Name: 体外 肺上皮细胞在气液界面的大麻暴露 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 了解如何使用石英晶体微天平实时测量气液界面模型中大麻蒸气暴露的沉积质量。该方法利用inExpose暴露系统实现精确剂量测定，为吸入毒理学研究提供标准化方案，提高实验可重复性。

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本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（资助号 162273）。CJB 由魁北克健康研究基金会（FRQS）提供支持。本研究还获得了 Mitacs 资助（资助号 IT34076）对 ETW 的支持。

1. 在气液界面培养肺上皮细胞
注意：此处描述的是A549细胞在气液界面（ALI）培养的实验方案。请查阅拟用于研究的细胞类型的相关文献。不同的细胞系需要不同的气液界面培养时间，以实现分化、形成紧密连接以及产生表面活性物质/黏液。
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>在500 mL的DMEM培养基中加入50 mL热灭活的胎牛血清（FBS）、5 mL Glutamax、5 mL抗生素-抗真菌剂以及500 µL庆大霉素，配制完全培养基。</li>
		<li>将配制好的培养基置于水浴中加热10–15分钟，使其温度升至37 °C。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒生物安全柜并擦拭表面。待培养基预热完成后，将其置于无菌的生物安全柜内。</li>
		<li>在超净工作台内，用移液器将约10 mL培养基转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>从液氮中取出细胞，在水浴中轻轻振荡以快速解冻。</li>
		<li>在超净工作台内，将冻存管中的解冻细胞移入上述15 mL离心管中。</li>
		<li>将15 mL离心管在300 g条件下离心5分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液，避免扰动沉淀的细胞团。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于培养基中，并转移至T75培养瓶中。</li>
		<li>在显微镜下检查T75培养瓶中的细胞状态。</li>
		<li>将细胞置于37 °C、5% CO2及饱和湿度条件下培养。</li>
		<li>每2–3天更换一次细胞培养基。</li>
		<li>传代并扩增细胞至所需数量。接种一个12孔板需要3 × 106个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transwell小室的胶原蛋白包被
	<ol>
		<li>胶原蛋白溶液的配制
		<ol>
			<li>将10 mg IV型胶原蛋白溶于20 mL ddH2O中，并加入50 µL冰醋酸。</li>
			<li>在37 °C孵育30分钟，期间偶尔轻柔摇晃，直至完全溶解。</li>
			<li>使用0.22 µm滤器过滤溶液，进行除菌处理。</li>
			<li>将溶液分装为每管1.5 mL至15 mL离心管中，于-20 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用IV型胶原蛋白包被Transwell滤膜
		<ol>
			<li>从-20 °C取出一管IV型胶原蛋白溶液（终浓度为50 µg/mL）并解冻。</li>
			<li>向每个Transwell滤膜上加入150 µL胶原蛋白溶液。 
			注：仅12孔板适用于本暴露系统。</li>
			<li>将板盖打开，置于生物安全柜（BSC）中干燥18小时。</li>
			<li>通过紫外（UV）光照射30分钟进行灭菌。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将包被后的板用封口膜包裹后于4 °C保存，最长可保存30天。</li>
		<li>接种细胞前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗滤膜的两侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在插入式培养小室中接种细胞并建立气液界面（ALI）
	<ol>
		<li>培养板与细胞悬液的准备
		<ol>
			<li>向12孔板的每个孔中加入1.5 mL预热的完全培养基。</li>
			<li>将培养板放入37 °C、5% CO2的培养箱中预平衡。</li>
			<li>用完全培养基制备浓度为5 × 105个细胞/mL的细胞悬液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在插入式小室中接种细胞
		<ol>
			<li>将准备好的细胞培养板从培养箱中取出，置于无菌生物安全柜内。</li>
			<li>向每个插入式小室的膜顶部加入0.5 mL细胞悬液（每插入小室含2.5 × 105个细胞）。</li>
			<li>盖上培养板盖，放回37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>建立气液界面（ALI）
		<ol>
			<li>细胞接种后24小时，移除顶端培养基。</li>
			<li>将基底侧培养基更换为0.6 mL新鲜完全培养基。此时细胞顶端暴露于空气中，形成气液界面（ALI）。</li>
