Name: 体内研究 使用酵母中的生物发光报告基因监测代谢转变过程中的转录活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 了解如何使用生物发光报告基因在酵母中实时监测葡萄糖向麦芽糖转变过程中的转录活性变化。该方法利用Saccharomyces eubayanus优化工业发酵效率并开发新型拉格酵母菌株。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本研究由智利国家研发署（ANID）FONDECYT项目（1220026）、ANID-千年科学倡议项目ICN17_022和NCN2024_040资助。FM获得ANID FONDECYT博士后基金N°3220597的支持。PQ获得ANID基金N°21201057的支持。同时感谢卓越科技研究中心ANID基础资助项目FB210008及生命科学与研究中心（Centro Ciencia &amp;#38; Vida）提供的财政支持。

1. 附加体质粒报告系统的构建
注意：我们根据酵母文献选择了一个报告基因的调控区，用于构建附加体质粒以监测麦芽糖的消耗6,11,12。候选报告基因的启动子被定义为位于候选开放阅读框（ORF）上游、紧邻其上游相邻ORF侧翼核苷酸之间的调控序列。该区域通过PCR从S. eubayanus CBS12357T参考菌株的基因组DNA中扩增获得10。该方法可确保高保真地构建适用于下游应用的附加体质粒，包括研究酵母中其他有趣的生理条件。
<ol>
	<li>设计DNA片段及重叠引物，使片段之间包含30个核苷酸的配对序列，以通过酵母同源重组克隆实现无缝连接13 (图1）。参见 补充表 S1 引物序列。</li>
	<li>为避免突变，扩增启动子区域（见上文）以及去稳定化的荧光素酶（LUC-PEST）和 hphMX 盒式载体1 使用高保真DNA聚合酶（具体操作步骤参见聚合酶生产商的说明书）。将PCR仪程序设为：98 °C 预变性10 min；随后进行30个循环，每个循环包括98 °C 变性、60 °C 退火和72 °C 延伸；最后在72 °C 延伸10 min以完成反应。 
	注意：使用酵母穿梭质粒作为PCR模板时，建议对扩增产物进行DpnI消化处理（参见酶生产商的说明书），以消除可能干扰酵母转化的痕量模板质粒。</li>
	<li>消化 pRS426 质粒14 使用 EcoRI 和 XhoI 限制性内切酶对载体进行酶切，使其在多克隆位点处线性化，从而制备用于重组的载体（参见酶生产商的说明书）。</li>
	<li>将线性化的 pRS426 载体与扩增的 DNA 片段混合，并将混合物转化入 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 使用酵母同源重组克隆的BY474113,15 使酵母的同源重组系统能够组装质粒构建体 体内.</li>
	<li>将转化后的酵母涂布于缺乏尿嘧啶的合成完全培养基（SC-URA）上，以筛选含有新构建载体的营养缺陷型转化子 pRS426- MAL32-LUC-hphMX 质粒</li>
	<li>使用酵母质粒小提试剂盒，按照生产商说明书提取酵母中的质粒，并将提取的质粒转化至 大肠杆菌 DH5α以扩增该构建体用于进一步分析。</li>
	<li>通过PCR筛选细菌菌落，以确认载体构建的正确组装。</li>
	<li>使用标准质粒纯化试剂盒纯化质粒DNA，并进行Sanger测序以验证所构建质粒的完整性和序列。</li>
</ol>
2. 酵母菌株的转化
注意：酵母转化方案改编自先前建立的 S. eubayanus16 方法，并已成功应用于其他 Saccharomyces 属物种及发酵酵母菌株。本方案源自 Gietz 实验室建立的传统酵母转化方法15。该方法可在多种实验条件下实现高效的质粒整合与筛选，为转化不同酵母菌株提供了一种可靠且灵活的技术手段。该方法可确保在潮霉素压力下稳定筛选并维持附加体质粒的存在。
<ol>
	<li>在5 mL YPD培养基（1% w/v 酵母提取物，2% w/v 蛋白胨，2% w/v 葡萄糖）中，于20 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养新长出的单个酵母菌落。</li>
	<li>将培养物用新鲜YPD培养基稀释至OD620为0.2，于20 °C、200 rpm振荡培养至对数中期（OD620 0.4–0.6）。根据酵母菌株不同，通常需要3–4小时。</li>
	<li>在室温下以21,380 × g 离心1分钟收集细胞，弃去上清液，并用无菌水将沉淀洗涤3次。</li>
