使用的是乙酰甲酯染料，简称 AM 染料。这类染料在细胞外注射后可被细胞摄取，我们通常使用浓度为 1 毫摩尔的 Oregon Green BAPTA-1 AM 或 Fluo-4 AM。首先配制20%的Onic F1 27溶液。在DMSO中，每天使用前将其加热至澄清。将钙离子指示剂溶解于20% Onic F1 27 DMSO溶液中，15至20分钟，使其浓度达到10毫摩尔。随后，我们将溶液稀释至1 mmol/L，稀释液的组成为（单位：mmol/L）150 NaCl、2.5 KCl、10 HEPES，pH 7.4，并涡旋混匀额外10至20分钟。我们加入100 μmol/L硫磺罗丹明101，以特异性标记星形胶质细胞，并在染料注射过程中用于可视化移液管。接下来，我们在待成像区域上方植入颅窗。该手术的总体方法我们已在先前发布的JoVE视频文章中描述，但以下修改对于钙染料注射至关重要。在目标皮层区域进行直径为两毫米的较小开颅，需格外小心以避免损伤下方的硬脑膜。将盖玻片固定在开颅部位上方，但仅部分覆盖开颅区域，使开颅边缘与玻璃盖玻片之间留有微小间隙，以便在注射前使移液管能够斜向进入皮层。在开颅周围用牙科水泥制作一个浅井结构。用于钙成像实验的脑区应尽可能向前（吻侧）延伸，并且深度足够浅，以便插入注射用微移液管。注射前，我们立即使用0.45微米的离心滤器过滤溶液。随后将小鼠转移至显微镜载物台上，并按照我们在血流成像视频中所示的方法固定头部。接下来，我们拉制玻璃微电极移液管，使其尖端直径达到在电阻上产生2至4兆欧的水平。使用拉针仪将钙离子指示剂染料混合物加载到玻璃移液管中。利用显微注射器和显微操作器，通过4倍物镜将微移液管轻柔地降至脑表面，并进行更精细的定位。在40倍物镜下，选择一个合适的注射位置，确保该区域上方几乎没有或完全没有血管覆盖。为了利用双光子显微镜进行成像，需先观察微移液管的尖端，并将其缓慢插入皮层，直至硬脑膜下方 200 微米深度。为尽可能准确地完成此操作，需将物镜的 Z 轴焦距读数设为零。一旦观察到硬脑膜，即可观察微移液管，并在将其下移至硬脑膜下方 200 微米的过程中记录 Z 轴焦距读数。随后在1

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在体内2光子层钙成像对小鼠的2 / 3

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