			<li>将A549细胞在气液界面条件下培养最多2周，每2天更换一次培养基，以促进细胞分化，其特征已在此前研究中被充分描述4。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用液相色谱/质谱法评估大麻烟雾暴露的剂量测定
注意：在本实验方案的这一部分中，采用无细胞方法通过分析Δ9-THC浓度来表征大麻烟雾在每个孔中沉积的剂量。Δ9-THC会吸附于塑料材料，因此样品收集时只能使用玻璃小瓶。该方法要求所选用的大麻品种含有Δ9-THC。
<ol>
	<li>暴露系统的准备与设置
	<ol>
		<li>根据指定的气流路径设置暴露系统的管路（图 1A，B）：ENDS 单元 &#62; 冷凝器 &#62; 抽吸泵 &#62; 带 Aeroneb 泵的等体积采样组件 &#62; expoCube &#62; 带过滤器的湿度传感器 &#62; expoCube 暴露气流端口。</li>
		<li>开启温控装置，将系统加热至 35 °C 和 50 °C。</li>
		<li>进行气流测试，确保系统无泄漏且压力设置正确（参见 SCIREQ 技术说明：《expoCube 中气流不均问题的故障排除指南》）。</li>
		<li>启动 Aeroneb 泵，使相对湿度达到 75% 以上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剂量测定测试与蒸发器准备
	<ol>
		<li>大麻蒸发器准备
		<ol>
			<li>使用草药研磨器研磨大麻花。</li>
			<li>使用药片分隔器称取 0.25 g 的等分试样，并将每份试样分开存放。</li>
			<li>将不锈钢插件放入暴露系统内 12 孔 Transwell 板的暴露行中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不锈钢插件暴露于大麻蒸气
	<ol>
		<li>开始暴露
		<ol>
			<li>将 0.25 g 大麻装入蒸发器炉膛中。</li>
			<li>使用密封垫圈将大麻蒸发器连接至暴露系统的 ENDS 单元，并启动所需的抽吸程序。将蒸发器设置为 Smart Path 2 级 温度模式。 
			注：本研究中使用的暴露系统具有四个可选的 Smart Path 温度等级，包括 1 级（176–188 °C）、2 级（188–199 °C）、3 级（199–210 °C）和 4 级（210–221 °C）。</li>
			<li>在 flexiWare 软件（数据采集软件；参见 SCIREQ 技术说明：《flexiWare 8 创建配置文件指南》）中创建抽吸曲线。本方案使用 70 mL 的抽吸体积，频率为每分钟 4 次抽吸。</li>
			<li>在更换大麻前，先运行干草本蒸发器 5 分钟，方法是将大麻花从蒸发器炉膛中取出，并向其中加入一份新的 0.25 g 大麻。交替使用两个蒸发器以实现连续暴露。</li>
			<li>重复步骤 2.3.1.1–2.3.1.4，直至达到所需的暴露时间。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每次暴露后，使用镊子小心地从暴露系统中取出插件，并按以下说明准备样品采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于 LC/MS 分析的样品采集与制备
	<ol>
		<li>使用镊子将对应每次暴露的滤膜放入含有 10 mL LC/MS 级甲醇的标记玻璃小瓶中（例如，暴露 1、暴露 2、暴露 3）。</li>
		<li>清洗插件。
		<ol>
			<li>将每个暴露过的不锈钢插件放入含有 10 mL LC/MS 级甲醇的标记玻璃小瓶中。</li>
			<li>根据暴露条件对小瓶进行标记（例如，暴露 1 孔 1–4）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>提取 Δ9-THC
		<ol>
			<li>使用超声波清洗仪对含有插件的小瓶进行 10 分钟的超声处理，以提取 Δ9-THC。</li>
			<li>将插件转移至另一组含有 10 mL 新鲜甲醇的玻璃小瓶中，再进行 10 分钟的超声处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将所有制备好的样品（孔板、清洗液和滤膜）提交进行 LC/MS 分析，以定量测定 Δ9-THC 水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剂量计算
	<ol>
		<li>根据 LC/MS 分析结果，计算沉积的 Δ9-THC 量，以确定暴露气流（沉积在滤膜上的量）和孔板中的剂量。</li>
		<li>计算 Δ9-THC 在暴露气流滤膜与孔板沉积量之间的比例。</li>
		<li>利用该比例确定在暴露过程中递送至细胞的剂量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用石英晶体微天平评估大麻蒸汽暴露的剂量测定
注意：本方法详细描述了石英晶体微天平（QCM）的安装与校准，用于评估在暴露过程中沉积的 cannabis 烟雾颗粒的质量。每个 QCM 均可提供实时测量，从而实现对 cannabis 烟雾暴露剂量的精确定量。
<ol>
	<li>在暴露系统中准备和设置石英晶体微天平（QCM）
	<ol>
		<li>按照先前所述方法配置暴露系统。</li>
		<li>使用夹子连接器将每个QCM连接至其电子模块，并通过7针连接器将模块连接至inExpose（吸入暴露平台）单元的输入端口。</li>