	<li>将洗涤后的细胞重悬于100 µL 0.1 M醋酸锂溶液中，按步骤2.3所述条件离心，重复该过程2次。</li>
	<li>按以下顺序向细胞中加入各组分：240 µL 50% w/v PEG-4000、35 µL 1 M LiAc、5 µL 质粒DNA（100 ng/µL）、20 µL 单链载体DNA（ssDNA，预先于98 °C加热10分钟）。轻轻混匀，使转化混合物均匀。</li>
	<li>于20 °C孵育30分钟，随后在34 °C进行55分钟热激。热激后加入38 µL 100%乙醇，终浓度接近0.1%，并在34 °C继续孵育5分钟。 
	注：本方案所用温度针对从温带森林分离的耐冷酵母菌株Saccharomyces eubayanus进行了优化。 
	使用100%乙醇可诱导细胞应激，从而提高转化效率。</li>
	<li>向转化后的细胞中加入600 µL YPD培养基，按步骤2.3所述条件离心，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于600 µL新鲜YPD培养基中，于4 °C静置过夜，以促进细胞恢复。</li>
	<li>将转化后的细胞涂布于添加200 µg/mL潮霉素的YPD琼脂平板上，于20 °C–30 °C培养48–72小时。</li>
	<li>从转化平板上挑选10–12个菌落，重新划线接种至含200 µg/mL潮霉素的YPD琼脂平板上，以确认质粒的存在，并制备所选菌落的混合菌块用于后续实验。</li>
</ol>
3. 发光的验证
注意：为了验证发光报告基因的功能，将转化后的菌株置于可诱导荧光素酶报告基因差异表达的条件下进行检测。该逐步验证方法可用于评估报告基因在糖浓度波动条件下的功能表现，并利用发光检测技术的稳定性实时捕捉代谢响应。
<ol>
	<li>从转化后的酵母菌株菌落中挑取样品，接种至含有5% w/v葡萄糖和200 µM潮霉素的YP培养基（1% w/v酵母提取物，2% w/v蛋白胨）中，在25 °C下静置培养24小时。以1:10比例转接到新鲜培养基中，相同条件下继续培养24小时。</li>
	<li>用不含糖的YP培养基洗涤细胞，并以1:10比例接种至检测培养基中。检测培养基中添加荧光素，终浓度为3 mM，同时含有200 µM潮霉素以维持质粒稳定性。</li>
	<li>进行混合糖生长测试时，使用葡萄糖-麦芽糖组合矩阵，YP培养基中葡萄糖浓度分别为0%、0.5%、1%、2%（w/v），麦芽糖浓度分别为0%、2%、5%、10%、20%、30%（w/v）。每种条件均添加荧光素（终浓度3 mM）和200 µM潮霉素。将200 µL培养液加入96孔板的每个孔中（图2）。</li>
	<li>使用发光仪酶标仪每30分钟检测一次发光信号和OD620，持续72小时，检测时无需衰减，积分时间为1秒，以确保持续监测报告基因活性和细胞密度。</li>
</ol>
4. 发酵取样与发光监测
注意：转化菌株在受控的微发酵条件下进行培养，以评估发酵过程中发光活性的变化。这能够比较不同发酵条件下发光活性的差异，从而深入了解酵母在长期发酵过程中的代谢响应。
<ol>
	<li>通过将麦芽提取物溶解于水中，配制麦芽提取物培养基（12 °Plato），并在 100 °C 下灭菌 20 分钟。接种前使培养基冷却至室温。</li>
	<li>在 20 °C、200 rpm 振荡条件下，将转化后的酵母菌株在 5 mL YPD 培养基（1% w/v 酵母提取物，2% w/v 蛋白胨，2% w/v 葡萄糖）中预培养 24 小时。将预培养物转移至 50 mL 麦芽提取物培养基中，在 20 °C、200 rpm 振荡条件下继续培养 24 小时。</li>
	<li>在室温下以 21,380 × g 离心 1 分钟收集细胞，并重悬细胞，用于在 12 °Plato 麦芽提取物培养基中进行三份平行的 50 mL 微型发酵实验9。为提高发酵性能，向培养基中添加 0.3 mg/L ZnCl2。</li>
	<li>为确保各重复组间细胞密度一致，使用以下公式计算接种体积： 
	接种体积 = (1.5 × 106) × 体积 (mL) × Plato 度数</li>
	<li>接种已配制的培养基后，在 20 °C 静置培养 14 天。通过每日记录 CO2 损失量来监测发酵进程。每天同时称量容器重量，以累积重量损失作为 CO2 生成的指标。</li>
	<li>进行发光检测时，定期从每个微型发酵体系中取样 200 µL。向样品中加入荧光素，使其终浓度达到 3 mM，并使用无衰减模式、积分时间为 1 秒的发光仪酶标仪测定发光强度和 OD620。在整个发酵期间按预定时间间隔进行测定（图 3）。</li>
</ol>

