Name: 基于双抗体夹心检测技术的幽 门螺杆 菌感染粪便抗原快速检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 33 s
Description: 了解双抗体夹心检测技术用于幽门螺杆菌粪便抗原快速诊断的方法。该技术具有高灵敏度和特异性，可提升临床诊断效率并改善患者治疗效果。

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本横断面研究已获得广东省人民医院伦理委员会批准（批准号：KY2024-445-01），研究过程中所有受试者的个人信息均严格保密。所有参与者在实验前均签署了书面知情同意书。研究对象为2024年广东省清远市石潭村的常住居民，年龄和性别不限。下述双抗体夹心法（定性实验）由专业医学技术人员严格按照说明书操作。本研究纳入该村全部常住人口，无论其健康状况、是否存在胃肠道相关症状或已知胃肠道疾病。
1. 患者选择
<ol>
	<li>若患者在近1个月内使用过质子泵抑制剂、铋剂、H2受体阻滞剂或抗生素，则予以排除。</li>
	<li>要求所有参与者匿名填写问卷。问卷内容包括五个问题：您是否规律进食三餐？您是否饮酒？您是否知晓H. pylori？您是否认为有必要进行H. pylori检测？您是否了解H. pylori感染的不良后果？</li>
</ol>
2. 粪便中幽门螺杆菌（H. pylori）感染抗原检测的操作步骤
注意：幽门螺杆菌（H. pylori）粪便抗原检测的算法设计旨在确保结果的准确性和可靠性，同时兼顾操作的简便性与卫生性。整个流程分为五个步骤：样本采集、样本处理、样本保存、检测和结果判读。样本检测的工作流程图和示意图见图1和图2。
<ol>
	<li>样本采集 
	注意：H. pylori 抗原特异性容器应用于样本采集。样本不得与水、尿液、消毒剂和污水混合。
	<ol>
		<li>排便完成后，取下专用容器的顶盖，取出采样棒。</li>
		<li>将采样棒连续插入粪便的五个不同位置进行采样，确保采样棒的螺纹端完全插入粪便中。</li>
		<li>采样完成后，将采样棒重新插入试剂管中；总采样量约为 5–50 mg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本处理
	<ol>
		<li>将试剂管左右摇动约 10 秒，使粪便样本在稀释液中充分混匀（主要成分：乙二胺四乙酸四钠水合物 0.018 g/mL 和氯化钠 0.01 g/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本储存
	<ol>
		<li>采样后应尽快进行检测；如需延后，可在室温下保存不超过 6 小时，或在冷藏条件下（2–8 °C 下不超过 72 小时）以及冷冻条件下（-25 °C 至 -15 °C 下不超过 6 个月）保存，以减缓抗原降解和微生物活性。 
		注意：样本可反复冻融最多 3 次，冷藏或冷冻样本在检测前均应恢复至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本检测
	<ol>
		<li>打开试剂管盖上的白色盖帽，并保持试剂管直立。</li>
		<li>将盖子压到底部，使样本流入检测卡，流经包被有鼠抗 Hp 抗体的检测区（T）和质控区（C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果判读
	<ol>
		<li>等待 10–20 分钟，使样本中任何存在的 H. pylori 抗原若与抗体结合，则在检测区形成肉眼可见的显色反应。通常表现为一条红色或紫色的条带，与质控区的条带形成对比。</li>
		<li>显色反应的有无及颜色深浅与样本中 H. pylori 抗原浓度相关。通过比对比色卡可快速准确地判读结果（见 图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DNA 提取