		<li>将QCM插入件放入暴露系统暴露侧的孔板中，确保QCM对位良好。</li>
		<li>启动带有已连接QCM的暴露系统预热程序，直至系统稳定在目标温度35 °C和50 °C。</li>
		<li>根据实验设置启动微流和暴露气流。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准QCM
	<ol>
		<li>每次暴露实验前，使用数据采集软件中的校准向导对QCM进行校准。</li>
		<li>等待蓝色&#160;校准条稳定后，选择下一步以记录QCM的共振频率，用于精确的质量计算。 
		注意：预期校准范围为-15%至15%。若出现偏差，可能提示存在QCM污染或LEMO连接器未连接等问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时监测QCM信号
	<ol>
		<li>监测QCM输出信号；系统会输出累积沉积质量。该数值在数据采集软件中以图形形式和实时数值同时显示。 
		注意：每次实验运行期间，软件还会报告最大和最小沉积量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁QCM
	<ol>
		<li>为保持测量准确性，每次实验后均需清洁QCM。</li>
		<li>向每个QCM插入件内加入1 mL 70%异丙醇。</li>
		<li>用移液器将酒精溶液上下吹打2–3次，以溶解残留物。</li>
		<li>移除酒精溶液，并将QCM置于无尘环境中彻底风干后方可再次使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞暴露于大麻烟雾后的结果
注意：本方案旨在利用 expoCube 系统，评估大麻烟雾对气液界面（ALI）培养的呼吸系统细胞的影响。暴露后的检测方法包括 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）和乳酸脱氢酶（LDH）实验，可用于分析剂量依赖性的细胞毒性及代谢活性。
<ol>
	<li>大麻烟雾递送
	<ol>
		<li>按照上述方法设置暴露系统：确保系统已达到 35 °C 和 50 °C 的温度，并且相对湿度水平高于 75%。</li>
		<li>若使用石英晶体微天平（QCM），使用夹式连接器将设备连接至其电子模块，并通过 7 芯连接器将模块连接至吸入暴露单元的输入端口。将单个 QCM 插件放入 expoCube 暴露侧的孔板中，确保 QCM 正确对齐。</li>
		<li>打开暴露系统，将细胞培养板放入其中。</li>
		<li>根据第 2 节设定的程序，开始执行指定持续时间的 puff 暴露方案。使用 QCM 可实现对沉积总烟雾量的实时监测。</li>
		<li>暴露结束后，将细胞放回培养箱，直至达到所需的检测时间点。</li>
		<li>根据需要从不同区室收集样品，包括基底外侧区室、顶端区室冲洗液（用于表面活性剂或黏液）以及细胞裂解液。</li>
		<li>剂量选择检测：使用乳酸脱氢酶（LDH）和 MTT 检测，以帮助确定最佳剂量及潜在的细胞毒性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气液界面（ALI）培养细胞的 LDH 检测
	<ol>
		<li>收集培养基：在暴露后指定时间点，从基底外侧区室收集培养基。</li>
		<li>将 100 µL 收集的培养基转移至透明的 96 孔微孔板中。</li>
		<li>向每孔加入 100 µL 新鲜配制的 LDH 反应混合液。</li>
		<li>将微孔板在室温（15–25 °C）下避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 490–492 nm 波长处测定吸光度，参考波长设为高于 600 nm。</li>
		<li>使用以下公式计算细胞毒性： 
		细胞毒性 (%) = (实验值 - 阴性对照)/(阳性对照 - 阴性对照) × 100</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气液界面（ALI）培养细胞的 MTT 检测
	<ol>
		<li>按照既定方法在气液界面（ALI）培养 A549 细胞。</li>
		<li>在暴露系统中完成暴露后，将细胞放回培养箱，直至达到所需的检测时间点。</li>
		<li>将 1 mg MTT 溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 MTT 溶液。</li>
		<li>向细胞顶端侧加入 500 µL MTT 溶液，同时向基底外侧区室加入 500 µL MTT 溶液。</li>
		<li>将细胞放回 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。</li>
		<li>小心移除所有培养基。</li>
		<li>向顶端侧加入 500 µL 二甲基亚砜（DMSO），向基底外侧加入 1,000 µL DMSO。</li>
		<li>孵育 1 小时，以充分溶解甲臜结晶。</li>
		<li>收集并合并来自顶端和基底外侧的溶液。</li>
		<li>在 540 nm 波长（OD540）测定吸光度，参考波长为 690 nm（OD690）。</li>
		<li>使用以下公式计算细胞活力： 
		细胞活力 (%) = 100 × (暴露组平均 OD / 阴性对照组平均 OD)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

