小胶质细胞线粒体提取用于糖链分析

总体而言，我们的研究重点是确定糖类（即糖链）的分子机制作用，以及如何利用细胞和亚细胞水平的糖基化通路来研究衰老及脑部疾病。目前，在不同疾病的病理生理过程中，关于亚细胞糖链的作用及其调控机制仍存在知识空白，包括中风和阿尔茨海默病等急性和慢性脑部疾病。本实验方案及我们的研究旨在推进对糖链在神经免疫相互作用中作用的认识，并探索如何利用这些信息来设计更有效、更优化的中枢神经系统治疗策略。

[旁白] 首先，获取来源于 C57BL/6 小鼠的 BV-2 小胶质细胞。使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素和 1% 非必需氨基酸的 DMEM 低糖培养基进行培养。将细胞在 T175 培养瓶中培养至融合度达到 70% 至 80%。吸除培养瓶中的培养基。用 1 毫升培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝对细胞进行计数。将细胞在 2 毫升微量离心管中以 500 × g 离心 5 分钟。小心吸除并弃去上清液。加入 800 微升线粒体分离试剂 A，以中等速度涡旋 5 秒。然后将离心管精确地在冰上孵育 2 分钟。加入 10 微升线粒体分离试剂 B，以最大速度涡旋 5 秒。在冰上孵育 5 分钟，每隔 1 分钟以最大速度涡旋一次。接着加入 800 微升线粒体分离试剂 C，倒置离心管以混匀。在 4°C 下以 700 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的 2 毫升离心管中，在 4°C 下以 3,000 × g 离心 15 分钟。将含有胞质组分的上清液转移至新管中。沉淀物即为分离得到的线粒体。向沉淀中加入 500 微升线粒体分离试剂 C，以 12,000 × g 离心 5 分钟。用 50 微升蛋白提取缓冲液重悬分离得到的线粒体。将悬液置于冰上孵育 20 分钟。吹吸混匀 3 次，再次置于冰上孵育 20 分钟，使用前涡旋混匀。若未完全溶解，可再加入 50 微升缓冲液，并合并至同一管中。以 13,000 × g 离心 10 分钟。回收上清液并冷冻后，使用真空浓缩仪干燥。为检测释放的糖链，将干燥并连接的糖链用 50 微升 LCMS 级水重悬。取 5 微升重悬的线粒体糖链样品，移液至聚四氟乙烯微孔玻片的样品位点上。使用电喷雾溶剂（含 60% 乙腈和 1 毫摩尔/升乙酸）在负离子模式下进行离子化和检测，流速为 2 微升/分钟，电压为 3.2 千伏。将 IR-MALDESI 与高分辨准确质量（HRAM）质谱仪联用，设定分辨率为在质荷比 200 处半峰全宽 240,000，用于在负离子模式下分析质荷比 500 至 2,000 范围内的离子。通过搜索单一同位素质量手动鉴定 N-连接糖链。利用质荷比间隔分析同位素分布，以确认双电荷和三电荷离子，离子通量阈值不低于每秒 1,000 个离子。将原始质谱数据中的质荷比转换为中性单一同位素质量。然后将单一同位素质量上传至在线寡糖结构预测工具，以确定可能的糖链组成。使用实验验证的糖组学数据库确认注释结果。确保每项鉴定的质量测量误差在 2.5 ppm 以内，包含核心及连接的糖链结构，并排除戊糖、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖-辛-2-酮糖酸（KDO）或糖醛酸单糖。六次独立制备获得的线粒体蛋白浓度无显著差异，表明具有高度可重复性。Western blot 分析显示，CoxIV 仅在线粒体组分中表达，而 GAPDH 仅在胞质组分中表达，证实了线粒体分离的纯度以及无非线粒体污染。使用 IR-MALDESI 在线粒体提取物中检测到独特的唾液酸化、磷酸化和硫酸化 N-糖链结构。通过高拟合优度的 R² 值验证，确认检测到含一个和两个氯加合物的 N-连接糖链，进一步证明了 IR-MALDESI 可用于检测这些糖链组成。