<ol>
	<li>取适量粪便样本放入离心管中，加入PBS溶液，充分振荡混匀。在12,000 × g 条件下离心5–10分钟，然后小心吸取200 µL上清液用于后续提取。</li>
	<li>根据样本数量，准备相应数量的1.5 mL离心管。向每管中依次加入20 µL蛋白酶K（20 mg/mL）、10 µL磁珠、200 µL样本上清液和200 µL裂解缓冲液A。通过反复倒置混匀，然后在55 °C金属浴中孵育10分钟。</li>
	<li>裂解完成后，将离心管置于磁力架上静置，使磁珠吸附1分钟。待管内液体完全澄清后，弃去上清液，并尽量避免扰动磁珠。</li>
	<li>将离心管从磁力架上取下，放置于1.5 mL离心管架上。使用移液器向每管中加入500 µL洗涤缓冲液E，充分混匀1分钟，然后将离心管放回磁力架。静置1分钟，待溶液澄清后弃去上清液，注意避免吸走磁珠。</li>
	<li>向每管中加入500 µL洗涤缓冲液W2，重复洗涤步骤。充分混匀1分钟，将离心管置于磁力架上静置1分钟。溶液澄清后小心弃去上清液，确保磁珠不被扰动。</li>
	<li>向每管中加入100 µL洗脱液，混匀后在55 °C孵育5分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上静置2分钟。待溶液澄清后，小心将洗脱的核酸转移至新的离心管中，避免吸入磁珠。</li>
	<li>通过测定260 nm（A260）和280 nm（A280）处的吸光度评估提取DNA的纯度。计算A260/A280比值，高纯度DNA的理想比值应大于1.8。</li>
</ol>
4. 用于检测幽门螺杆菌（H. pylori）及其抗生素耐药性的qPCR
注意：&#160;我们通过扩增 ureA 基因进行 qPCR 检测以确定 H. pylori 感染。所有阴性质控品均为无菌的纯化水。H. pylori 核酸检测试剂盒中的阳性对照品为灭活的 H. pylori 标准微球（ATCC 43504）。CT&#160; ≤ 30 且具有典型 S 形扩增曲线的结果判为阳性。
<ol>
	<li>根据待检测样本的数量，从试剂盒中取出H. pylori冻干品，并快速离心，使冻干粉沉于管底。</li>
	<li>小心打开冻干品管盖；取待测样本的核酸；向冻干品中加入25 µL样本核酸，并盖紧管盖。</li>
	<li>将PCR试剂轻轻振荡混匀8–10秒，然后快速离心3–5秒。</li>
	<li>针对32孔板上的每份样本，配制25 µL PCR反应体系（含冻干粉[内含Taq酶（5 U/µL）、脱氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L）、UNG酶（2 U/µL）、ureA基因上游引物（5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3'）和下游引物（5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3'）（40 µmol/L）]）以及25 µL（2.5 µg）提取的DNA。</li>
	<li>将32孔板qPCR板放入qPCR仪中运行。设置扩增程序：42 °C和95 °C（各1个循环），每个温度保持2分钟；95 °C 10秒、65 °C 45秒（两步为1个循环），重复10次；95 °C 10秒、58 °C 45秒（两步为1个循环），共35个循环。</li>
	<li>使用qPCR专用软件分析数据，并由仪器自动设定基线阈值。</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>采用卡方检验分析实验数据，评估本方法与qPCR结果之间的一致性，并将该技术筛查的阳性率与更广泛范围（例如全国范围）的H. pylori感染阳性率数据进行比较。当P &#60; 0.05时，认为差异具有统计学意义。</li>
</ol>