PG 和 BU 任职于 SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc。ETW 通过 Mitacs Accelerate 项目在 SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. 完成了实习。其余作者无任何利益冲突需要披露。

在气液界面培养细胞是呼吸系统研究中的一种重要方法，因其能够更准确地模拟 体内 与传统淹没式培养相比的气道条件19在气液界面（ALI）培养条件下，肺上皮细胞的顶面直接暴露于空气中，而基底侧仍可从培养基中获得必要的营养物质。这种培养体系使细胞能够产生表面活性物质或黏液——这些是呼吸防御机制中的关键组分，对于捕获和清除吸入的颗粒物及病原体至关重要。20,21,22A549细胞常被用于 体外 研究，但仅是可用于气液界面（ALI）培养的多种呼吸道上皮细胞培养模型之一。Silva 等人综述了从鼻腔到肺泡的呼吸道上皮细胞系及原代培养物在ALI模型中的应用22该ALI暴露系统的灵活性使其可适用于不同的细胞系和原代细胞。
ALI 培养系统正日益被视为 &#34;金标准&#34; 用于 体外 吸入研究，特别是针对空气污染物、颗粒物及其他可吸入物质的研究23. ALI 模型的一个主要优势在于其能够提供更易于转化为 体内 人类效应。然而，气液界面暴露缺乏标准化操作流程是一个显著的缺点，这影响了不同研究之间的可重复性和可比性。其中一个空白在于缺乏标准化的暴露工作流程。通过在气液界面将细胞暴露于大麻烟雾中，可评估大麻对细胞功能、活力及细胞毒性的效应。此类暴露允许对生物学结局进行详细评估，包括细胞毒性、炎症和氧化应激的标志物。对沉积的大麻素进行精确定量，可实现大麻烟雾（及其他形式大麻产品）细胞效应的可重复研究，从而在受控的实验室环境中增进对其潜在健康影响的理解。
先进的暴露系统通过实现颗粒物直接沉积到细胞表面，克服了传统淹没式培养的局限性，从而提供了更接近生理条件的暴露环境。这同时也降低了溶剂或载体可能带来的影响。由于无需使用这些溶剂即可实现颗粒物的直接沉积，暴露系统有助于最大限度地减少与载体相关的效应。然而，仍需考虑一些与载体相关的问题。例如，不受控的湿度水平可能引起细胞非预期的应激反应24，进而影响实验结果。因此，必须严格调控湿度至最佳水平，以维持细胞稳定性及实验结果的准确性。此外，每种颗粒物、气溶胶或气体混合物都具有独特的理化性质，可能影响其在细胞表面的沉积行为25。因此，针对每一种特定物质，均需对其暴露方案进行表征。可能影响颗粒物沉积的因素包括热泳现象，即颗粒物从高温区域向低温区域移动的过程26。热泳有助于引导颗粒物朝向细胞运动，并提高沉积效率。
在ALI暴露系统中进行操作时，给药的一致性和精确性是额外的挑战，尤其是涉及气溶胶或颗粒物时。体内肺部颗粒物沉积是一个复杂的过程，受颗粒物的尺寸、形状、密度和溶解度，以及肺部特定暴露区域的影响27。这些因素导致沉积率存在差异，难以在体外系统中准确重现。多路径颗粒物剂量学（MPPD）等数学模型是估算体内沉积率并指导体外剂量转化的有用工具28。然而，将体外给药与体内暴露情景相匹配仍具挑战性，特别是对于成分异质的复杂气溶胶。
在进行无细胞剂量表征时，需要注意的是，不锈钢插入式清洗法往往会高估沉积量，因为化合物可能附着在插入件的壁面以及细胞通常所处的底部位置。石英晶体微天平（QCM）在此具有优势，它仅测量直接沉积在细胞培养区域的质量，从而更准确地评估与细胞暴露相关的沉积量。
随着毒理学向更具生理相关性的模型发展，统一的气液界面暴露方案的采用将在弥合以下差距方面起到基础性作用 体外 发现和 在体 人体反应，最终支持对呼吸系统毒物及其对健康影响的更可靠评估。

