Name: 使用 In-Cloning 工具包对具有模块化克隆的多顺反子纵子（MoClo）进行标准化模块化组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学习使用In-Cloning工具包进行模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子转录单元的方法。该方案为遗传工程研究提供了灵活的多基因构建组装流程。

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TAL、STdV 和 DS 在 MaxGENESYS 项目框架内得到了马普学会的支持。

注意：本实验方案通过三个层级描述了多顺反子操纵子的设计与组装方法 体内克隆 标准（0、1 和 M）。此处组装的多顺反子操纵子以启动子开始，随后是核糖体结合位点（RBS）、编码序列（CDS）、第二个 RBS、第二个 CDS，最后是终止子图 S1强烈建议使用分子克隆软件模拟克隆过程 计算机模拟，以确保设计的克隆策略正确。本文描述了将启动子组装为 Level 0 模块、将核糖体结合位点（RBS）与编码序列及终止子组装成 Level 1 转录单元，以及将双顺反子操纵子组装为 Level M 的示例，整个组装过程的示意图如下所示 图 S1.
1. 0级：元件的驯化
注意：术语 &#34;驯化&#34; 用于表示一个分子元件已被整合到 MoClo 元件文库中，从而可在 MoClo 试剂盒的各个层级中进行组装。通常，通过同义编码等方法，将待驯化元件中存在于试剂盒内的所有 IIS 型限制性内切酶识别位点予以去除。
<ol>
	<li>插入片段的设计
	<ol>
		<li>选择拟在操纵子中组装的分子元件，如启动子、编码序列（CDS）和终止子。 
		注：本方案中，操纵子以启动子 PLuxB 起始，该启动子可在诱导物 N-(β-酮辛酰基)-L-高丝氨酸内酯（OC6）存在下被 LuxR 蛋白激活17。GFP 为操纵子中的第一个 CDS，其核糖体结合位点（RBS）为 iGEM BBa_B0064。GFP 后接一个非末端连接序列，即“终止子桥”。第二个 CDS 为 mTurquoise，其 RBS 由 RBS 计算器设计18。最后，操纵子以终止子 L3S2P21 结束19。</li>
		<li>选择各元件在组装中的位置，图1展示了位置的总体示意图。根据所选位置，确定用于 Golden Gate（GG）组装的受体质粒。 
		注：元件可被“驯化”以用于后续不同位置的组装。例如，启动子可单独组装，之后与 5'UTR 元件（pSL252）连接，也可预先与 5'UTR 一同“驯化”（pSL099）。一个 CDS 可在四种不同的受体质粒中进行组装：无标签（pSL102）、带 N 端标签（pSL104）、带 C 端标签（pSL101），或同时带 N 端和 C 端标签（pSL103）。在本示例中，启动子被“驯化”至 pSL252，第一个 RBS 被“驯化”至 pSL253，第一个 CDS 被“驯化”至 pSL102，终止子桥被“驯化”至 pSL106，第二个 RBS 被“驯化”至 pSL099，第二个 CDS 被“驯化”至 pSL102，终止子被“驯化”至 pSL106。</li>
		<li>根据所选的受体质粒，为设计的插入片段添加相应的末端序列。表1列出了不同受体质粒进行 GG 组装所需的末端序列。这些末端序列应在 PCR 引物设计、双链寡核苷酸退火构建元件，或基因合成过程中加入。 
		注：为使元件成功“驯化”，必须确保元件内部不含有本试剂盒所用 Type IIS 限制性内切酶的识别位点，即 SapI（5'-GCTCTTC-3'）、BbsI（5'-GAAGAC-3'）和 BsaI（5'-GGTCTC-3'）。若元件中含有这些识别位点，会显著降低正确组装的效率，因为最终产物可能被所用的 Type IIS 酶切割（见 图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GG 反应
	<ol>
		<li>进行 GG 反应时，加入 50 fmol 目标插入片段、50 fmol 受体质粒、1 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA 连接酶和 1 µL BbsI。用无核酸酶水补足至总体积 10 µL。同时设置阴性对照，除不加目标插入片段外，其余组分相同。</li>