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<li>Megraud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+in+Europe+in+2018+and+its+relationship+to+antibiotic+consumption+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe in 2018 and its relationship to antibiotic consumption in the community.</a> Gut. 70 (10), 1815-1822 (2021).</li>
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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

H. pylori 是全球范围内最常见的细菌感染之一15。问卷调查结果显示，55.2%的人群对H. pylori缺乏认知，而90.8%的人认为H. pylori筛查是必要的。这些发现凸显了在经济欠发达和偏远地区推行H. pylori筛查项目的重要性16。尽管尿素呼气试验（UBT）是一种常用的诊断方法，但其高昂的成本以及对儿童和孕妇的不适用性限制了其广泛应用17,18。血清H. pylori抗体检测可检测患者血清中的抗体19。然而，由于抗体在细菌被清除后仍可长期存在，该检测不适用于治疗后的评估20。相比之下，粪便抗原检测是一种无创方法，无需进入胃腔，仅需采集粪便样本即可进行分析。该方法显著减轻了患者的不适感和潜在风险，更便于筛查和随访。此外，其无...

幽门螺杆菌（H. pylori，Hp）是一种微需氧、螺旋状、革兰氏阴性细菌1。由于其能够在人体胃部定植并引起慢性感染2，该病原体已被确认为胃腺癌发生的主要病因之一3,4。2015年，全球约有44亿人感染H. pylori5。H. pylori感染的流行率存在显著的地理差异，发展中国家的感染率明显高于发达国家。值得注意的是，在低收入国家以及某些脆弱人群中，感染率可高达75%6。
尽管胃镜等传统检测方法具有较高的准确性，但由于其具有侵入性、成本较高且患者接受度低，限制了其在大规模筛查和常规随访中的应用7。因此，寻找非侵入性、简便且快速的诊断方法已成为现代临床医学研究的重要方向。H. pylori 非侵入性诊断的主要目的是在无需内镜检查的情况下，准确、安全、便捷地检测患者是否感染 H. pylori。尿素呼气试验（UBT）、H. pylori 粪便抗原检测（FAT）8 和血清学检测9 是目前常用的非侵入性技术。
在这些方法中，尿素呼气试验（UBT）是目前可采用的侵入性最小且最准确的检测方法10。UBT 的灵敏度和特异性均高于 95%11。在现有的非侵入性诊断方法中，UBT 已被证明是最准确且最可靠的。例如，在伊拉克进行的一项验证研究显示，由于其相较于其他方法具有更高的检测性能，UBT 可被推荐作为首选方法12。然而，UBT 也存在一些缺点，例如成本较高且需要质谱分析，这限制了其在偏远或资源有限地区的应用13。
快速、无创且经济高效的幽门螺杆菌（H. pylori）感染检测方法的开发至关重要，尤其在资源有限的地区。本研究基于双抗体夹心检测技术，建立了一种针对H. pylori粪便抗原的快速检测方法，可对粪便样本中的H. pylori抗原进行快速、有效且低成本的检测。该技术具有成本低、无创、操作简便以及适用于偏远地区等显著优势。我们假设，采用双抗体夹心法检测H. pylori粪便抗原的灵敏度和特异性可与qPCR相媲美，有望成为一种可行的无创临床诊断工具。
我们全面阐述了粪便抗原检测H. pylori感染的原理、操作流程、方法学优势及其临床适用性。为验证其实际应用价值，我们在广东省清远市石潭村开展了一项流行病学调查与筛查工作。该村庄地处偏远、经济欠发达，常住人口约400人，教育水平有限。研究结果表明，本研究所设计的粪便中H. pylori抗原快速检测技术可在20分钟内完成。值得注意的是，粪便中H. pylori抗原的快速检测有望成为在偏远落后地区快速、可靠诊断H. pylori感染的一种潜在且具有前景的工具。

<table><tbody><tr><td>DNA提取试剂盒</td><td>Jiangsu mole biotechnology co., ltd</td><td>20230223</td><td>无</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori&lt;/em&gt;粪便抗原检测试剂盒</td><td>杭州诺辉健康科技有限公司</td><td>20213401126</td><td>无</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori &lt;/em&gt;核酸检测试剂盒</td><td>Jiangsu mole biotechnology co., ltd</td><td>20230226</td><td>无</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR</td><td>上海宏石医疗科技有限公司</td><td>20183221659</td><td>无</td></tr><tr><td>统计产品与服务解决方案</td><td>IBM公司</td><td>无</td><td>无</td></tr></tbody></table>

粪便抗原的快速检测 幽门螺杆菌 基于双抗体夹心检测技术的感染检测

Rapid Detection of Fecal Antigen of Helicobacter pylori Infection Based on Double Antibody Sandwich Detection Technology

Helicobacter pylori 可寄生于胃黏膜，感染后可引发一系列胃肠道疾病，与胃炎、胃溃疡及胃癌密切相关。在医疗基础设施薄弱和卫生条件不足的地区，H. pylori 感染的高发病率仍是重要的公共卫生问题。因此，在资源有限的环境中，开发快速、简便且经济高效的 H. pylori 检测筛查方法至关重要。
本研究在广东省石潭村开展了一项基于社区的筛查工作。石潭村地处偏远、经济欠发达，常住人口约300人，居民整体教育水平较低。我们采用双抗体夹心法检测 H. pylori 粪便抗原检测，该方法因其在资源有限环境中的潜在适用性而被选用。共招募了来自该村庄的261名参与者，并使用该技术分析了他们的粪便样本。为了进行比较验证，对同一批样本进行了定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。与qPCR结果相比，该检测方法在识别目标物时的敏感性和特异性分别为 H. pylori 粪便中抗原的检出率分别为60.24%和80.08%。结果表明，粪便抗原检测方法与qPCR之间具有高度一致性（Kappa = 0.630。 本研究系统阐明了粪便抗原检测的原理、流程、方法学及临床应用 H. pylori 感染，旨在探索基于乳胶的双抗体夹心技术，并建立其辅助诊断的新策略与实用指南。