大麻通常通过吸入其花朵燃烧产生的烟雾来使用，无论是娱乐性使用还是医疗用途，常见形式为吸食卷烟。大麻主要的生物活性来源于大麻素，例如Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC）和大麻二酚（CBD），这些成分在吸入时进入人体。大麻烟雾还含有热解产物，包括致癌物、致突变物和致畸物，可能对健康造成不良影响1。鉴于这些担忧，人们开始关注使用大麻雾化器，这类设备通过加热大麻花朵而不使其燃烧，期望借此释放大麻素以供吸入，同时避免燃烧产物的产生。已有部分研究对大麻蒸气中的化学成分进行了表征，结果显示其中虽含有大麻素，但也存在多种呼吸毒性物质，这挑战了此类设备安全无害的观点2,3。目前在雾化大麻对肺部及其他器官影响方面仍存在显著的知识空白。
细胞培养研究在毒理学中至关重要，可用于分离并理解吸入物质在细胞水平上的特定效应，从而获得与人类生物学相关的高通量、低成本且具有机制性意义的见解。体外实验中细胞的培养方法也是决定整体实验结果的重要因素。大多数细胞培养研究采用浸没式培养体系，即细胞在塑料培养基质上生长，并从顶端暴露于液体培养基中。然而，气道上皮细胞在此方面面临独特挑战。在整个呼吸系统中，上皮细胞的顶端表面始终与空气接触。在肺泡内，上皮细胞可产生表面活性物质，而其他气道上皮细胞则分泌黏液；这些共同作用以保护并维持肺功能。浸没式培养无法模拟顶端暴露于空气的环境，因而限制了其准确再现体内环境的能力。一种替代浸没式培养的模型是气液界面（ALI）培养，即在胶原蛋白包被的膜上培养呼吸上皮细胞，培养基位于基底侧，而细胞顶端则暴露于空气中。在ALI条件下培养的上皮细胞能更好地模拟呼吸上皮，因为在此环境中这些细胞能够实现极性分化、分泌表面活性物质或黏液，并形成细胞间连接4。
传统浸没式细胞培养方法面临的另一个问题是，像大麻素这类疏水性化合物在水相介质中溶解度较差5。乙醇提取物是研究浸没培养中疏水性化合物常用的溶剂6,7,8,9,10,11,12。这些提取物可使疏水性和亲水性化合物均溶解于水相介质中。然而，其局限性在于化合物可能发生聚集，以及化合物与培养基之间的相互作用，这两者均可能改变其生物利用度13,14。近年来已开发出一些先进技术暴露系统（如expoCube15（ALI/Transwell in vitro/ex vivo暴露系统）等），可实现将气溶胶相化合物在无溶剂或无培养基条件下递送至细胞。利用先进暴露系统直接沉积气溶胶和颗粒悬浮物，可避免浸没式暴露所必需的收集-再悬浮过程，而该过程已知会显著改变颗粒的理化性质16。本文中，我们描述了一种在气液界面（ALI）条件下对肺泡上皮细胞系进行暴露的标准操作流程。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管，支架（聚苯乙烯支架），无菌</td><td>蒙特利尔生物技术公司</td><td>MBI601051C</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 玻璃瓶</td><td>Thomas Scientific</td><td>1755F32</td><td></td></tr><tr><td>A549细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100x）</td><td>Wisent</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>大麻植物研磨器&amp;nbsp;</td><td>真奇</td><td>https://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&amp;amp;dib=eyJ2Ijo&lt;br/&gt; iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i&lt;br/&gt; w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT&lt;br/&gt; NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3&lt;br/&gt; SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4&lt;br/&gt; 97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8&lt;br/&gt; vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf&lt;br/&gt; PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N&lt;br/&gt; nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH&lt;br/&gt; A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL&lt;br/&gt; ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v&lt;br/&gt; OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F&lt;br/&gt; 全球约有1.92亿人使用大麻。大多数使用者通过吸入大麻烟雾的方式摄取，而烟雾中含有燃烧副产物，可能对肺部健康产生负面影响。由于认识到这些风险，人们对大麻电子烟（即大麻雾化器）的兴趣日益增长，这类设备可在不燃烧的情况下加热干燥的大麻花。雾化大麻仍可释放可被吸入的 cannabinoids（大麻素），但以较低温度加热植物材料。目前尚无标准化的体外模型用于评估干燥大麻雾化物的影响。因此，我们建立了一种在气液界面（ALI）条件下暴露肺细胞培养物的模型，使细胞顶面直接暴露于雾化后的大麻，从而更准确地模拟肺上皮细胞的生理状态。该方案可确保向细胞表面稳定且可重复地递送大麻雾化物，为研究雾化大麻对细胞和分子层面的影响提供了一个可靠的平台。本研究首次实现了体外大麻雾化递送方法的标准化，可为今后的大麻临床前研究提供参考基准。&lt;br/&gt; Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV&lt;br/&gt; qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92&lt;br/&gt; 全球约有1.92亿人使用大麻。大多数使用者通过吸入大麻烟雾的方式摄取，而烟雾中含有燃烧副产物，可能对肺部健康产生负面影响。由于了解这些风险，人们对大麻电子烟（即大麻雾化器）的兴趣日益增长，这类设备可在不燃烧的情况下加热干燥的大麻花。雾化大麻仍可释放可被吸入的 cannabinoids（大麻素），但以较低温度加热植物材料。目前尚无标准化的体外模型用于评估干燥大麻雾化物的影响。因此，我们建立了一种在气液界面（ALI）条件下暴露肺细胞培养物的模型，使细胞顶端直接暴露于雾化后的大麻，从而更准确地模拟肺上皮细胞的生理状态。该方案可确保向细胞表面稳定且可重复地递送大麻雾化物，为研究雾化大麻对细胞和分子层面的影响提供可靠平台。本研究首次实现了体外大麻雾化递送方法的标准化，可为今后的大麻临床前研究提供基准参考。&lt;br/&gt; vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_&lt;br/&gt; K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY&lt;br/&gt; GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj&lt;br/&gt; CN3LXumyu8Q&amp;amp;dib_标签=se&amp;amp;&lt;br/&gt; 关键词=草药研磨器&amp;amp;qid=1736346511&amp;amp;&lt;br/&gt; herb+grinder,aps&lt;br/&gt; 2C168&amp;amp;sr=8-10&amp;amp;th=1</td><td></td></tr><tr><td>人胎盘 IV 型胶原蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>Costar 12 mm Transwell， 0.4 &amp;micro;m 孔径聚酯膜小室</td><td>Stemcell Technologies</td><td>38023</td><td></td></tr><tr><td>细胞毒性检测试剂盒（LDH）</td><td>罗氏</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>Davinci MIQRO-C 干草本植物 vaporizer</td><td>DAVINCI</td><td>https://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>干燥大麻花</td><td>社会&amp;eacute;t&amp;eacute; qu&amp;eacute;b&amp;eacute;大麻的采集</td><td>https://www.sqdc.ca/zh-CN/干花大麻？&amp;amp;fn1=大麻素平衡查找&lt;br/&gt;价值&amp;amp;fv1=THC</td><td>大麻素含量：17&amp;ndash;23% THC &amp;< 0.1% CBD&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>FBS</td></tr><tr><td>flexiWare&amp;nbsp;</td><td>SCIREQ</td><td>https://www.scireq.com/downloads/</td><td>版本 8.4.1</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Wisent</td><td>450-134-XL</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100063&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>inExpose expoCube 体外暴露系统&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>SCIREQ</td><td>IX-XCP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO</td><td>TECAN</td><td>30125944</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS级甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106035</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>T175 EasYFlask，TC 表面，带滤膜瓶盖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask，TC 表面，滤帽</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>噻唑蓝四氮唑溴盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 2128</td><td>MTT</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108603</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗浴</td><td>VWR</td><td>18303</td><td>超声波清洗仪浴槽</td></tr><tr><td>周用药品分装盒</td><td>健康智能</td><td>640-8223-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