		<li>在热循环仪中运行以下程序：37 °C 孵育 3 分钟（37 °C 为限制性内切酶的最适温度），16 °C 孵育 4 分钟（16 °C 为 T4 连接酶的最适温度），重复 25 个循环；随后在 50 °C 进行最终消化 20 分钟（50 °C 时 T4 连接酶活性极低或无，而限制性内切酶仍可发挥作用，从而减少最终产物中未切割的受体质粒）；最后在 80 °C 热失活酶 20 分钟（80 °C 可使所有酶完全失活，终止反应）6。</li>
		<li>将 5 µL GG 反应产物加入 50 µL 化学感受态 E. coli 细胞中，按照先前发表的方案15进行热激转化，并包含恢复培养步骤。</li>
		<li>取 100 µL 转化后培养物涂布于含 100 µg/mL 链霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。37 °C 过夜培养。</li>
		<li>通过计数两个平板上的白色菌落数量，比较阴性对照与完整组装反应的转化效率。若组装反应的白色菌落数约为阴性对照的 10 倍或更多，则可进入下一步。 
		注：大多数转化菌落应为白色，仅少数为红色。用于 In-Cloning 工具包的受体质粒包含双重筛选元件，即 mCherry（Level 0 和 Level 1）或 LacZα（Level M 和 Level P），以及编码拓扑异构酶抑制剂的 ccdB 基因。GG 反应的转化在 ccdB 敏感型 E. coli 细胞中进行，因此只有成功组装质粒的细胞才能生长，而原始受体质粒无法增殖。常见的 ccdB 敏感菌株包括 DH5α 和 TOP10。mCherry/LacZα 可用于视觉识别逃逸 ccdB 机制的细胞16。</li>
		<li>对每次组装，挑取两个白色菌落，用移液枪头取少量菌落材料，分别重悬于 5 mL 含 100 µg/mL 链霉素的 LB 培养基中，37 °C、250 rpm 摇床过夜培养。按照制造商说明书进行柱式质粒提取。通过 Sanger 测序验证提取质粒是否具有预期序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 一级：位置的确定
注意：1级是指在驯化部件与组装多顺反子操纵子之间的层级（图2）。在此层级中确定中间组装片段在最终构建体中的位置。通过使用不同的1级接受质粒，可以改变1级组装在操纵子中的位置。此处给出的示例描述了双顺反子单元的组装，但该方案可轻松适用于最多六个编码序列（每个均带有核糖体结合位点）的组装。若需组装更多编码序列，则还需在P级和M级之间进行循环。通过P级与M级的迭代循环，单个操纵子中可组装的编码序列数量没有固定的上限。
<ol>
	<li>部件与受体质粒的选择
	<ol>
		<li>选择将要组装成转录单元的0级部件。至少应包括启动子、CDS（编码序列）和终止子。</li>
		<li>确定转录单元在操纵子中的组装位置。根据该位置选择合适的受体质粒。详见图2。 
		注：以构建双顺反子操纵子为例，共需7个DNA片段，分别组装为两个1级结构。其中启动子、第一个RBS、第一个CDS和终止子连接桥片段组装至pSL68；第二个RBS、第二个CDS和终止子组装至pSL69。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GG反应
	<ol>
		<li>进行GG反应时，加入每种所需插入片段各50 fmol、50 fmol受体质粒、1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶和1 µL SapI。用无核酸酶水补足至总体积10 µL。</li>
		<li>在PCR仪中运行以下程序：37 °C孵育3分钟和16 °C孵育4分钟，重复25个循环，随后在50 °C进行最终消化20分钟，最后在80 °C加热失活酶20分钟6。</li>
		<li>可选：向GG反应体系中加入0.5 µL SapI，在37 °C孵育1小时。 
		注：SapI的稳定性不如其他常用IIS型限制性内切酶。研究发现，在GG反应后增加一步SapI消化，可减少携带重新连接受体质粒的菌落数量。SapI有一个同裂酶BspQI，可能无需此最终消化步骤。</li>
		<li>取5 µL GG反应产物，转入50 µL化学感受态E. coli细胞中，进行热激转化，建议采用步骤1.2.3中的恢复培养步骤。</li>