问卷调查 
本研究共纳入261名参与者，包括144名女性和117名男性，年龄范围为4至99岁，平均年龄为48.30 ± 17.61岁。其中未成年人（0-17岁）17人，成年人（18-64岁）202人，老年人（>64岁）42人。问卷调查结果见表1。大多数参与者（90.8%）认为有必要开展H. pylori筛查。
本村粪便H. pylori抗原检测筛查结果 
在接受粪便H. pylori抗原检测的261名参与者中，52人（19.92%）结果为阳性，209人为阴性。在52例阳性病例中，女性32人，占所有女性参与者的22.22%；男性20人，占所有男性参与者的17.09%。按年龄分层分析，阳性率分别为：未成年人（0–17岁）2例阳性（11.76%），成年人（18–64岁）41例阳性（20.30%），老年人（>64岁）9例阳性（21.43%）。
<p ...

本研究建立了一种基于双抗体的夹心检测法，用于快速检测感染幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的粪便抗原。

幽门螺杆菌可寄生于胃黏膜，感染后可引发一系列胃肠道疾病，且与……密切相关

我们的研究范围是幽门螺杆菌的检测技术。我们要回答的问题是幽门螺杆菌粪便抗原检测非常简单的程序方法和临床应用。促进该领域发展的新兴技术，如实时荧光定量PCR、CRISPR-Cas检测、生物传感器和纳米技术等。该技术具有无创、成本低、作方便等优点。我们方案的优点是适合落后和欠发达地区的筛查。快速检测粪便中的幽门螺杆菌抗原是快速可靠地诊断偏远和死水地区幽门螺杆菌感染的一种潜在且有前途的工具。[旁白]在测试之前，将冷藏和冷冻样品置于室温。将试管放在测试台上。取出粪便样本采集容器并取回采样棒。将采样杆插入凳子的五个不同区域，确保螺纹端完全浸没在每个位置。采样完成后，将采样棒插回试剂管中，确保收集的总样品量约为 5 至 50 毫克。左右摇晃试剂管约 10 秒钟，使粪便样品在稀释剂中充分混合。打开试剂管上的白色盖子，将试剂管直立。完全按下盖子，将样品释放到测试卡上。让样品流过标记为T的检测区域和标记为C的质量控制区域，这两个区域都涂有小鼠抗幽门螺杆菌抗体。如果存在抗原，请等待 10 至 20 分钟，以便在检测区域形成显色反应。观察测试和控制区域中是否存在彩色线条。将结果与色卡进行比较，以确定幽门螺杆菌抗原的浓度。实验结束后，将样品在2至8摄氏度下储存长达72小时。261例受试者粪便幽门螺杆菌抗原结果中，阳性52例，阴性209例。261例受试者粪便qPCR结果中，83例阳性，178例阴性。石滩村阳性率为19.92%，略低于全国阳性率42.8%。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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完整的I类HLA/肽复合物由癌细胞释放，可能成为一种重要的癌症生物标志物。利用无标记传感器技术和模拟T细胞受体的单克隆抗体，本研究展示了在MDA-MB-231细胞上清液、添加了目标物的人血清以及患者血浆中检测释放的MIF/HLA-A*02:01复合物的方法，从而为开发一种新型癌症诊断平台提供了可能。...

利用无标记生物传感器技术检测乳腺癌中的人类白细胞抗原生物标志物

我们介绍一种快速的基于分子检测的甲型与乙型流感病毒检测方法。该流感检测方法采用针对流感病毒特异性引物的等温扩增技术，结合分子信标探针进行靶标检测，可在15分钟内分别检测出甲型和乙型流感病毒。该甲型与乙型流感病毒检测方法操作简便，实验人员所需操作时间极少。...

快速分子检测与区分甲型和乙型流感病毒

本文介绍一种简单、快速且高效的朊病毒扩增技术——实时震动诱导转化（RT-QuIC）方法的操作流程。...

粪便样本中慢性消耗性疾病朊病毒的实时震动诱导转化检测法

了解双抗体夹心检测技术用于幽门螺杆菌粪便抗原快速诊断的方法。该技术具有高灵敏度和特异性，可提升临床诊断效率并改善患者治疗效果。

粪便抗原的快速检测幽门螺杆菌基于双抗体夹心检测技术的感染检测

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