体外大麻对气液界面肺上皮细胞的暴露

In vitro Cannabis Exposures of Lung Epithelial Cells at the Air-Liquid Interface

全球约有1.92亿人使用大麻。大多数使用者通过吸入大麻烟雾的方式使用大麻，而烟雾中含有燃烧副产物，可能对肺部健康产生不利影响。由于认识到这些风险，人们对大麻电子烟雾化器的兴趣日益增加，这类设备可在不燃烧的情况下加热干燥的大麻花。雾化大麻仍可释放出可被吸入的 cannabinoids（大麻素），但以较低温度加热植物材料。目前尚无标准化的in vitro（体外）模型用于评估干燥大麻蒸气的影响。因此，我们建立了一种在气液界面（ALI）暴露肺细胞培养物的模型，使细胞顶端直接暴露于雾化后的大麻蒸气中，从而更准确地模拟肺上皮细胞的生理状态。本方案可确保向细胞表面稳定且可重复地递送大麻蒸气，为研究雾化大麻对细胞和分子层面的影响提供了一个可靠的平台。本研究首次标准化了in vitro大麻蒸气递送方法，可作为未来临床前大麻研究的参考基准。

在使用expoCube系统进行实验时，四个孔暴露于大麻烟雾，另外四个孔暴露于经调节的空气作为溶剂对照，其余四个孔则完全封闭作为阴性对照（图1C）17。该设置可实现处理组、溶剂对照组和阴性对照组之间的精确比较。系统经过加湿处理，以创建适合细胞培养的环境（图2），并通过系统内的温度调控利用热泳效应增强颗粒沉积，从而高效地将气化化合物递送至细胞18。为量化暴露剂量，我们检测细胞暴露位点中Δ9-THC的含量，作为大麻烟雾沉积的标志物。该定量对于优化暴露时间和剂量至关重要，可使研究人员调整主动暴露时间，以在细胞培养实验中实现目标剂量（图3）。通过计算暴露气流滤膜中收集到的Δ9-THC量与各孔中沉积量的比值，可估算实际递送至细胞的剂量（表1）。该计算所得剂量有助于确定理想的暴露范围，为以一致且可测量的方式研究细胞对大麻烟雾的反应提供最优参数。此方法也可用于其他大麻素，具体取决于所选大麻品系的大麻素谱型。此外，还可进行QCM分析以实时测量大麻烟雾的沉积情况。图4展示了在30分钟时间过程中大麻烟雾的沉积情况，其中每5分钟更换一次雾化器和大麻材料。每个孔的沉积质量均随时间持续增加，表明全谱大麻烟雾颗粒实现了有效且连续的沉积。
<img alt="使用电子尼古丁输送系统（ENDS）的 cannabis 烟雾装置；实验示意图、实验室设备、暴露分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68102/68102fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：ALI/Transwell 示意图 体外/离体 用于在气液界面进行大麻烟雾暴露的暴露系统 (A使用 DaVinci MIQRO 加热型雾化器生成大麻烟雾。该样本经加湿后，通过等速采样器输送至暴露部位。控制单元可调节气流输出和温度梯度。B曝光系统设置的照片。CexpoCube 内部被分隔为三排：用于大麻烟雾暴露的测试排、通入条件化空气的溶剂对照排，以及完全不受气流影响的封闭式阴性对照排。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68102/68102fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="湿度暴露气流图，显示实验中相对湿度随时间变化的振荡模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68102/68102fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：随时间变化的相对湿度（%）曲线。该数据展示了 Aeronebs 启动时的相对湿度水平，湿度达到并维持在平均 75% 的水平。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68102/68102fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Δ⁹-THC 浓度柱状图，孔 1-4，暴露 1-3，分析比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68102/68102fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过 LC/MS 分析测定大麻烟雾暴露 30 分钟后 Δ9-THC 的沉积量。(A-C) 使用 1.5 g 高 THC 含量的大麻品种，分别进行三次独立的 30 分钟烟雾暴露，每次暴露后测定各孔中 Δ9-THC 的沉积量。Δ9-THC 水平通过 LC/MS 进行定量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68102/68102fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="四个孔的时间-质量沉积图，显示随时间（0-2000秒）的质量逐步增加。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68102/68102fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：利用ALI/Transwell系统进行大麻蒸汽沉积的QCM测量 体外/离体 30分钟暴露方案下的暴露系统 (A-D每个图表表示大麻蒸汽颗粒在1-4号孔中的累积沉积量，质量单位为微克（μg）µg随着时间的推移，沉积速率显示出所有孔中稳定的累积趋势。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68102/68102fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>主气流滤膜沉积量 (μg)</td>
			<td>孔内沉积量 (μg)</td>
			<td>主气流沉积在孔内的百分比 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">暴露 1</td>
			<td rowspan="4">2142.3</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.4</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.6</td>
			<td>0.22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.4</td>
			<td>0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">暴露 2</td>
			<td rowspan="4">2726.5</td>
			<td>4.1</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.9</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.4</td>
			<td>0.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.6</td>
			<td>0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">暴露 3</td>
			<td rowspan="4">2400</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.8</td>
			<td>0.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均值</td>
			<td>2422.9</td>
			<td>4.3</td>
			<td>0.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>标准差</td>
			<td>292.8</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. Δ的比较9-THC 在 ALI/Transwell 中的沉积 体外/离体 暴露系统位于暴露气流过滤器与细胞暴露位点之间。