		<li>取100 µL转化后培养物涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。</li>
		<li>对每个转化子，挑取两个白色菌落，用移液器吸头取少量菌落材料，分别重悬于5 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜。按照制造商说明书进行柱式质粒提取。</li>
		<li>通过BbsI限制性酶切验证正确组装，确认切出片段大小与预期插入片段大小一致。取1000 ng质粒DNA，加入1 µL相应的10x酶切缓冲液和1 µL BbsI，用无核酸酶水补足至总体积10 µL，37 °C孵育15分钟。</li>
		<li>将酶切后的质粒样品上样至1%琼脂糖凝胶，以100 V电泳35分钟。 
		注：可通过in silico（计算机模拟）酶切分析预期质粒，模拟琼脂糖凝胶电泳以预测结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. M 级：多顺反子操纵子的组装
注意：在此步骤中，正在组装多顺反子操纵子。以所示的双顺反子操纵子为例，两个一级插入片段被分别组装至第1和第2位点。因此，选择受体质粒pMA60。此外，还需要一个末端连接子。所有M级和P级受体质粒在第二个突出端均为GGGA。末端连接子用于连接插入片段与受体质粒，实现P级构建体向M级的组装，反之亦然。在将两个一级插入片段进行P级组装时，使用末端连接子pMA668，并将其置于第三即最终位置。图3展示了M级和P级的总体示意图以及克隆步骤的示意图。仅在M级（或P级）进行组装时，最多可克隆包含6个编码序列的操纵子（位置1–6）。第7位点由末端连接子占据。虽然可在操纵子中组装更多数量的编码序列，但这需要在M级（或P级）之间循环操作，本实验方案未对此进行描述。
<ol>
	<li>进行GG反应时，加入每种所需插入片段各50 fmol、50 fmol的受体质粒、1 µL的10x T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL T4连接酶和1 µL BbsI。用无核酸酶水补至总体积为10 µL。</li>
	<li>在PCR仪中运行以下程序：37 °C 3分钟和16 °C 4分钟，共50个循环；随后在50 °C进行最终消化20分钟，再于80 °C使酶失活20分钟6。</li>
	<li>将5 µL GG反应产物转入50 µL化学感受态E. coli细胞中，并按照步骤1.2.3的方法进行热激转化及恢复培养。</li>
	<li>取100 µL转化后菌液涂布于含100 µg/mL链霉素的LB琼脂平板上。37 °C过夜培养，若预期组装产物存在代谢负担或毒性，则在30 °C培养。</li>
	<li>对每个组装产物，挑取两个白色菌落进行培养。具体操作为：用移液器吸头蘸取菌落，接种至含100 µg/mL链霉素的5 mL LB培养基中，在250 rpm摇床中37 °C或30 °C过夜培养。按照制造商说明书进行柱式质粒提取。</li>
	<li>通过BsaI限制性酶切验证正确组装，检查切出片段大小是否与预期插入片段大小一致，操作方法同步骤2.2.7。 
	注意：构建体可能过长，无法通过Sanger测序完全验证。此时可通过全质粒测序确认，该服务可由多家测序服务提供商提供商业服务。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分子克隆可能耗时且繁琐，尤其是采用临时设计的克隆策略时。MoClo 工具包通过其模块化设计、分级组装以及高效的一锅法反应，可显著提升分子克隆效率。该方法依赖于Golden Gate连接反应实现DNA组装。由于采用标准化的黏性末端，分子元件文库可被重复使用并共享给其他研究者3,6。元件的可重用性使得构建混合或阵列化的多基因组合文库成为可能。例如，这有助于优化异源表达通路，以确定理想的启动子强度或酶的种类。该方法的标准化特性使其易于实现自动化，从而支持DNA的高通量组装。此外，In- &amp;#38; Out-Cloning MoClo 工具包中的Out-Cloning方案支持高效构建含有不同复制起点和筛选标记的受体质粒，使研究人员能够组装适用于其目标生物的质粒7。
此处使用了In- &amp;#38; Out-Cloning MoClo工具箱。<e...