<ol><li>Salinas, F., Rojas, V., Delgado, V., López, J., Agosin, E., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+light-oxygen-voltage+domains+for+optogenetic+control+of+gene+expression+and+flocculation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Fungal light-oxygen-voltage domains for optogenetic control of gene expression and flocculation in yeast.</a> mBio. 9 (4), e00626-e00718 (2018).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Perez-Samper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+Effect+shapes+the+Saccharomyces+cerevisiae+lag+phase+during+the+switch+between+different+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The Crabtree Effect shapes the Saccharomyces cerevisiae lag phase during the switch between different carbon sources.</a> mBio. 9 (5), e01331-e01418 (2018).</li>
<li>Vermeersch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+duration+of+the+microbial+lag+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">On the duration of the microbial lag phase.</a> Curr Genet. 65 (3), 721-727 (2019).</li>
<li>New, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+catabolite+repression+optimize+growth+in+stable+and+variable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Different levels of catabolite repression optimize growth in stable and variable environments.</a> PLoS Biol. 12 (1), e1001764(2014).</li>
<li>Molinet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+diauxic+shift+between+Patagonian+Saccharomyces+eubayanus+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Natural variation in diauxic shift between Patagonian Saccharomyces eubayanus Strains.</a> mSystems. 7 (6), e0064022(2022).</li>
<li>Libkind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+domestication+and+the+identification+of+the+wild+genetic+stock+of+lager-brewing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (35), 14539-14544 (2011).</li>
<li>Peris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+ancestries+of+lager-brewing+hybrids+were+shaped+by+standing+variation+in+the+wild+yeast+Saccharomyces+eubayanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex ancestries of lager-brewing hybrids were shaped by standing variation in the wild yeast Saccharomyces eubayanus.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006155(2016).</li>
<li>Mardones, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+beer+wort+fermentation+diversity+across+natural+Saccharomyces+eubayanus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of beer wort fermentation diversity across natural Saccharomyces eubayanus isolates.</a> Microb Biotechnol. 13 (4), 1012-1025 (2020).</li>
<li>Brickwedde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((physiological+and+regulatory+analysis+of+maltose+transporter+genes+in+Saccharomyces+eubayanus+CBS+12357T%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">physiological and regulatory analysis of maltose transporter genes in Saccharomyces eubayanus CBS 12357T.</a> Front Microbiol. 9, 1786(2018).</li>
<li>Brouwers, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recombination+of+Saccharomyces+eubayanus+maltose-transporter+genes+yields+a+chimeric+transporter+that+enables+maltotriose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo recombination of Saccharomyces eubayanus maltose-transporter genes yields a chimeric transporter that enables maltotriose fermentation.</a> PLoS Genet. 15 (4), e1007853(2019).</li>
<li>Meurer, M., Chevyreva, V., Cerulus, B., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatable+MAL32+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+characteristics+and+tools+to+facilitate+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The regulatable MAL32 promoter in Saccharomyces cerevisiae: characteristics and tools to facilitate its use.</a> Yeast. 34 (1), 39-49 (2017).</li>
<li>Mashruwala, A. A., Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+plasmids+using+yeast+recombinational+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of plasmids using yeast recombinational cloning.</a> Methods Mol Biol. 1373, 33-41 (2016).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Baker, E. P., Hittinger, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+novel+chimeric+maltotriose+transporter+in+Saccharomyces+eubayanus+from+parent+proteins+unable+to+perform+this+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution of a novel chimeric maltotriose transporter in Saccharomyces eubayanus from parent proteins unable to perform this function.</a> PLoS Genet. 15 (4), e1007786(2019).</li>
<li>Nespolo, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Out-of-Patagonia+migration+explains+the+worldwide+diversity+and+distribution+of+Saccharomyces+eubayanus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An Out-of-Patagonia migration explains the worldwide diversity and distribution of Saccharomyces eubayanus lineages.</a> PLoS Genet. 16 (5), e1008777(2020).</li>
<li>Hohnholz, R., Pohlmann, K. J., Achstetter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+plasmid+architecture+on+stability+and+yEGFP3+reporter+gene+expression+in+a+set+of+isomeric+multicopy+vectors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impact of plasmid architecture on stability and yEGFP3 reporter gene expression in a set of isomeric multicopy vectors in yeast.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 101 (23-24), 8455-8463 (2017).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+efficient+expression+using+heterologous+GAL+promoters+and+transcriptional+activators+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering an efficient expression using heterologous GAL promoters and transcriptional activators in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synth Biol. 12 (6), 1859-1867 (2023).</li>
<li>Calvey, C. H., Willis, L. B., Jeffries, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transformation+protocol+for+Lipomyces+starkeyi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">An optimized transformation protocol for Lipomyces starkeyi.</a> Curr Genet. 60 (3), 223-230 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究展示了利用游离型生物发光报告系统在代谢转换条件下监测S. eubayanus转录激活的有效性。通过采用MAL32作为转录报告基因11，我们能够实时追踪关键的代谢转变过程，为理解菌株特异性适应机制提供了可靠的研究框架。该报告系统因其在麦芽糖代谢中的作用而被选用，在评估酵母代谢灵活性方面具有显著优势，例如可实现活体（in vivo）监测、精确识别代谢转换节点，以及对不同遗传背景菌株进行详细的表型表征。在混合糖条件下的实验显示，所测试的S. eubayanus菌株在报告基因激活方面表现出显著差异，凸显了该物种内部的表型多样性。这种差异很可能由MAL基因转录激活相关的遗传差异所驱动，表明野生型S. eubayanus菌株具有作为资源用于发掘可提升工业发酵性能性状的潜力。值得注意的是，来自巴塔哥尼亚地区的S. eubayanus分离株表现出最高的遗传多样性，在单一地理区域内包含多个谱系6,<sup c...