我们建立了一种标准化的 体外 用于在气液界面研究大麻蒸气暴露的模型。该模型提供了一种系统性方法，用于评估气化大麻的影响，以应对当前对大麻电子烟作为吸烟替代方式日益增长的关注。

据估计，全球有1.92亿人使用大麻。大多数使用者通过吸入大麻烟雾的方式使用大麻，这种烟雾含有……

本实验室利用临床前模型研究吸入毒理学，以探讨烟草、电子烟和大麻对健康的影响。研究重点为呼吸系统疾病，并开发与人类相关的暴露系统，用于转化医学研究。先进的暴露系统实现商业化后，使得气液界面（ALI）模型得以广泛应用，从而提升了我们模拟人类肺部生理功能的能力，并有助于研究上皮细胞对烟雾和蒸汽等复杂吸入混合物的反应。一个关键挑战是缺乏标准化的方法来测量和导入ALI模型中的化合物沉积量，这使得使用先进暴露系统的研究之间难以进行结果比较。我们的方案解决了ALI模型和先进暴露系统在标准化指南方面的缺失问题，有助于研究人员提高吸入毒理学研究的可重复性和一致性。本方案利用石英晶体微天平（QCM）实现实时剂量测定，可在暴露过程中精确测量大麻产品的沉积量，相较于缺乏直接剂量监测的技术，显著提高了实验的准确性和可重复性。[指导教师] 首先，打开 inExpose 暴露系统。选择实验模板，输入操作员信息，然后点击“确定”。将温度控制开启，下半部分设定为 35°C，上半部分设定为 50°C。20 分钟后，使用 Microflow 测试套件执行 Microflow 泄漏测试。操作时，将管路的四个端口连接至 microflow 管。然后将另一端连接至转子流量计顶部。接下来，插入输入端口。将流量测试插件装入 expoCube，并将转子流量计连接至 expoCube 的空气输出端。为测试泵流量，将等动力采样器重新连接至 expoCube。盖紧雾化器盖子，并将转子流量计底部连接至 expoCube 输出端。接着，使用研磨器将大麻花研磨，以准备汽化。称取 0.25 克一份的研磨后大麻样品，并使用药片分隔器对每份样品进行分装。将 0.25 克制备好的大麻装入汽化炉中。配置石英晶体微天平（QCM）暴露系统。使用夹式连接器将每个 QCM 连接到其电子模块，并通过七针连接器将模块连接至 inExposed 吸入暴露平台。将 QCM 插件放入系统暴露侧的孔板中，确保 QCM 正确对齐。在连接 QCM 的情况下预热暴露系统，直至系统温度稳定在 35°C 和 50°C。然后根据实验设置启动 microflow 和暴露气流。接下来，使用数据采集软件中的校准向导，在暴露运行前对每个 QCM 进行校准。等待蓝色校准条稳定后，点击“下一步”以记录 QCM 的共振频率，用于精确的质量计算。将汽化器设置为智能路径二级温度模式。现在，使用密封垫圈将大麻汽化器牢固地连接至暴露系统的末端单元。启动 airneb 任务，使系统相对湿度在引入细胞前升至 75% 以上。使用 flexi wear 数据采集软件选择一次吸气模式。然后记录 microflow 压力为 80 千帕斯卡，上部组件温度为 50°C，下部组件温度为 35°C，主暴露气流为 0.3 升/分钟，主控制气流为 0.3 升/分钟。在暴露期间，通过连接的软件界面持续监测 QCM 的输出信号。为保持准确性，每次实验后需清洁 QCM。向每个 QCM 插件中加入 1 毫升 70% 乙醇。用移液器将乙醇上下吹打 2 至 3 次，以溶解任何汽化残留物。移除乙醇溶液，并在无尘环境中让 QCM 完全风干，方可进行下一次使用。将 QCM 插件放入 expoCube 暴露侧的孔板中，确保正确对齐。然后打开暴露系统，将含有呼吸道细胞的细胞培养板放入系统内。选择吸气模式，开始设定时长的吸气程序。在弹出窗口中输入控制面板设置。使用 QCM 时，实时监测暴露过程中蒸汽的沉积情况。暴露结束后，将细胞培养板放回培养箱，直至预定的检测时间点。根据需要从不同区室收集样品，包括基底外侧区室、顶端灌洗液（用于表面活性剂或黏液）以及细胞裂解液。在 700 秒的时间内，暴露气流湿度成功维持在 65% 至 85% 的相对湿度范围内，显示出一致的周期性波动。暴露孔中 Δ9-四氢大麻酚（Delta nine tetrahydrocannabinol）的沉积显示递送稳定，各孔之间仅有微小差异。QCM 分析证实，在 30 分钟内，四个孔中的沉积质量均持续稳定增加，表明在整个暴露期间颗粒物持续递送。

