优化小鼠肾小球系膜细胞的分离与纯化
2025年3月7日
本研究建立了一种优化的小鼠系膜细胞（MCs）分离方案及其 离体 细胞培养。这些细胞可多次传代、冻存、复苏和培养，且不会影响细胞生长或蛋白表达。
我们的研究重点之一是多发性骨髓瘤相关的肾功能损害。为了支持这项研究，我们已建立并优化了小鼠系膜细胞原代培养的实验方案。该实验所需设备易于获取，操作步骤简便可行。
获取靶细胞仅需两到三周时间。该技术有助于肾脏研究，并支持针对疾病模型中系膜细胞功能、治疗开发或信号转导研究的探索。为从小鼠中分离小鼠系膜细胞（MCs），首先对已适当实施安乐死的动物，使用剪刀和镊子无菌地取出肾脏，并将其置于培养皿中。
用 Earle 平衡盐溶液冲洗肾脏，然后用镊子仔细去除结缔组织和肾包膜。用手术刀将肾脏纵向切成两半。向培养皿中加入三到四毫升 I 型胶原酶溶液，并用塑料细胞研杵充分研磨组织。
用移液器将培养皿中的所有组织和溶液转移至一个15毫升离心管中。用1至2毫升I型胶原酶溶液冲洗培养皿，以确保组织完全转移。将离心管置于37摄氏度摇床中，以每分钟120转的速度振荡30分钟。
然后，向混合物中加入等体积的终止液或培养基一。用移液器将溶液从离心管中吸出，并通过100微米细胞滤网过滤。将滤液收集至50毫升离心管中。
将滤液通过40微米细胞筛，仅保留筛网上的细胞。用培养基反复冲洗细胞筛，以最大限度收集细胞。将收集到的细胞从筛网转移至新的50毫升离心管中。
在室温下以600g离心5分钟。离心后，根据所需的细胞密度将细胞重悬于细胞培养皿中。将培养皿置于37摄氏度、含95%空气和5%二氧化碳的细胞培养箱中。
沿培养皿内壁加入一到两毫升 PBS 以冲洗细胞。用移液器从皿底吸除全部 PBS，然后沿皿内壁加入 10 毫升培养基。当细胞融合度达到 80% 时（通常在 7 至 10 天内），用无菌 PBS 洗涤细胞两次。
向培养皿中加入0.25%胰蛋白酶溶液以消化细胞。将培养皿置于37摄氏度的培养箱中。当大多数细胞呈现圆形并从表面脱落时，加入等体积的培养基二终止胰蛋白酶消化。
在室温下以 600g 离心 5 分钟，然后将细胞重悬于培养基二中。本研究中分离的 MC 细胞表现出 α-SMA、纤连蛋白和波形蛋白的显著高表达。在培养基二中培养 10 天后，对纯化并培养的 MC 细胞进行免疫荧光染色显示，超过 95% 的细胞同时表达 α-SMA 和波形蛋白。
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概述
本研究致力于建立一种优化的小鼠系膜细胞（MCs）分离与培养方案，这些细胞对肾脏研究至关重要。该方法可在维持细胞生长和蛋白表达的同时，实现细胞的多次传代、冻存与复苏。
关键研究组成部分
研究领域
- 与多发性骨髓瘤相关的肾功能损害
- 肾病模型中系膜细胞的功能研究
- 治疗开发与信号转导研究
背景
- 系膜细胞在肾脏健康中的重要性
- 分离和培养这些细胞所面临的挑战
- 建立可靠实验方案的必要性
使用方法
- 涉及胶原酶消化的分离技术
- 小鼠模型系统
- 在受控条件下进行细胞培养
主要结果
- 培养的系膜细胞中α-SMA、纤维连接蛋白和波形蛋白高表达
- 成功分离并验证了最佳生长条件
- 该方法为深入的肾脏研究提供了可靠的工具
结论
- 该研究展示了一种有效培养小鼠系膜细胞的方法，为肾脏研究提供了宝贵的技术手段。
- 它加深了对系膜细胞在肾脏病理过程中作用的理解。
常见问题
行业重要性概述
高效分离和纯化小鼠肾小球系膜细胞（MCs）可直接支持肾脏病学的早期研究和疾病建模。该优化方案能够快速获得高纯度的MCs，从而在肾脏病理生物学中实现可靠的靶点验证和机制研究。该方法缩短了实验周期，提高了可重复性，增强了下游治疗发现的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可快速生成原代足细胞培养物，用于对肾相关通路进行假设驱动型研究。
- 支持在肾小球生物学中对疾病相关靶点进行功能验证。
- 通过提供稳定的细胞材料用于通路分析，有助于实现机制层面的风险评估。
- 提高早期肾病模型的预测可靠性。
筛选与检测方法开发
- 为检测方法开发和化合物筛选提供标准化、高纯度的MCs。
- 确保细胞表型可重复，且α-SMA和波形蛋白（vimentin）高表达。
- 支持规模化生产，保证批次间一致性，适用于筛选工作流程。
- 降低定量检测结果的变异性，实现可靠的化合物评估。
转化与临床前研究
- 将体外微血管模型与疾病相关的肾脏病理对齐，以支持转化医学研究。
- 支持肾脏病学研究流程中从发现到临床前验证的连续性。
- 基于可靠的细胞数据实现风险调整后的推进决策。
- 为肾小球疾病背景下的生物标志物探索提供平台。
流程与工作流整合
该方案将MC的分离置于早期发现与临床前研究的交汇点，从而在肾脏疾病项目中实现从靶点验证到先导物发现的无缝衔接。
- 发现生物学：加速肾小球研究中的假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、即用型的系膜细胞（MCs），用于定量筛选平台。
- 分析：支持检测蛋白表达（如α-SMA、波形蛋白），以进行不同条件间的比较。
- 转化研究：将体外研究结果与临床前肾脏模型衔接，实现生物标志物的对应。
- 企业级复用：建立可在肾脏病学项目间通用的系膜细胞分离工作流程。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肾脏靶点研究的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：标准化系膜细胞的分离，实现在研发工作流程中的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：加快肾脏病项目组合中“推进/终止”决策进程，提升资本使用效率。
- 组合影响：支持基于风险调整的肾脏疾病项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备原代细胞分离和无菌操作技术的专业知识。
- 需要能够使用标准的细胞培养和分析仪器设备。
- 要求跨团队标准化操作，以确保细胞表型和蛋白表达的可重复性。
- 可适用于多种小鼠模型，但用于其他物种时可能需要优化条件。
- 依赖于酶消化和纯化步骤的一致性操作。