酵母等微生物必须不断适应动态变化的环境条件，以维持其适应性并存活1。这些适应过程通常涉及复杂的基因调控回路，该回路整合多种胞外信号，以协调精确的代谢响应2,3。在工业环境中，这些代谢转换的效率至关重要，尤其是在发酵过程中，任何干扰都可能导致产量不理想或发酵不完全3。其中一项关键的代谢挑战是细胞从优先利用的碳源转向次级碳源的过程，例如从葡萄糖转为麦芽糖。该过程会引发一个滞后期，在此期间，负责次级碳源代谢的基因被去阻遏，从而恢复细胞生长4,5。
在啤酒酿造过程中，Saccharomyces 酵母必须高效地从葡萄糖代谢转变为麦芽糖代谢。特别是拉格酵母的耐冷亲本种 S. eubayanus，在适应此类代谢转换的能力方面表现出显著的表型变异6。来自巴塔哥尼亚等地的野生分离株通常表现出较长的滞后期和较慢的麦芽糖消耗速率，相比之下，经过选育的驯化菌株则具有优化的发酵能力7,8。尽管驯化菌株已适应高效发酵混合糖环境，野生菌株往往表现出较慢的代谢转换，这可能归因于更强的葡萄糖阻遏作用以及 MAL 位点调控的不稳定性6,9。
本研究利用了自然变异性 S. eubayanus 作为研究葡萄糖-麦芽糖条件下代谢适应的模型，利用游离型不稳定荧光素酶报告系统监测基因表达 体内，通过检测发光信号1. 所选的报告基因 MAL32 编码一种麦芽糖酶蛋白，该酶在葡萄糖向麦芽糖转换过程中对麦芽糖的分解代谢具有关键作用10,11。值得注意的是， MAL32 启动子是评估葡萄糖耗尽后麦芽糖代谢诱导的成功标志物12通过引入该报告系统，我们旨在阐明菌株特异性的适应机制，并鉴定出优化发酵性能的潜在靶点。此外，本方案可拓展至酿造以外的领域，在生物技术和环境研究中具有应用价值，特别是在复杂糖类环境发挥重要作用的场景中。理解波动环境响应的遗传与调控决定因素 S. eubayanus 增进我们对酵母生理学的认识，支持开发适用于多种工业和科研应用的强健菌株。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td></td></tr><tr><td>L-荧光素</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-127-10</td><td></td></tr><tr><td>一水合麦芽糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47288</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Plus PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F631S</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO M</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I</td><td>Zymo Research</td><td>D2001</td><td></td></tr></tbody></table>