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Medicine

医学

体外 肺上皮细胞在气液界面的大麻暴露

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

本方案旨在演示细胞培养物暴露于吸入性有毒化学物质的方法。将分化后的气液 界面（ALI）培养的气道上皮细胞暴露于有毒气体（如氯气）中，可为气道暴露提供一种独特的模型。本文描述了氯气暴露对上皮细胞气液 界面培养体系以及心肌细胞浸没培养体系的影响。体外暴露系统可实现重要的机制性研究，用于评估相关通路，进而推动新型治疗药物的开发。...

体外细胞培养模型用于吸入性有毒化学物检测

本实验方案的目的是在气液界面条件下，将人源类器官三维支气管和鼻组织模型暴露于香烟主流烟雾（CS）中。随后通过细胞色素P450活性检测、纤毛搏动测量以及系统生物学方法，评估烟雾对组织的影响。...

反复暴露于全烟雾对支气管和鼻部类器官三维组织培养模型的影响评估

我们介绍一种专门设计的简便方案，用于获得精确且可控浓度的七氟烷或异氟烷 体外...

体外 控制培养肺泡上皮细胞中卤化气体浓度的方法

在此，我们介绍一种用于进行便携式细胞气溶胶暴露并检测细胞反应的实验方案。该方法采用在气液界面培养的细胞，以模拟 体内...

一种新型便携式 体外 气溶胶采样暴露盒

我们介绍一种稳定、可转移且具有预测性的体外暴露系统，通过在气液界面（ALI）暴露培养的人肺细胞，用于筛选和监测空气颗粒物的急性肺部细胞毒性。...

在气液界面暴露培养的人肺细胞评估空气颗粒物的急性吸入毒性

本文介绍了一种研究香烟烟雾提取物如何影响肺上皮细胞中细菌定植的实验方案。...

研究香烟烟雾对肺上皮细胞中Pseudomonas感染的影响

本文描述了一种体外支气管模型的细胞培养及暴露方法，可用于对颗粒物进行真实、重复的吸入暴露，以开展毒性测试。...

一种用于毒性测试中真实、重复吸入空气颗粒物暴露的气液界面支气管上皮模型

本方案描述了人诱导性多能干细胞衍生的类似2型肺泡上皮细胞（iAT2s）。这些细胞可在三维培养条件下以自我更新的球体形式进行培养，或适应于气液界面（ALI）培养条件。...

生成人诱导性多能干细胞来源的2型肺泡上皮细胞的三维球体及二维气液界面培养模型

用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

开发用于测试气化大麻馏分的临床前吸入模型

了解如何使用石英晶体微天平实时测量气液界面模型中大麻蒸气暴露的沉积质量。该方法利用inExpose暴露系统实现精确剂量测定，为吸入毒理学研究提供标准化方案，提高实验可重复性。

体外大麻对气液界面肺上皮细胞的暴露

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