分子克隆，即将重组DNA导入质粒等复制子中，是分子生物学的一项基础技术。近几十年来，DNA的构建与组装方法日益精密。如今，研究人员已能够利用合成的DNA构建完整的合成染色体，甚至合成基因组。1传统的分子克隆通常依赖于 特设的 克隆策略，且对于大型多基因构建体而言，可能耗时且成本高昂2近年来，Golden Gate（GG）克隆及其衍生的层级化模块化克隆（MoClo）工具包2,3 已成为实现高效、低成本DNA组装的流行解决方案。
IIS型限制性内切酶是一类识别定向（非回文）序列并在识别序列外进行切割的内切核酸酶4。因此，由切割产生的黏性末端序列不依赖于识别位点，而是可以人为设计选择4。此外，可将功能性的DNA片段（此处称为“元件”）设计为在切割后从待连接元件的末端去除识别位点2。Golden Gate（GG）克隆策略利用这一特性，实现了一步反应中高效地多片段DNA组装5。MoClo工具包基于GG克隆技术，旨在提供一种模块化且具有层级结构的多基因构建体组装方法。用于组装元件的黏性末端是标准化的，从而能够建立可重复使用且可互换的元件文库。MoClo工具包依赖于受体质粒，这类质粒经过工程化改造，可接受多个DNA序列，并释放最终组装产物。每个受体质粒包含两种不同IIS型酶的两个识别位点，其中一个用于接受DNA载荷，另一个用于释放组装好的DNA3,6。该原理的示意图见图1，展示的是将一个单独元件——终止子——克隆到MoClo受体质粒（0级）中的过程。受体质粒和插入片段均被限制性内切酶BbsI切割，产生互补的黏性末端，同时去除BbsI识别位点。正确连接后的质粒不再被BbsI切割。在后续组装步骤（1级）中，用IIS型酶SapI切割所获得的质粒，即可释放先前插入的片段。
在本实验方案中，使用了In- and Out-Cloning MoClo工具箱7。Level 0质粒包含定义好的基本遗传元件，例如带有5'非翻译区（UTRs）的启动子、编码序列以及带有3'UTR的终止子，图1展示了Level 0的示意图。在Level 1中，多个元件被组装成一个转录单元（TU），图2展示了Level 1元件及其克隆过程的示意图。In- and Out-Cloning MoClo利用IIS型限制性内切酶产生3个核苷酸的黏性末端，从而实现Level 1中无痕组装转录单元。这种方法使得黏性末端完全位于编码序列的密码子框架内，并利用ATG起始密码子和TGA终止密码子进行组装。Level M和Level P用于将来自Level 1质粒的多个转录单元进一步组装3,8。图3展示了克隆至Level M和P的元件示意图，以及在Level M中组装双顺反子操纵子的过程（双顺反子操纵子是一种可表达多个编码序列（CDSs）的转录单元）。Level P和Level M的设计允许两者之间进行迭代循环，因此理论上可组装的元件数量没有限制；但本方案未描述该迭代过程，因为本方案的主要目的是展示双顺反子操纵子的组装。尽管可组装的元件数量没有限制，但所构建载体的大小存在实际限制；已有研究使用MoClo试剂盒成功组装了长达100,000 bp的序列9。此外，过大的构建体或含有毒性基因的构建体可能对细胞造成负担；针对这些情况，已有改进的实验方案发表10。
内克隆与外克隆最初并未描述多顺反子转录单元的组装方案。多顺反子操纵子是细菌中非常常见的基因组织形式11,12,13，因此以模块化方式从头组装这类结构具有重要意义14。本文描述了一种利用内克隆与外克隆技术组装多顺反子操纵子的系统化方案。该方案可轻松交换多顺反子转录单元中编码序列的位置，也可用于包含单顺反子和多顺反子转录单元的复合组装。
以下分步方案展示了利用In-和 Out-克隆技术设计和克隆多顺反子操纵子的方法。文中介绍的多顺反子转录单元克隆策略可轻松适用于其他MoClo工具包。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Merck Life Science</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>细菌琼脂</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Mastercycler&amp;nbsp;Nexus 热循环仪</td><td>Eppendorf</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>EzDrop 1000 微量分光光度计</td><td>Blue-Ray Biotech</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 质粒小提试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In- &amp;amp; Out- Cloning Toolkit&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>连接酶缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova&amp;reg;&amp;nbsp;42/42R - 可堆叠培养摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>PhenoBooth+</td><td>Singer Instruments</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>壮观霉素</td><td>Merck Life Science</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>标准实验耗材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Thermomix MM</td><td>B. Braun Biotech International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