体内利用酵母生物发光报告系统监测代谢转换过程中的转录活性

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

顺序利用糖类，即从优先利用的糖源转向较不优先的糖源，是酵母中一种关键的代谢适应机制，对于在波动环境（如啤酒发酵过程中所处的环境）中的生存尤为重要。然而，糖类转换作为一种环境变量，难以预测和检测，会影响啤酒发酵的结果。本方案描述了一种 体内 监测与葡萄糖-麦芽糖代谢转换相关的转录激活的系统 Saccharomyces eubayanus 适用于不同野生 酿酒酵母 酵母菌株 
该系统采用一种基于游离型生物发光转录报告基因的方法来检测麦芽糖代谢，重点关注MAL32，因为其在S. cerevisiae中的研究已表明能有效反映代谢状态的转变。为此，将酵母菌株转化含有来自S. eubayanus的MAL32调控区的质粒，该调控区控制一种编码不稳定型萤火虫荧光素酶的基因表达1，同时携带一个仅在转化过程中用于筛选、确保质粒成功导入的潮霉素抗性基因。在完成筛选后，转化后的酵母细胞可在非选择性条件下培养，因为该游离型质粒在培养条件下可稳定维持长达7天。
该系统在微发酵实验的复杂糖环境中得到验证，证实了荧光素酶报告基因在反映代谢转换方面的有效性。定期采集样品并使用发光仪进行分析，持续监测酵母的响应情况。尽管该方案具有广泛的适用性，但在评估酵母在发酵条件下的性能方面尤为有价值，因为在这些条件下代谢变化构成了重大挑战。此外，通过选择不同的启动子，该方法可被进一步拓展，以研究酵母对环境变化的更广泛响应，从而实现对野生酵母菌株的表征及其在多种工业应用中的优化。

以下结果展示了新构建的发光报告系统在发酵过程中监测酵母细胞由葡萄糖向麦芽糖转换的可用性。报告质粒最初通过酵母同源重组克隆技术进行组装。13 用于生成附加体型报告基因载体。该过程要求不同扩增片段之间至少有30个核苷酸的序列重叠，如图所示。 图1. 包含ATG基因起始位点上游858 bp的调控区域 MAL32 从基因组DNA中使用以下方法扩增 S. eubayanus 菌株 CBS12357T7。该 S. eubayanus 基因组包含两个功能性 MAL32 基因，编码于完整基因组中 MAL 染色体V和XVI上的位点11. 根据文献11，我们选择了后者的启动子用于我们的附加体质粒报告系统。不稳定的荧光素酶ORF和 hphMX 从先前报道的质粒 pRS426- 中扩增...

本方案采用一种生物发光报告基因，可实现对转录活性的检测 Saccharomyces eubayanus 监测葡萄糖到麦芽糖的转变，实现对代谢适应性的实时分析，并支持在不同条件下工业发酵菌株的优化。

