使用 In-Cloning 工具包对具有模块化克隆的多顺反子纵子（MoClo）进行标准化模块化组装
September 2nd, 2025
本文提出了一个分步协议，演示了模块化克隆（MoClo）如何适用于多顺反子纵子的克隆。
我开发了能够从小分子片段到染色体大小构造体模块化组装DNA的方法，并用这些人工染色体重新编程细胞。该领域的一项重要创新是开发了模块化克隆工具包，使得能够从标准化分子元件库中模块化组装多基因构造体。模块化克隆工具包通常设计用于克隆单顺电子转录单元。
该方案展示了一种可推广的多顺子转录单元组装方法，结合克隆内工具包。这种克隆多变电子转录单元的策略使编码序列能够灵活地用于单个转录单元或多变电子排列。开始时，选择准备组装成转录单元的0级部件。
这些条件必须至少包括一个RBS、一个编码序列和一个终端。选择转录单元在纵子中组装的位置。根据所选位置，选择对应的受体质粒，并在SnapGene中模拟金门组装。
在金门反应中，利用酶SAP1释放核糖体结合位点、编码序列和终止子，并切开受体质粒。将核糖体结合位点、编码序列和终止子组装到切割的受体质粒中。接下来进行金门反应，使用移液器加入每个所需插入片段的50个飞莫尔和50个受体质粒的飞莫尔。
将10毫升T4 DNA连接酶缓冲液、T4连接酶和SAP1各1微升注入反应管。然后加入无核酸酶水，最终体积达到10微升。把管子放进热循环器里。
运行25个周期，分别是37摄氏度三分钟，16摄氏度四分钟，50摄氏度20分钟。然后在80摄氏度加热使酶失活20分钟。可选，移液器向GG反应注入0.5微升SAP1，并在37摄氏度下培养一小时。
将5微升反应液移液器移入50微升的化学性能良好大肠杆菌细胞中。通过将管子浸入42摄氏度的水浴30秒，然后将管子冰敷两分钟，进行热冲击变换。接下来，将细胞浸泡在一毫升培养基中一小时以帮助恢复。
将100微升转化生长物的生长物镀在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB螺旋板上。将盘子在37摄氏度下孵化一夜。第二天，用接种环或移液器尖端采摘两个白色菌落。
将每个人接种到5毫升的LB培养基中，培养基含每毫升100微克。在摇晃的孵育箱中以每分钟250转的速度在37摄氏度下过夜孵育。按照制造商的说明进行格纹拔除。
通过添加1微升10倍消化缓冲液和1微升BBS1，消化1微克提取的血浆DNA。加入无核酸酶水，使总体积达到10微升并孵育。现在将消化后的质粒装入1%琼脂糖凝胶，并以100伏电泳35分钟。
然后对凝胶成像，确认质粒的正确组装。要组装一个 Level M 构造，选择要组装的 Level 1 转录单元。通过释放第一和第二转录单元以及末端连接子，使用酶BBS1模拟金门组装。
同时，切开受体质粒，然后将三部分组装成多顺子转录单元。1级质粒组装的负对照组缺乏终止酶，未产生菌落，而完整反应产生292个白色菌落，没有红色菌落。在37摄氏度下组装多基因构造体，去除第二个盒，仅产生两个白色菌落，而完整组装则产生了9个大型菌落和435个小菌落。
在30摄氏度时，多基因组装的负对照组产生了四个白色菌落，而完整反应则产生了超过1500个菌落。受体质粒PMA60的BSA1消化结果预期单带为5,500碱基对。通过BSA1消化24个菌落的质粒显示，24个中23个显示出两个条带的正确限制性模式，分别为约4,300碱基对和1,700碱基对。
荧光成像显示含有OC6诱导剂的板块群落中强烈的绿色和青绿色荧光，而无诱导剂的板则几乎没有或没有荧光。
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概述
本文介绍了一个分步骤的协议，展示了如何适应模块化克隆（MoClo）用于多顺反子操纵子的克隆。该协议允许从标准化分子部分组装多基因构建体。
关键研究组成部分
科学领域
- 模块化克隆
- 基因工程
- 分子生物学
背景
- 模块化克隆工具包能够组装转录单元。
- 传统方法专注于单顺反子转录单元。
- 该协议解决了多顺反子排列的需求。
- 编码序列的灵活性增强了基因工程应用。
研究目的
- 展示组装多顺反子转录单元的协议。
- 提供使用模块化克隆工具包的一般方法。
- 促进在各种排列中使用编码序列。
使用的方法
- 选择用于转录单元组装的0级部件。
- 利用内克隆工具包进行组装。
- 克隆过程的分步骤协议。
- 展示转录单元排列的灵活性。
主要结果
- 成功组装了多顺反子转录单元。
- 展示了编码序列排列的灵活性。
- 该协议可以适应各种遗传构建体。
- 增强了研究人员的模块化克隆能力。
结论
- 该协议为基因工程提供了一个有价值的工具。
- 模块化克隆可以有效用于多顺反子构建。
- 未来的应用可能扩展该方法在研究中的使用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized modular assembly of polycistronic operons using MoClo and the In-Cloning toolkit addresses a key bottleneck in synthetic biology and microbial engineering by enabling rapid, reproducible construction of multi-gene pathways. This capability enhances predictive confidence in pathway engineering and supports scalable library generation for early discovery and target validation. The approach is directly relevant to biopharma R&D teams seeking to accelerate design-build-test cycles and reduce mechanistic ambiguity in genetic construct assembly.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of multi-gene pathways for functional target validation.
- Supports biological de-risking by allowing flexible arrangement of coding sequences in operons.
- Facilitates predictive confidence in pathway-level genetic interventions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated polycistronic constructs for downstream screening workflows.
- Standardizes assembly processes, improving reproducibility and scalability of genetic libraries.
- Enables quantitative assessment of multi-gene expression outputs for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered operons with disease-relevant microbial models when applicable.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling modular construct reuse.
- Provides mechanistic de-risking for pathway-based therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This modular assembly method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling rapid prototyping from early hypothesis testing to lead construct identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven assembly and testing of multi-gene pathways.
- Screening: Delivers reproducible, standardized constructs for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via restriction digest and fluorescence imaging for construct verification.
- Translational Research: Facilitates adaptation of constructs for disease-relevant microbial systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable library of standardized parts and operon assemblies for future projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in multi-gene construct assembly.
- Operational Value: Streamlines workflows through standardization and modularity, supporting scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and efficient resource allocation in genetic engineering programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of engineered pathways and construct advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning and synthetic biology workflows.
- Needs access to Type IIS restriction enzymes, thermocyclers, and analytical tools such as gel electrophoresis and fluorescence imaging.
- Demands cross-team standardization of part libraries and assembly protocols.
- Adaptation across different microbial or eukaryotic systems may require toolkit customization.
- Efficiency and fidelity depend on precise part selection and reaction optimization as demonstrated in the protocol.