使用 in-cloning 工具包通过模块化克隆（moclo）标准化组装多顺反子操纵子

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

模块化克隆（MoClo）工具包能够实现多基因结构的快速组装。该技术基于Golden Gate克隆方法，利用IIS型限制性内切酶，这类酶在其识别位点之外进行切割。由于识别序列与切割序列相互分离，因此可人为设计由IIS型限制性内切酶产生的黏性末端，且克隆策略通常可防止正确连接的DNA片段被再次切割，从而实现在单个反应中高效组装多个DNA片段。在MoClo系统中，启动子、核糖体结合位点、编码序列和终止子等独立的功能性DNA元件，以及更高层级的组装单元，均被分配标准化的黏性末端，从而可构建可重复使用的元件文库。目前大多数用于细菌的MoClo工具包主要用于单顺反子转录单元的克隆，缺乏针对多顺反子操纵子系统化组装的有效方案。本实验方案展示了利用In- &amp;#38; Out-Cloning工具包组装多顺反子转录单元的方法，该策略同样可适用于其他MoClo工具包。

此处展示了从 Level 0 到 Level M 自下而上组装一个多顺反子操纵子的结果（图 S1）。该操纵子以启动子 PLuxB 起始，在诱导物 N-(β-酮辛酰基)-L-高丝氨酸内酯（OC6）存在的情况下，可被蛋白 LuxR 激活17。操纵子的第一个编码序列（CDS）为绿色荧光蛋白（GFP），其核糖体结合位点（RBS）为 iGEM BBa_B0064。GFP 后接一个非终止型连接序列，即“终止子桥”。第二个 RBS 由 RBS 计算器设计18，第二个编码序列为 mTurquoise。最后，操纵子以终止子 L3S2P21 结束19。
终结者装置的驯化 
为了组装设计的多顺反子操纵子，所有分子元件都需要在相应的受体质粒中进行驯化。通过退火两条寡核苷酸（见 表 S2）。寡核苷酸设计时包含4个核苷酸的突出端，以便插入p...

本文介绍了一种逐步操作方案，演示如何将模块化克隆（MoClo）技术应用于多顺反子操纵子的克隆。

使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

模块化克隆（Modular Cloning, MoClo）工具包可实现多基因载体的快速构建。该技术基于Golden Gate克隆方法，利用IIS型限制性内切酶……

我开发了能够从微小的单个分子元件开始，逐步组装出达到染色体规模的DNA构建体，并利用这些人造染色体对细胞进行重编程的方法。该领域的一项重要创新是模块化克隆工具包的建立，这类工具包能够从标准化分子元件库中实现多基因构建体的模块化组装。模块化克隆工具包通常被设计用于克隆单顺反子转录单元。本方案展示了一种利用原位克隆工具包组装多顺反子转录单元的通用方法。这种克隆多顺反子转录单元的策略使得编码序列能够灵活地用于单独的转录单元或多个顺反子排列中。首先，选择要组装成转录单元的0级元件。这些元件必须至少包含一个核糖体结合位点（RBS）、一个编码序列和一个终止子。选择转录单元在操纵子中的组装位置。根据所选位置，选择相应的受体质粒，并在SnapGene中模拟Golden Gate连接反应。在Golden Gate反应中，使用SAP1酶从各自的质粒上释放核糖体结合位点、编码序列和终止子，并将受体质粒切开。将核糖体结合位点、编码序列和终止子组装到被切割的受体质粒中。接下来进行Golden Gate反应时，使用移液器加入每种所需插入片段各50飞摩尔以及50飞摩尔的受体质粒。向反应管中各加入1微升10x T4 DNA连接酶缓冲液、T4连接酶和SAP1。然后加入无核酸酶水，使最终体积达到10微升。将反应管放入热循环仪中。在37摄氏度下运行25个循环，每个循环3分钟；16摄氏度下4分钟；50摄氏度下20分钟。然后在80摄氏度下加热20分钟以灭活酶。可选步骤：向GG反应中加入0.5 µL SAP1，于37摄氏度孵育1小时。将5 µL反应混合物移液至50 µL化学感受态E.coli细胞中。将离心管浸入42 °C水浴中30秒，进行热激转化，然后将离心管置于冰上2分钟。接着，将细胞在1 mL培养基中孵育1小时，以促进恢复。将100微升转化后培养物涂布于含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37摄氏度下倒置培养过夜。次日，使用接种环或移液器吸头挑取两个白色菌落。将每种接种物接种至5 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。在37°C、250 rpm条件下于摇床中过夜培养。按照生产商说明书进行质粒提取。加入1微升10x消化缓冲液和1微升BBS1，对1微克提取的血浆DNA进行消化。用无核酸酶水补至总体积为10微升，并进行孵育。随后将消化后的质粒加样到1%琼脂糖凝胶上，在100伏电压下电泳运行35分钟。然后对凝胶成像，确认质粒的正确组装。要组装一个 Level M 载体，需选择待组装的 Level 1 转录单元。通过使用酶 BBS1 释放第一个和第二个转录单元以及末端连接子，模拟 Golden Gate 组装过程。同时将受体质粒切开，然后将三个部分组装到受体质粒中，形成多顺反子转录单元。在一级质粒组装的阴性对照中（缺少终止子片段），未产生任何菌落，而完整反应组产生了292个白色菌落，无红色菌落。在37摄氏度下进行多基因构建体的组装时，若缺少第二个表达盒，则仅产生两个白色菌落，而完整组装组则产生9个大菌落和435个小菌落。在 30 摄氏度条件下，多基因组装的阴性对照产生了 4 个白色菌落，而完整反应组产生了超过 1,500 个菌落。对受体质粒 PMA60 进行 BSA1 酶切，得到预期的单一条带，大小为 5,500 个碱基对。对 24 个菌落的质粒进行 BSA1 酶切分析，结果显示 24 个中有 23 个显示出正确的酶切图谱，即在约 4,300 碱基对和 1,700 碱基对处出现两条带。荧光成像显示，在含有OC6诱导剂的平板上，菌落表现出强烈的绿色和青色荧光，而在无诱导剂的平板上，菌落的荧光极弱或无荧光。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用 In-Cloning 工具包对具有模块化克隆的多顺反子纵子（MoClo）进行标准化模块化组装