从偏好性较高的糖源依次转向偏好性较低的糖源的顺序性糖消耗，代表了酵母中一种关键的代谢适应机制，该机制……

我们的研究或主要研究方向是微生物多样性、系统发育基因组学及发酵应用，尤其侧重于酵母多样性、适应性及其在酵母生物学工业应用中的研究。具体到应用层面，我们研究酵母的发酵效率、风味物质产生以及抗逆性。因此，我们最近的研究进展主要涉及酵母的系统发育基因组学，特别是来自巴塔哥尼亚地区的酵母。然后我们利用这一方法培育新型拉格酵母用于啤酒发酵，同时也在开发用于低酒精啤酒的新型酵母。总体而言，我们结合多种组学技术与实验进化方法，开发适用于生物工程应用的新型酵母。目前我们正在采用多种技术，如基因组测序、长读长基因组测序以及转录组学。然后，我们综合这些信息，对我们所拥有的不同菌株进行实验性进化，接着尝试利用CRISPR技术或不同的酵母转化技术来验证某些基因组变化，从而深入探究酵母对发酵环境的分子适应机制。因此，我们面临两大挑战：一是培育能够高效进行啤酒发酵的新型拉格酵母，另一个则完全相反。我们希望获得能够生产低酒精啤酒的新菌株，特别是来自巴塔哥尼亚地区的菌株。我想重点介绍我们实验室取得的两项主要成果：其中之一是，我们确定了拉格酵母的母本——真贝酵母（Saccharomyces eubayanus）起源于巴塔哥尼亚地区。目前，我们还培育出了数十种用于啤酒发酵的新型拉格酵母杂交菌株。我认为这两项是本研究的主要发现。首先，从一个转化后的酵母菌株菌落中挑取样本，接种到含有5%葡萄糖和200 µM潮霉素的酵母蛋白胨培养基中。在25摄氏度下静置培养24小时。用新鲜培养基以1:10的比例稀释，重新接种后继续培养24小时。用无糖酵母蛋白胨培养基洗涤细胞，然后以1:10的比例接种至测试培养基中。向测试培养基中添加荧光素，使其终浓度为 3 毫摩尔，并加入 200 微摩尔潮霉素以维持质粒稳定性。进行混合糖生长测试时，使用葡萄糖-麦芽糖梯度，在酵母膏蛋白胨培养基中逐步增加葡萄糖和麦芽糖的浓度。将 200 微升培养物加入 96 孔板的每个孔中。现在使用发光仪微孔板读数仪每30分钟测量一次72小时内的发光强度和620纳米处的光密度。将积分时间设置为1秒，并关闭衰减，以确保持续监测报告基因活性和细胞密度。进行发酵取样和发光监测时，首先将麦芽提取物溶于水中，以制备麦芽提取物培养基。将转化后的酵母菌株在5毫升YPD培养基中于20摄氏度、200转/分钟振荡条件下预培养24小时。将预培养物转接至50毫升麦芽提取物培养基中，然后在20摄氏度、200转/分钟振荡条件下继续培养24小时。在室温下以21,380 ×g离心1分钟，收集菌体。然后将细胞重悬于麦芽提取物培养基中，置于12孔板中进行三组平行实验，每组进行50毫升的微发酵。在培养基中添加0.3毫克/升的氯化锌以增强发酵性能。计算接种量体积，以确保各重复组之间的细胞密度一致。将计算好的接种量接种至已准备好的培养基中。随后将培养物置于20°C条件下静置培养14天。通过每

in-vivo-monitoring-transcriptional-activity-during-metabolic

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

体内研究 使用酵母中的生物发光报告基因监测代谢转变过程中的转录活性

本文描述了在转移性乳腺癌细胞生长和转移过程中，对其表达的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的生物发光反应进行构建、可视化及定量的方法。 体内.

体内 双底物生物发光成像

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。...

利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们描述了两种基于GFP的比率型遗传编码生物传感器的使用方法，用于在活酵母细胞中以亚细胞分辨率监测线粒体氧化还原状态和ATP水平。...

测量活酵母细胞中线粒体氧化还原状态和ATP的比率型生物传感器

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。...

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

本实验方案描述了一种快速构建人工转录因子（ATFs）及其相应GFP报告系统的实验方法 并通过流式细胞术定量分析ATF刺激GFP表达的能力。...

基于GFP报告系统的化学激活型转录因子的快速合成与筛选

本文描述了一种在模式生物 Caenorhabditis elegans 中 in vivo...

一种可筛选的 在体 内 使用转基因生物发光技术检测线粒体调节剂的实验方法 秀丽隐杆线虫

一个 体外 利用生物发光检测法测定乳腺上皮细胞中细胞昼夜节律。该方法采用哺乳动物细胞报告质粒，其在特定启动子调控下表达不稳定型荧光素酶。 PERIOD 2...

体外 生物发光检测法用于表征乳腺上皮细胞中的昼夜节律

本文介绍了一种利用RNA-seq技术监测S.

测量酵母 S. cerevisiae 缺氧应答过程中 mRNA 水平随时间的变化

神经干细胞/前体细胞表现出Notch信号通路组分的多种表达动态，从而导致细胞事件的不同结果。此类动态表达可通过高灵敏度的生物发光成像系统进行实时监测，而非静态分析，从而实现对基因表达快速变化的可视化观察。...

实时生物发光成像监测小鼠神经发生过程中Notch信号动态变化

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外...

利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

了解如何使用生物发光报告基因在酵母中实时监测葡萄糖向麦芽糖转变过程中的转录活性变化。该方法利用Saccharomyces eubayanus优化工业发酵效率并开发新型拉格酵母菌株。

体内利用酵母生物发光报告系统监测代谢转换过程中的转录活性

探索更多视频