本视频介绍了BiFC-PALM技术——即光激活定位显微镜与双分子荧光互补技术的结合，用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。双分子荧光互补（BiFC）技术涉及将两种目标相互作用蛋白分别与两个荧光蛋白片段融合。当这两个蛋白发生相互作用时，荧光蛋白片段被拉近至彼此邻近的位置，从而能够结合并重建出具有功能的完整荧光蛋白。通过PALM技术，可在单分子水平上对细胞内单个荧光分子的荧光信号进行精确定位。...

双分子荧光互补偶联光激活定位显微镜技术

蛋白质复合物催化细胞内的关键功能。对许多重要复合物进行详细的功能和结构表征需要通过重组表达来实现。MultiBac 是一种杆状病毒/昆虫细胞表达系统，专为表达真核蛋白及其复合物而设计。MultiBac...

欧洲分子生物学实验室的 MultiBac 蛋白复合物生产平台

定制质粒的合成过程费时费力。本实验方案描述了使用吉布森组装克隆技术来减少定制DNA克隆所需的工作量和时间。该方案还能以与传统“剪切-粘贴”DNA克隆相似的成本，获得可靠的用于哺乳动物表达的带标签蛋白载体。...

利用Gibson组装技术构建在人延伸因子-1α启动子调控下表达FLAG标签蛋白的质粒载体

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。...

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。...

使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

本文介绍了一种在液体处理机器人上使用模块化克隆DNA组装方法实现模块化DNA“元件”组装的自动化工作流程。该方案采用一种直观的软件工具，用于生成组合式DNA元件文库的液体处理工作站移液清单，并通过两个液体处理平台进行了演示。...

模块化DNA器件的自动化机器人液体处理组装

本文介绍了一种实验方案，用于：i）利用CyanoGate模块化克隆工具包构建一种可自我复制的载体；ii）通过接合转移将该载体导入蓝细菌宿主；以及iii）使用酶标仪或流式细胞术对转基因蓝细菌菌株进行表征分析。...

利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

本实验方案旨在提供一份详细的分步指南，用于基于Golden...

使用模块化Golden Gate克隆技术快速组装多基因结构

本研究描述了一种无需克隆或使用活细胞，即可从合成基因片段制备大量（µg至mg级）DNA用于蛋白质筛选实验的方案。该方法首先对最小模板进行酶切消化并环化，随后通过等温滚环扩增进行扩增。扩增产物无需纯化即可直接用于无细胞表达反应。...

快速、基于酶促反应的方法：利用无细胞系统对微量线性模板进行扩增以实现蛋白质原型构建

在分子生物学实验课程中，采用基于课程的本科研究体验（CURE）模式，实施了一种可灵活调整的吉布森组装分子克隆模块。对学生学习成果的评估显示，完成CURE后，学生对分子克隆的理解程度和自信心均有提高，并成功克隆了用于天然产物生物合成研究的新型质粒。...

通过可灵活调整的分子克隆课程型本科研究实践提升学生学习成效

学习使用In-Cloning工具包进行模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子转录单元的方法。该方案为遗传工程研究提供了灵活的多基因构建组装流程。

使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

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